一、人的睾丸组织硫氧还蛋白cDNA的克隆及序列测定（论文文献综述）
阮崇美[1]（2017）在《不同发育期白牦牛睾丸蛋白质组学分析及生殖相关候选基因HSP60生物学研究》文中提出天祝白牦牛（Bos grunniens）是我国特有的牦牛品种,是当地牧民主要的生产生活资料,但由于该品种原始,繁殖力低下,自然繁育为2年1胎或3年2胎,严重制约着白牦牛的生产能力。睾丸作为主要的生殖器官,影响着雄性动物的繁殖性能,其主要功能是分泌激素、产生精子等,这些生理过程需要多种蛋白质精确表达和调控。因此,以天祝白牦牛睾丸为材料,研究不同发育阶段睾丸中的差异表达蛋白质将为解释白牦牛睾丸发育和精子发生的分子机制提供参考,对提高白牦牛繁殖性能提供理论依据。本试验以1岁,2岁,4岁和8岁天祝白牦牛睾丸为实验材料,利用二维电泳和MALDI-TOF-TOF质谱技术鉴定不同发育时期差异表达蛋白质,分析这些差异表达蛋白质的功能及参与生物学过程或代谢途径。对筛选出的生殖候选基因热休克蛋白60（HSP60）进行分子克隆及在下丘脑-垂体-睾丸轴表达定位研究,进一步分析了HSP60对白牦牛睾丸支持细胞增殖的影响。本研究取得的主要结果如下:1、构建了白牦牛睾丸蛋白质表达图谱,经PDQuest 8.0.1分析发现白牦牛睾丸约有437个蛋白质点。比较了不同发育阶段差异蛋白质表达,结果显示在4个年龄阶段共有29个差异（p≤0.01）表达倍数在1.5倍以上的蛋白质点。其中,2种蛋白质随年龄上调,5种蛋白质随年龄下调,3种蛋白质在4岁前上调并随后下调,15种蛋白质在2岁前上调而后下调,4种蛋白质随年龄波动。2、对鉴定出的差异蛋白进行GO功能注释,这些蛋白质主要参与了“细胞过程、单有机体过程和新陈代谢过程”、“细胞、细胞器组成和胞外域”及“结合和催化活性”。亚细胞定位分析表明,鉴定蛋白主要位于细胞骨架（8个蛋白质）,细胞核（6个蛋白质）,线粒体（3个蛋白质）和细胞外基质（2个蛋白质）。3、选择2-DE检测的2个差异表达蛋白质（钙结合蛋白、热休克蛋白60）进行免疫印迹分析,结果显示所选蛋白的表达变化模式与2-DE结果基本一致,表明2-DE分析所得蛋白质差异表达结果可靠。4、对筛选出的差异蛋白HSP60进行分子克隆,发现白牦牛HSP60基因c DNA全长为2300bp,开放阅读框为1722bp,编码572个氨基酸。其理论分子量为60.977k Da、等电点为5.69,HSP60编码蛋白为非跨膜可溶性蛋白。氨基酸序列比对结果显示,白牦牛HSP60基因编码氨基酸序列与黄牛、瘤牛、绵羊、藏羚羊、骆驼、白犀牛、兔和黑猩猩的氨基酸序列同源性分别为100%、99%、99%、99%、99%、99%、98%和98%,说明HSP60在物种间高度保守。5、对HSP60表达及定位分析研究发现,HSP60基因及蛋白在白牦牛的下丘脑、垂体及睾丸组织中均有表达,其中下丘脑及垂体组织表达量高,睾丸组织表达量最低。免疫组化结果显示,HSP60蛋白表达于白牦牛下丘脑组织的室旁核大细胞,室旁核小细胞和神经角演网,垂体组织的腺细胞,睾丸组织的精原细胞,精母细胞,支持细胞和间质细胞,其中精子细胞中表达较弱。推断HSP60参与雄性白牦牛生殖轴调控,并参与睾丸发育与精子发生。6、进一步研究HSP60对原代培养的白牦牛睾丸支持细胞增殖的影响,通过构建HSP60过表达载体p IRES2-EGFP-HSP60,合成靶向si RNA沉默HSP60,瞬时转染支持细胞后,经RT-q PCR检测发现过表达组HSP60 m RNA在24、48和72h各时间点均上调,沉默组HSP60 m RNA在24、48和72h各时间点均下调。四氮唑盐法（MTS）检测细胞的增殖情况,过表达HSP60组,支持细胞增殖率各时间点均显着高于对照组。沉默HSP60组,支持细胞的增值率各时间点均低于对照组,但差异不显着。RT-q PCR检测细胞增殖标志基因细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和增殖细胞核抗原（PCNA）,发现过表达HSP60组Cyclin D1基因在48h时的表达显着高于对照组,PCNA基因的表达在24、48和72h时均显着高于对照组。沉默HSP60组Cyclin D1基因和PCNA基因的表达在24、48和72h时均低于对照组,但差异不显着。表明HSP60在白牦牛睾丸支持细胞增殖调控中的作用是正向调控。本研究通过差异蛋白质组学技术检测不同发育阶段睾丸蛋白质表达差异变化,筛选出HSP60与生殖相关,并对HSP60基因进行分子克隆及表达定位研究,原核表达系统诱导表达出融合蛋白His-HSP60,同时,对HSP60在睾丸支持细胞的增殖调控过程进行了初步研究,结果表明HSP60在白牦牛性机能的旺盛期是通过下丘脑-垂体-性腺轴来调控睾丸支持细胞增殖,进而影响睾丸发育,本实验为进一步研究雄性白牦牛精子发生提供了基础资料。
高彦茹[2]（2017）在《日本血吸虫腺苷酸激酶1基因功能分析与鉴定》文中研究说明目的:日本血吸虫病是一种危害严重的人畜共患寄生虫病。研究显示,宿主因子影响血吸虫的生长发育。本文研究宿主因子作用下呈差异表达的日本血吸虫腺苷酸激酶1（SjAK1）的基因功能。方法:通过分子生物学技术,克隆表达SjAK1基因,检测重组SjAK1蛋白的免疫保护效果及机制,利用免疫组织化学技术对SjAK1进行组织学定位,运用实时定量PCR技术及Western blot鉴定该基因在日本血吸虫不同发育时期虫体的表达水平,并利用RNAi技术检测SjAK1基因在童虫生长发育及虫卵形成过程中的功能及作用机制。结果:1.本研究成功构建重组表达质粒pET28a（+）-SjAK1。通过原核系统表达获得可溶的重组SjAK1（rSjAK1）,分子量大小约为26kDa,与理论分子量一致。经镍离子亲和层析柱纯化获得高纯度rSjAK1目的蛋白,检测纯化后rSjAK1的比酶活为135.2 U/mg。重组蛋白免疫新西兰雄兔制备anti-rSjAK1多克隆抗血清,ELISA检测血清抗体滴度达1:25600。2.免疫组化结果显示SjAK1主要定位于童虫期体被与部分实质细胞、雌虫卵黄腺与体被、虫卵卵壳及雄虫部分实质细胞。荧光定量PCR及Western blot结果显示SjAK1在日本血吸虫虫卵及21 d肝期童虫中表达水平最高,在肺期童虫中表达水平最低。3.免疫保护研究结果显示,在小鼠中可获得50%的减虫率与40%减卵率,单卵肝肉芽肿平均面积比对照组小鼠减小56%。ELISA结果显示rSjAK可能是通过诱导IFN-γ和IL-2（Th1细胞因子）表达来实现免疫保护的效果。4.dsRNA体表渗透法干扰体外培养童虫,SjAK1 dsRNA最佳干扰浓度为2×10-5 mg/ml,最佳干扰时间为6d。SjAK1干扰组童虫体长体宽体积面积与对照组童虫无显着差异;扫描电镜（SEM）下,与对照组及EFGP组对比,SjAK1干扰组童虫感觉乳突退化;透射电镜（TEM）下,SjAK1干扰组童虫体被有断裂,体被厚度均值为1.25±0.25 μm,显着小于对照组;Tunel结果显示,SjAK1干扰组童虫细胞凋亡显着增加。5.dsRNA体表渗透法干扰合抱成虫,最佳干扰浓度为4×10-5mg/ml,最佳干扰时间为5d。SjAK1基因被沉默后,雌虫产卵数目显着少于对照组,减少率为35%,异常虫卵比率为46%。扫描电镜下,干扰组雌、雄虫体表结构与对照组比较未见明显变化。透射电镜下,SjAK1干扰组雌虫的卵黄细胞中,卵黄滴中卵黄球较少,发生融合,部分卵黄细胞出现肿胀;雌虫卵巢组织中的未发育成熟卵细胞比例较高,部分卵细胞出现肿胀、降解,且卵细胞周围的皮质颗粒较少。Tunel结果显示SjAK1干扰组卵巢、卵黄腺、及睾丸等组织中细胞凋亡比率均显着增加。实时荧光定量检测雌虫产卵前后卵黄腺SjAK1表达水平变化发现SjAK1表达水平在24 d排卵日达到最高峰,排卵后急剧下降,在28 d有所回升。SjAK1在35 d未成熟虫卵及42 d成熟虫卵中表达水平相当,无显着差异。结论:通过对SjAK1基因的定量及定位分析、免疫保护性效果检测及RNA干扰后对童虫生长发育及虫卵形成的影响发现,重组SjAK1蛋白可诱导Th1型细胞因子介导的免疫保护反应,减虫率与减卵率分别达50%和40%。SjAK1基因被抑制后影响了日本血吸虫童虫体被的发育,同时影响了卵黄细胞和卵母细胞的发育。揭示了SjAK1基因在日本血吸虫生长发育及其在虫卵形成中的作用,为阐明血吸虫生长发育机制奠定基础,具有重要的理论与实际意义。
岳敏[3]（2014）在《西藏小型猪生长相关基因的研究》文中进行了进一步梳理动物的生长是一个复杂的生理过程,受到体内外多种因素的影响。包括动物的品种及性别、营养水平、生活环境、母体效应等。多种因素最终通过神经内分泌的整合、调控而发挥作用,其中调控关键的是由生长激素释放激素-生长激素-胰岛素样生长因子构成的神经内分泌生长轴。神经内分泌生长轴主要包括生长激素释放激素、生长抑素、生长激素、胰岛素样生长因子以及这些激素的受体、结合蛋白。哺乳动物在体内外各种因素的刺激下,下丘脑开始分泌生长激素释放激素,同时也释放生长抑素,生长激素的分泌受到生长激素释放激素和生长抑素的双重控制,即生长激素释放激素刺激生长激素的分泌,而生长抑素抑制生长激素的分泌。生长激素分泌后与生长激素结合蛋白结合经血液循环运输到体内各组织器官,与靶器官上的生长激素受体结合,启动细胞内的信号转导机制,促进胰岛素样生长因子-1的表达。胰岛素样生长因子-1主要由肝脏合成后释放到血液中,再与胰岛素样生长因子结合蛋白结合运输至动物体内的多种组织,促进蛋白质的合成,促进细胞增殖,从而促进哺乳动物以骨骼肌为主的生长。生长激素还作用于肝外组织,使之分泌胰岛素样生长因子,发挥自分泌或旁分泌作用。生长激素在胰岛素样生长因子-1的介导下发挥其促生长作用,一定范围内肝脏中的胰岛素样生长因子-1的分泌随血液中生长激素含量的升高而升高;当血液中的胰岛素样生长因子-1含量超过一定浓度,则会反馈抑制垂体中生长激素的表达,促进下丘脑中生长抑素的分泌,在下丘脑和垂体双重水平上抑制生长激素的合成与分泌。小型猪在分类学上与普通家猪相同,同属于哺乳纲,偶蹄目,不反刍目,野猪科,猪属动物。由于猪和人体在解剖、生理学方面很相似,1700年英国人JohnAuther就曾提出可用猪作为人的循环系统等研究的模型。但家猪体型过大（有些品种成年体重在400kg以上）,使用起来非常不方便。早在二十世纪50年代美国就开始选育适于实验用的小型猪。育成的小型猪在解剖结构、生理学方面和家猪相同,但体型较小,便于科学实验。目前小型猪在生物医学等领域中亦得到了广泛的应用。尤其是在心血管系统疾病、消化系统疾病、内分泌系统疾病、皮肤疾病的研究方面,以及异种器官移植、医疗器械的检测、药物动态代谢的方面,小型猪都是很有利用价值的实验动物。猪齿的牙质和齿像的构造也和人相似,可用于牙科医学实验。我国具有独特而又丰富的小型猪资源,它们在原产地均为长期近亲交配形成的封闭群体,具有体型小、遗传稳定等特点,与国外的多品种杂交小型猪相比,具有明显的优势。以特有小型猪资源为基础,进行封闭繁育,不仅保存了珍贵的品种资源,而且使品种遗传及表型特征更加稳定,更加符合生命科学研究的要求,达到了保种与选育的双重目的。这是我国具有独特的小型猪资源所带来的无可比拟的优势。我国的小型猪品种有:西藏小型猪、五指山小型猪、版纳微型猪、贵州小香猪、广西巴马小型猪和滇南小耳猪等。其中五指山小型猪、版纳小型猪和广西巴马小型猪的生长相关基因已经有人进行了研究,西藏小型猪与生长相关的基因研究较少。西藏小型猪,来源于青藏高原、海拔2500-4300米的农区和半农牧区,是唯一能够适应高海拔气候和以放牧为主的猪种,封闭的地理环境使西藏小型猪保存了非常纯正的品种资源。本课题组于2004年将西藏小型猪从西藏引进至广州,目前已完成风土驯化及实验动物化研究,并开展了相关动物模型、药物实验及转基因克隆等研究。从免疫学、遗传学研究发现,该品系具有独特的免疫相关指标和遗传特征,加上其独特的外形,是一种优良的实验用小型猪品种。西藏小型猪成年体重仅有25-40kg,是正常肉用猪体重的15-20%。本实验就是对西藏小型猪的生长相关性基因GH、GHR、IGF-1基因进行了系统的研究,为西藏小型猪的小体型提供分子理论和实验依据,为进一步“微型化”群体的培育打下基础。本论文研究中:（1）采用了 PCR产物测序的方法进行GH、GHR基因的分型及SNP位点的寻找,并进行不同基因型的部分生长性状比较分析。结果显示:GH基因在检测区域中发现有5个突变位点,分别为A12G、T45C、G84A、G93A、C133T。而GHR基因在检测区域则未发现突变位点。GH基因,T45C突变位点上TC基因型的西藏小型猪的6-8月龄的腹围值较小,G84A突变位点上AA型的西藏小型猪的3-5月龄的体重、体长值较小,G93A突变位点上GG基因型的西藏小型猪的6-8月龄的体长、体高值较小。我们推测在GH基因T45C、G84A、G93A位点突变的TC、AA、GG基因型可能与体型较小有关。（2）克隆得到了西藏小型猪GHR、IGF-1基因的cDNA序列。结果发现:西藏小型猪GHR基因的片段长1912bp,包含编码区1721bp,该编码区编码了572个氨基酸,与版纳微型猪（JF276446.1）、五指山小型猪（DQ422962.1）的GHR基因高度同源达99%。将西藏小型猪GHR基因的编码区与GenBank中搜索到猪的GHR基因（NM214254.2）的cDNA序列进行比对分析发现,在1225pb处发生了T→G的突变,该位点的突变引起相应编码氨基酸的变化,由丝氨酸变成了丙氨酸;与五指山猪GHR基因的cDNA序列进行比对分析发现,在1248bp、1287bp处分别发生了G→A的突变,但该位点的突变并未引起相应编码氨基酸的改变;与版纳微型猪相比,在1656bp处发生了T→C的突变,该位点的突变也未引起相应编码氨基酸的变化。所获得的西藏小型猪IGF-1基因的片段包含编码区567bp,该编码区编码了186个氨基酸,与猪（NM214256.1）的IGF-1基因高度同源达99%。将西藏小型猪IGF-1基因的编码区与GenBank中搜索到猪的IGF-1基因的cDNA序列进行比对分析发现,在440bp、455pb处发生了G→A、C→T的突变,该位点的突变引起相应编码氨基酸的变化,分别由组氨酸变成了精氨酸、亮氨酸转变成了丝氨酸。具体该位点的突变是否导致蛋白质功能的改变有待于进一步研究。（3）通过实时的荧光定量PCR技术,对西藏小型猪0岁（1日龄）、0.1岁（36日龄）、0.25岁（90日龄）、0.5岁（180日龄）、1岁（360日龄）、2岁（720日龄）、3岁（1080日龄）的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、皮肤组织的GH、GHR和IGF-1基因进行相对表达量的测定分析,从而明确GH、GHR和IGF-1基因在西藏小型猪不同年龄阶段和不同脏器中的表达情况。结果显示:在不同脏器的表达中,GH基因在0岁、0.25岁、0.5岁、1岁表达量最低都是肌肉,在0岁、0.5岁时在皮肤中的表达量最高,在0.25岁、1岁时在肺组织中表达量最高,在0.1岁、3岁时表达量最高的是肝脏。GHR基因在0.25、0.5、1、2、3岁的肌肉组织中表达量最低,在0、0.1岁时心脏组织的表达量最低,在1、2岁时表达量最高的是肺,在0、0.25岁的肾脏组织中表达量最高。IGF-1基因在0、0.25、0.5、1、2岁时肌肉组织的表达量最低,在0、0.25、0.5岁时皮肤组织中表达量最高,在0.1、2、3岁时肝脏组织的表达量最高。在不同年龄阶段的表达中,GH和GHR基因在0.1岁时达到峰值,而IGF-1基因在0.25岁时达到峰值。所以西藏小型猪的生长相关基因的表达呈现出明显的时空特异性。（4）构建了西藏小型猪GHR基因的真核表达载体GHR-pIRES2-EGFP转染到西藏小型猪胚胎成纤维细胞中,采用相对定量RT-PCR方法检测IGF-1基因的表达,结果发现:转染了西藏小型猪生长激素受体的西藏小型猪的胚胎成纤维细胞内的胰岛素样生长因子-1出现了表达上调的现象。
刘晓妮,胡宝庆,文春根,陶志英,刘大伟[4]（2013）在《褶纹冠蚌硫氧还蛋白基因克隆及空间结构分析》文中研究表明运用RACE-PCR方法从褶纹冠蚌血细胞中克隆出硫氧还蛋白（Trx）的cDNA。结果表明褶纹冠蚌TrxcDNA序列全长为1 169bp,其中5′非编码区（UTR）长11bp,3′非编码区长840bp,含有PolyA尾和典型的腺苷酸信号序列AATAAA,开放阅读框长度为318bp,编码105个氨基酸。预测蛋白质分子量为11.6kDa,等电点为5.38,未发现有信号肽。氨基酸序列中含有1个Thioredoxin结构域（T3-K104）,区域内包含一个保守的CGPC活化位点。序列同源性比较结果显示褶纹冠蚌Trx与太平洋牡蛎和紫贻贝的氨基酸序列一致性分别为56%、52%。预测的Trx空间结构由5个β折叠和4个α-螺旋组成,α-螺旋包围β折叠形成紧密的球形,这一结构与人的Trx空间结构相似。
王莹[5]（2012）在《伏马菌素B1和赭曲霉毒素A噬菌体单链抗体库的构建及重组抗体蛋白的原核表达》文中认为真菌毒素（Mycotoxin）是各种真菌产生的一系列有毒次级代谢产物,广泛存在于自然界中,并污染粮食谷物及各种农产品。真菌毒素对人类健康和畜牧业发展已经构成潜在威胁,它不仅降低产品质量,而且可带来严重的食源性中毒问题,引起人或动物的急性、慢性中毒。动物试验表明,摄入被真菌毒素污染的饲料后,就会引起人或动物免疫抑制、组织坏死、肝肾损伤、繁殖障碍、致癌致畸等病理变化,影响人和动物的身体健康。自然界存在的真菌毒素种类繁多、毒性复杂,由于其污染广泛、毒害范围广,在全球食品安全中受到高度关注。为了防止污染真菌毒素的食品及农畜产品直接或间接的进入人类食物链,加强对真菌毒素的检测是十分必要的。近年来,真菌毒素的检测技术快速发展,主要是以高效液相色谱法（HPLC）为主的色谱学检测技术及以酶联免疫吸附法（ELISA）为主的免疫学检测技术。色谱法检测灵敏度高,但样品质量要求较高、前处理操作复杂；而以抗原抗体为基础的免疫学方法,由于其操作简便、快速的优点一直被人们所青睐。现今,专家学者专注于优化和改良ELISA方法,以提高ELISA方法的检测性能。基因工程抗体技术是在充分认识抗体的基因结构和功能的基础上,应用DNA重组技术和蛋白质工程技术发展起来的第三代抗体。基因工程抗体的研究意义在于可以有目的的对抗体基因进行切割、拼接、修饰等一系列操作,获得具有特异功能的改造抗体。与多克隆抗体和单克隆抗体相比,基因工程抗体制备具有时间周期短、操作简便、规模生产成本低廉等优点。单链抗体（ScAb）是基因工程抗体中的一种,它的基因不易丢失,容易保存,作为传统单克隆抗体的改良品,ScAb的具有较好的应用前景,已成为免疫检测技术发展的一个方向。本研究以两种常见的真菌毒素,赭曲霉毒素A（OTA）和伏马菌素Bl（FB1）为对象,应用分子生物学技术及噬菌体展示技术,制备两种真菌毒素的单链抗体,为其免疫学应用与发展奠定基础。试验I伏马菌素B1和赭曲霉毒素A完全抗原的合成与鉴定为了获得FB1和OTA的抗体基因,本试验采用戊二醛一步法将FBl与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）两种载体蛋白偶联,制备FBl完全抗原FB1-BSA和FB1-OVA;同时用碳二亚胺法合成OTA完全抗原OTA-BSA和OTA-OVA。随后,分别采用紫外吸收光谱法（UV）、凝胶电泳法、傅里叶红外光谱法（IR）、基质辅助激光分析电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）四种方法鉴定人工抗原偶联效果并测定偶联比。将FB1-BSA和OTA-BSA分别作为免疫抗原免疫BALB/c小鼠,采用间接酶联免疫吸附法（i-ELISA）, FB1-OVA和OTA-OVA分别作为固相包被抗原,测定小鼠抗血清滴度。结果表明,OTA和FBl完全抗原合成成功。MALDI-TOF-MS测定完全抗原FB1-BSA、FB1-OVA. OTA-BSA和OTA-OVA偶联比分别为10：1、5：1、3：1和9：1。i-ELISA测定经FB1-BSA和OTA-BSA免疫的小鼠血清效价均可达到1：1.024×105。试验制备的完全抗原以及经免疫的小鼠可用于下一步试验。试验Ⅱ伏马菌素B1单链抗体可变区基因克隆与噬茵体抗体蛋白表达提取FB1杂交瘤细胞F3细胞总RNA,反转录合成cDNA第一条链,应用PCR技术分别将FB1鼠源抗体重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL）克隆出来,并经过重叠延伸PCR （SOE-PCR）,通过柔性多肽Linker接头（Gly4Ser）3,按VH-Linker-VL方式拼接成FBl单链抗体可变区基因（ScFv）片段。随后将ScFv基因重组入pCANTAB5E载体中,转化至大肠杆菌（E. coli）宿主菌TGl中,应用噬菌体展示技术,以FB1-OVA为固相包被抗原进行免疫亲和筛选,应用Phage-ELISA和ScFv-ELISA鉴定和筛选阳性噬菌体重组单链抗体。将阳性pCANTAB5E-FB1ScFv质粒转化入表达菌株E. coli HB2151中,经IPTG诱导,获得FB1特异性噬菌体抗体（ScAb）.结果显示,设计鼠源单克隆抗体的重链、轻链可变区基因引物,成功扩增获得FB1鼠源抗体的重链、轻链基因片段,大小为300～400bp。SOE-PCR将VH和VL由Linker拼接成FB1ScFv,大小为700～800bp。随后将ScFv基因重组入pCANTAB5E载体中,转化至E. coli TG1中,经过辅助噬菌体M13K07感染,构建得到的FBl噬菌体重组单链抗体库,抗体滴度约为2.1×1015cfu·mL-1。经过五轮免疫亲和富集和筛选,成功筛选得到5株可分泌FBl特异性噬菌体单链抗体的菌株。核苷酸序列鉴定显示该序列为717bp,编码239个氨基酸。在M13K07辅助噬菌体的辅助下,pCANTAB5E噬菌体质粒可产生含有FBl单链噬菌体基因组的噬菌体颗粒,并以融合的形式表达在噬菌体表面。在E.coli HB2151中,FB1ScFv基因在翻译过程中形成独立的抗体蛋白,以胞周间质形式形成可溶性蛋白。试验Ⅲ赭曲霉毒素A单链抗体可变区基因克隆与噬茵体抗体蛋白表达用OTA-BSA免疫BALB/c小鼠,免疫效价达到要求后,提取小鼠脾总RNA,反转录合成cDNA第一条链,应用PCR技术分别克隆OTA鼠源抗体VH和VL,并经过SOE-PCR,通过柔性多肽Linker接头,按VH-Linker-VL方式拼接成OTA ScFv片段。随后将ScFv基因重组入pCANTAB5E载体中,转化至E. coli TG1中,应用噬菌体展示技术,以OTA-OVA为固相包被抗原进行免疫亲和筛选,应用Phage-ELISA和ScFv-ELISA鉴定和筛选阳性噬菌体重组单链抗体。将阳性pCANTAB5E-OTA ScFv质粒转化入表达菌株E. coli HB2151中,经IPTG诱导,获得OTA特异性ScAb。结果显示,设计鼠源单克隆抗体的重链、轻链可变区基因引物,成功扩增获得OTA鼠源抗体的VH和VL,大小为300～400bp。SOE-PCR将VH和VL由Linker拼接成ScFv,大小为700～800bp。随后将ScFv基因重组入pCANTAB5E载体中,转化至E. coli TG1中,经过辅助噬菌体M13K07感染,构建得到的OTA噬菌体重组单链抗体库,抗体滴度约为2.65×1016cfu·mL-1。经过三轮免疫亲和富集和筛选,成功筛选得到3株可分泌OTA特异性噬菌体单链抗体的菌株。核苷酸序列鉴定显示该序列为738bp,共编码246个氨基酸。在pCANTAB5E噬菌体质粒中,OTA ScFv以胞周间质形式形成可溶性蛋白。试验Ⅳ伏马菌素B1和赭曲霉毒素A单链抗体特性鉴定应用蛋白免疫印迹（WB）和i-ELISA方法分别鉴定OTA与FB1两种真菌毒素ScAb的免疫活性。应用i-ELISA分别测定OTA与FB1ScAb的效价。应用间接竞争酶联免疫吸附试验（ci-ELISA）建立竞争抑制标准曲线。分别测定OTA和FB1ScAb的灵敏度,并测定OTA, FB1ScAb与参试毒素FB2、FB3、AFB1、ZEA和DON交叉反应率,以反映其特异性。结果显示,WB和i-ELISA均显示OTA与FB1ScAb具有良好的免疫活性。FB1-OVA抗原最佳工作浓度为5μg·mL-1, ScAb最佳稀释度为1:1600; OTA-OVA抗原最佳工作浓度为10μg-mL-1, ScAb最佳稀释度为1：800；FB1ScAb抗体滴度达到104; OTA ScAb抗体滴度达到103; ci-ELISA法绘制FB1竞争抑制曲线,FB1浓度为0.31～20μg-mL-1范围内曲线线性关系良好,线性方程为y=-16.663x+117.98（R2=0.9674）, FB1ScAb对FB150%抑制浓度4.08μg·mL-1;同样方法绘制OTA竞争抑制曲线,OTA浓度为0.31～10μgmL-1范围内线性关系良好,线性方程为y=-16.075x+116.84（R2=0.9797）,OTA ScAb对OTA的50%抑制浓度4.16μg·mL-1。FB1ScAb对FB1同种属的FB2、FB3的交叉反应抑制率分别为71.7%和87.6%,而与DON、AFB1、OTA和ZEA交叉反应抑制率较小,说明该FB1ScAb对FB1具有较好的特异性；OTA ScAb对FBi、DON、AFB1和ZEA交叉反应抑制率较小,说明该OTA ScAb对OTA具有较好的特异性。
乌吉斯古冷[6]（2012）在《绒山羊和绵羊Izumo4和Tssk6 cDNA克隆及与其它精卵融合相关蛋白质的作用研究》文中研究表明哺乳动物的精卵结合与融合是一个多步骤并由精子和卵子表面的多种蛋白通过相互作用介导完成的过程。其中精子上的蛋白包括Izumo家族成员Izumo1-4、睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸激酶（TSSK）家族成员Tssk6以及蛋白二硫键异构酶（PDI）家族成员Pdia3（ERp57）等。但目前对于这些蛋白质在精卵结合和融合中的作用机制尚不明确。本实验克隆了绒山羊和绵羊Izumo4和Tssk6的cDNA序列,原核表达并制备了小鼠抗绒山羊Izumo4和Tssk6腹水多克隆抗体,研究了这两种蛋白在睾丸中的表达和在精子上的定位。使用免疫共沉淀和酵母双杂交技术鉴定了Izumo4和TSSK6与Izumo1及PDIA3之间的相互作用。首先根据GenBank中公布的哺乳动物Izumo4和Tssk6序列的保守区设计引物,成功地过克隆了绒山羊和绵羊Izumo4和Tssk6cDNA。克隆到的Izumo4和Tssk6cDNA序列与其它哺乳动物的直系同源基因高度同源,分别包含465bp和822bp的开放阅读框（ORF）,编码154个氨基酸的Izumo4和273个氨基酸的TSSK6,均无跨膜区。把绒山羊Izumo4和Tssk6的编码区插入pET-32a原核表达载体,在大肠杆菌中成功地诱导表达出HIS-Izumo4和HIS-TSSK6融合蛋白。用纯化的融合蛋白免疫昆明（KM）小鼠,制备并纯化了小鼠抗绒山羊Izumo4和TSSK6腹水多克隆抗体,抗体能特异性识别睾丸组织和精子中的Izumo4和TSSK6蛋白质。用自制的抗体在绒山羊睾丸组织切片和顶体反应前后精子涂片进行了免疫化学检测,结果发现Izumo4广泛表达于睾丸组织中,定位于完整精子的顶体中,顶体反应之后消失。TSSK6主要在进入减数分裂之后的精母细胞和圆形精细胞中表达,定位于完整精子的顶体中,顶体反应之后消失。为了探讨蛋白激酶TSSK6与Izumo4以及精卵融合关键分子Izumo1和具有重要影响的PDIA3是否存在相互作用,本实验构建了带HA和HIS标签的真核载体pc-DNA-Izumo1（HA）、Izumo4（HA）、Izumo4（HIS）、Tssk6（HIS）及Pdia3（HA）,分成四组分别共转染人293T细胞系,进行了免疫共沉淀实验。同时构建了酵母双杂交载体pGAD-Izumo1、Izumo4、Tssk6和pGBK-Tssk6、Pdia3同上分成四组,进行了酵母双杂交筛选实验。两个实验结果均提示Izumo1和TSSK6、Izumo4和TSSK6、Izumo4和PDIA3及TSSK6和PDIA3之间存在相互结合作用。
张开岳[7]（2011）在《基于微囊藻毒素处理后鲢鱼肝脏差减文库的构建和分析以及部分基因的克隆》文中指出随着水体富营养化的加剧,有毒蓝藻水华对水环境的危害和生物安全日益引起广泛的关注,蓝藻水华产生的各种藻毒素给人类和水生动物的健康造成巨大的威胁。其中以LR型微囊藻毒素（Microcystin-LR,MC-LR）毒性最强、出现频率最高、造成的危害最大。鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）等食藻鱼类食用大量有毒蓝藻,与哺乳动物相比它们对MC具有更强的抗性,但其去毒分子机理尚未完全阐明。因此开展MC染毒后鲢鱼肝脏组织基因表达的变化以研究其去毒机理具有重要的理论和实际意义。本研究利用抑制差减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）构建了MC-LR处理后鲢鱼肝脏差减cDNA文库,对文库中序列进行了功能注释和分类,初步探明了MC-LR处理后鲢鱼肝脏的基因表达情况,并对筛选到的部分差异表达基因进行了克隆,为从分子水平阐明鲢鱼的解毒机制奠定了基础。本论文主要包括以下几方面内容:1.鲢鱼肝脏MC-LR暴露及不同时间GST表达分析实验组鲢鱼腹腔注射200μg kg-1 body weight （bwt）溶解于0.8% NaCl溶液的MC-LR,对照组鲢鱼注射等体积的0.8% NaCl溶液,并于注射毒素后1 h、3 h、5 h和10 h分别取实验组和对照组肝脏组织用于实验。以β-actin为内参照,应用半定量RT-PCR技术分析MC-LR注射后鲢鱼肝脏不同时期GST mRNA的表达差异。结果表明,MC-LR注射后肝脏GST的表达水平显着降低,其中注射1 h后GST mRNA表达量即有显着下降,说明注射毒素1 h后GST已经参与MC-LR解毒过程,因此本实验选用1 h的实验样本进行差减杂交以筛选该过程中起关键作用的基因。2. MC-LR诱导的鲢鱼肝脏SSH文库的构建及分析利用SSH技术成功构建了MC-LR处理后鲢鱼肝脏差减cDNA文库,并且正、反向差减cDNA文库分别获得2248和1686个重组子。从正、反向差减文库中随机挑选150个阳性克隆（正向文库70个、反向文库80个）进行测序,获得88条ESTs（正向文库48个、反向文库40个）。对这88个序列经GenBank检索比较分析,其中75个（正向文库44个,反向文库31个）为单一基因,其他13个为重复序列。在这75个单一基因ESTs中,有38个片段与GenBank登陆的已知基因有较高的同源性;有11个与GenBank登陆的未知基因有较高的同源性,而其余26条序列尚无同源序列。根据其功能将他们划分为不同的类别,显示与免疫相关、转运蛋白和新陈代谢酶等在MC-LR处理后基因表达发生变化的种类与数量较多,推测他们在微囊藻毒素解毒过程中起到重要作用。3.鲢鱼肝脏差异表达基因的半定量表达分析运用半定量RT-PCR技术对正反向差减文库中各三条ESTs的表达情况进行了分析。通过实验发现他们的表达情况与抑制差减杂交实验的预期结果基本一致,正向文库的三条ESTs:Fs29（尚无同源序列）、Fs59（磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因,PEPCK）和Fs70（尚无同源序列）在MC-LR处理1 h后的表达量均显着升高。反向文库的两条ESTs:Rs15（尚无同源性序列）和Rs161（蛋白质二硫键异构酶A3基因,PDIA3）在MC-LR处理1 h后的表达量均显着降低,仅有Rs2（尚无同源序列）降低但未达到显着。此结果也证明了差减文库的构建是成功的。4.鲢鱼PEPCK和PDIA3基因的克隆及其生物信息学分析采用Rapid amplification of cDNA ends（RACE）方法克隆了两条差异表达基因PEPCK和PDIA3的全长cDNA序列。鲢鱼PEPCK cDNA全长2605 bp,包括101 bp的5’端非翻译区,564 bp的3’端非翻译区,1911 bp的开放阅读框,编码636个氨基酸。序列分析结果显示,鲢鱼PEPCK与翘嘴红鲌的同源性最高,其核酸及氨基酸序列的相似性分别达到97%和99%;其次为斑马鱼,同源性均达到90%以上;与星斑川鲽的同源性最差,但核酸及氨基酸序列的相似性也分别达到77%和84%,说明鱼类PEPCK在长期的进化过程中具有很高的保守性。鲢鱼PEPCK具有与草酰乙酯结合的特有结构域以及与GTP三磷酸链结合的激酶1和激酶2基序。鲢鱼PDIA3 cDNA全长2102 bp,包括206 bp的5’端非翻译区,381 bp的3’端非翻译区,1488 bp的开放阅读框,编码495个氨基酸。序列分析结果显示,鲢鱼PDIA3与斑马鱼的同源性较高,其核酸及氨基酸序列的相似性分别达到86%和92%;与斑点叉尾鮰同源性均较低但核酸及氨基酸序列的相似性也均达到80%以上,说明鱼类PDIA3在长期的进化过程中具有很高的保守性。PDIA3包括4个硫氧还蛋白区域可能在GSH的从头合成及再生时蛋白二硫键的形成中起到作用。
钟金凤[8]（2011）在《家蚕减数分裂阻滞基因及RNA和输出因子结合蛋白基因的研究》文中研究表明果蝇（Drosophila melanogaster）减数分裂阻滞基因Dmaly,是减数分裂G2-M周期和精子形成所必需的。为了探讨家蚕（Bombyx mori） Bmaly在生殖细胞发育过程中的功能,利用GenBank中已公开的Dmaly序列进行Blast搜寻,电子克隆了Bmaly基因的cDNA序列,在此基础上通过RT-PCR克隆了Bmaly的cDNA序列。测序结果显示,Bmaly cDNA序列与预测结果一致,ORF全长1713bp,编码570aa;结构预测结果显示BmAly与它们Aly同系物一样具有DIRP（Domain in Rb-related Pathway）结构域。进化分析结果显示昆虫的Aly聚为一类,但不同昆虫之间的Aly并没有按昆虫所在的目聚类,推测不同昆虫的aly有各自特殊的进化方式;将Bmaly基因克隆进pGS21a（+）载体进行原核表达,重组蛋白免疫小鼠,获得了鼠抗BmAly多抗。免疫荧光实验结果显示,BmAly在细胞质和细胞核中均有分布;qRT-PCR结果显示,Bmaly在精巢中的表达水平比卵巢高,在其它组织中几乎不表达。为了进一步探讨Bmaly基因的功能,3、4龄起蚕注射Bmaly siRNA后,调查精细胞的发育以及对蚕卵受精率的影响。结果显示注射aly657 siRNA后,精细胞发育明显延缓,5龄第1天精细胞的发育大多处于初级精母细胞开始进行第1次减数分裂期,而正常对照精细胞的发育基本已进入第1次减数分裂中后期;注射aly657 siRNA区蚕卵的不受精卵率为22.20%,而正常对照区蚕卵的受精率为1.76%,表明Bmaly基因为减数分裂阻滞基因,抑制该基因的表达可阻滞精细胞的发育。RNA和输出因子结合蛋白（RNA and export factor binding proteins,REF）参与RNA的稳定、加工和输出。本研究参照已公开的家蚕序列（DQ497195.1）,通过RT-PCR克隆了家蚕ref cDNA基因（Bmref）,测序结果显示该基因的开放读码框为765 bp,编码254 aa,BmREF与果蝇、小鼠（Mus musculus）的同源体的氨基酸序列的一致性分别为49.7%和52.7%。结构预测结果显示BmREF具有REF家族的与RNA结合的结构域RRM,N、C端分别且有REF-N和REF-C基序。进化分析结果显示昆虫的REF聚为一类,BmREF与赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、意大利蜜蜂（Apis mellifera）的REF较为接近。将Bmref基因克隆进pGS21a（+）载体进行原核表达,重组蛋白免疫小鼠,获得鼠抗BmREF多抗。免疫荧光实验结果显示,BmREF在细胞质和细胞核中均有分布,但主要分布在细胞核中。芯片数据分析显示Bmref基因在家蚕幼虫5龄第3天各组织均有较高水平的表达。研究结果显示BmREF可能在RNA的核输出方面发挥作用,为进一步探讨BmREF的功能奠定了基础。
王俊生[9]（2010）在《小麦生理型雄性不育花药活性氧代谢和基因表达分析》文中指出化学杂交剂诱导的小麦生理型雄性不育及其杂种利用体系是目前小麦杂种优势利用最成功的典范之一。采用化杀途径利用小麦杂种优势具有诸多优点,尤其可以把育种起点建立在小麦常规育种的最新成果之上。SQ-1是一种新型小麦杀雄剂,具有杀雄彻底、喷药窗口宽、对农艺性状无明显副效应等优点,是目前国内外最优良小麦化杀剂之一。然而,其诱导小麦雄性不育的机理尚不清楚,尤其在基因表达水平和蛋白质表达水平上是否存在差异,差异如何均需深入探索。因此,本文在研究小麦不同组织部位对化杀剂SQ-1吸收转运效果基础上,观察了败育花粉粒细胞形态变化,采用动态取样测定了花药发育过程中的活性氧和抗氧化酶变化;其次利用cDNA-AFLP技术分析了败育关键时期的特异基因的表达差异,筛选出一些可能的不育相关基因,并对其进行电子延伸,设计PCR引物克隆其cDNA序列;最后利用RT-PCR技术验证和分析了育性相关基因的表达模式,探讨了育性相关基因的表达与雄性不育的关系,获得的主要结果如下:1在小麦发育到Feeke’s8.5～Feeke’s9.0时期,对旗叶,倒二叶和倒三叶进行单叶片或多叶片涂抹一定面积（剂量）的化学杂交剂,均能引起主茎穗高度雄性不育和分蘖穗部分雄性不育,其中发育完全的旗叶吸收运输能力最强,倒三叶最弱,同一叶片正面比背面吸收转运效果好;用化学杂交剂直接涂抹单核后期的小穗,也能诱导较高程度的雄性不育,但涂抹二核期的穗子仅诱导一定程度的不育率,并且发现化学杂交剂可横向影响对侧小穗花粉粒的育性,而不能从穗顶部运输到基部小穗影响其花粉粒育性。对主茎叶片涂抹足量化杀剂不但可以诱导主茎穗高度雄性不育,而且可以诱导分蘖穗产生较高程度的雄性不育;常规喷施条件下,花粉粒败育的主要时期为单核期到二核初期,以单核后期败育花粉粒比例最高,败育花粉粒呈畸形,不积累或积累极少量淀粉粒。2活性氧代谢研究表明,在幼穗期,o ?2.生成速率、H2O2和MDA含量、超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性均高于相应对照,而过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性则低于或显着低于对照;在单核早期到二核初期,o ?2.生成速率、H2O2和MDA含量极显着高于对照,而SOD、POD、CAT和APX酶活性却极显着低于对照;在败育后的花药中,o ?2.生成速率和H2O2含量与对照之间差异幅度缩小,但MDA含量依然加大,同期的几种抗氧化酶活性依然极显着低于对照。相同剂量喷施处理下,不同品种花药内活性氧和抗氧化酶变化存在差异。杀雄剂SQ-1能诱导小麦花药中o ?2.和H2O2大量积累以及SOD、POD、CAT和APX活性的极显着降低,引起花粉关键败育期花药活性氧代谢严重失衡和严重膜脂过氧化,是导致大量花粉细胞败育的主要生理原因。3对西农1376生理型不育和可育花药关键败育期基因表达分析,共获得了144个非冗余的差异基因,这些基因编码的蛋白主要涉及氧化胁迫或自身防御反应（5.6%）,信号转导和转录调节（15.3%）,核酸代谢（2.8%）,细胞内物质运输（5.6%）,能量代谢（12.5%）,蛋白质代谢（13.2%）,细胞组成和发育（2.8%）,27.1%的差异基因与已知基因或蛋白具有较弱的同源性;11.1%的差异基因没有同源基因或蛋白,仅存在同源EST序列,最后有6个TDFs没有任何同源序列,可能与目前数据库数据不足有关,或者该基因是尚未报道新的基因。化学杂交剂SQ-1诱导小麦雄性不育败育过程中,涉及了多个生理生化代谢途径,其中转录表达调节、蛋白质代谢和能量代谢途径中差异表达基因最多。不同转录因子调节的功能蛋白、参与的生化途径和不同途径中基因或蛋白之间的关系有待深入研究。4对小麦Urm1,Ubiquitin-S27a,U-box域蛋白,丙酮酸脱氢酶E1 alpha亚基,Arf GTPase激活蛋白家族蛋白,细胞色素P450家族蛋白,顺乌头酸脱氢酶进行了电子克隆,获得了这些基因的cDNA序列,并对其序列特性进行了分析。利用RT-PCR技术成功克隆了小麦Urm1和Ubiquitin-S27a的cDNA基因,验证了电子克隆的正确性。5对抗氧化胁迫和防御相关的细胞质型的APX和嘧啶核酸二硫化物氧化还原酶基因、与泛素/26S蛋白酶体降解途径有关的Urm1、Ubiquitin- S27a、F-box域蛋白以及与能量代谢相关的GAPDH、顺乌头酸酶、NFU域蛋白4共9个基因进行了半定量表达分析,结果表明,花药败育过程中,嘧啶核酸二硫化物氧化还原酶以及抗坏血酸过氧化物酶基因下调表达,导致细胞内处于较高的氧化态,细胞内发生严重膜脂过氧化作用。泛素蛋白酶体途径相关的Urm1、Ubiquitin-S27a、F-box域蛋白（与水稻UFO基因高度同源）在两个品种不育花药中不同时期均上调表达,且两个F-box域蛋白均表现出瞬时表达特点;TDF362代表的F-box域蛋白在不育花药单核后期和二核初期表达受到抑制,推测该F-box蛋白的靶标蛋白是正常花药发育的负调控因子。对F-box域蛋白调控的靶标蛋白有待深入研究。以上分析认为,控制正常花粉发育过程中的某些或某类关键蛋白的降解是由泛素蛋白酶体途径精确控制的,化学杂交剂SQ-1通过促进或抑制这些功能蛋白的调节蛋白基因表达来影响花药发育的正常行为。6 GAPDH和提供铁硫族蛋白分子骨架的NFU域蛋白4,与同期对照相比,在不育花药单核期到三核期均下调表达,其中在大量花粉粒败育的单核期,GAPDH下调表达尤为显着,使糖酵解过程受到抑制,降低了能量的供应;另外,顺乌头酸酶作为三羧酸循环的关键酶之一,也表现为下调表达,从而使三羧酸循环受阻或能量代谢途径改变,导致能量供应不足引起雄性不育。
邹向晖,邹宁,周令望,于维汉[10]（2007）在《介导人硫氧还蛋白基因转移的重组腺病毒构建》文中进行了进一步梳理目的应用基因重组方法构建携带人硫氧还蛋白（hTRX）基因的复制缺陷型重组腺病毒。方法用内切酶、RT-PCR、测序方法获得目的基因片段,然后将其cDNA克隆至表达载体pShuttle构建hTRX的重组真核细胞表达载体pShuttle-hTRX,在HeLa细胞中进行瞬时表达检测。从真核表达载体pShuttle-hTRX切下目的基因,并插入至腺病毒载体构建hTRX的重组腺病毒载体Adeno-hTRX,经PCR方法亦证明了成功构建腺病毒重组体。重组腺病毒在293细胞中扩增、纯化。结果成功构建了携带人硫氧还蛋白基因的复制缺陷型重组腺病毒,并以多种方法证实了构建载体的正确性。结论正确构建的人硫氧还蛋白重组腺病毒载体,可为基因治疗心血管系统疾病打下良好基础。
二、人的睾丸组织硫氧还蛋白cDNA的克隆及序列测定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人的睾丸组织硫氧还蛋白cDNA的克隆及序列测定（论文提纲范文）
（1）不同发育期白牦牛睾丸蛋白质组学分析及生殖相关候选基因HSP60生物学研究（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| SUMMARY |
| 第一章 文献综述 |
| 1 牦牛相关研究进展 |
| 1.1 牦牛的基础研究 |
| 1.2 雄性牦牛的繁殖生理 |
| 1.3 雌性牦牛繁殖生理 |
| 2 蛋白质组学研究进展 |
| 2.1 蛋白质组学技术与方法 |
| 2.2 蛋白质组学在畜牧业中的研究进展 |
| 2.3 蛋白质组学在动物睾丸发育研究中的应用 |
| 3 支持细胞研究进展 |
| 3.1 支持细胞结构、功能及所在的内环境 |
| 3.2 支持细胞增殖的分子机制 |
| 3.3 支持细胞体外培养的意义 |
| 4 热休克蛋白研究进展 |
| 4.1 热休克蛋白分类及功能 |
| 4.2 热休克蛋白60研究进展 |
| 4.3 热休克蛋白60在生殖领域的研究进展 |
| 5 研究的目的和意义 |
| 第二章 天祝白牦牛性成熟前后睾丸差异蛋白质组学研究 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同发育期白牦牛睾丸 2-DE图谱 |
| 2.2 不同发育期差异蛋白点质谱鉴定结果 |
| 2.3 差异蛋白质GO分析结果 |
| 2.4 差异蛋白亚细胞定位分析 |
| 2.5 差异蛋白的western blotting验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 天祝白牦牛HSP60基因的克隆及其在下丘脑-垂体-睾丸中的表达定位研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 数据统计 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 白牦牛HSP60基因全长cDNA克隆及测序 |
| 2.2 白牦牛HSP60蛋白理化性质及结构预测 |
| 2.3 白牦牛HSP60的疏/亲水性预测及分析 |
| 2.4 白牦牛HSP60蛋白氨基酸二级结构和磷酸化位点预测 |
| 2.5 白牦牛HSP60蛋白高级结构的分析 |
| 2.6 白牦牛与其他物种间HSP60氨基酸序列比较分析 |
| 2.7 HSP60mRNA在白牦牛性腺轴中的表达 |
| 2.8 Western Blotting验证HSP60蛋白在白牦牛性腺轴的表达 |
| 2.9 HSP60阳性细胞在白牦牛性腺轴的分布定位 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 HSP60对天祝白牦牛原代培养的支持细胞增殖的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 白牦牛睾丸支持细胞的原代培养及纯化 |
| 1.4 白牦牛睾丸支持细胞的鉴定 |
| 1.5 靶向HSP60基因siRNA合成及转染 |
| 1.6 靶向HSP60基因过表达载体pIRES2-EGFP-hsp60构建、鉴定及转染 |
| 1.7 MTS法测定细胞增殖 |
| 1.8 荧光定量检测Cyclin D1和PCNA基因的表达 |
| 1.9 数据统计与分析 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 白牦牛支持细胞的原代培养 |
| 2.2 支持细胞的鉴定 |
| 2.3 过表达载体pIRES2-EGFP-HSP60的构建及效果检测 |
| 2.4 siRNA-HSP60的合成及沉默效果检测 |
| 2.5 过表达HSP60基因对白牦牛原代支持细胞增殖的影响 |
| 2.6 沉默HSP60基因对白牦牛原代支持细胞增殖的影响 |
| 2.7 过表达HSP60基因对支持细胞Cyclin D1和PCNA基因的影响 |
| 2.8 沉默HSP60基因对支持细胞Cyclin D1和PCNA基因的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论及展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 个人简介 |
| 附表 |
| 1、HSP60核苷酸和氨基酸序列 |
| 2、GO功能分类 |
| 2.1 分子功能 |
| 2.2 生物学过程 |
| 2.3 细胞组份 |
（2）日本血吸虫腺苷酸激酶1基因功能分析与鉴定（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 主要缩略语 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 本研究的技术路线 |
| 第一章 SjAK1生物信息学分析、克隆表达及酶活力测定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 SjAK1基因的生物信息学分析 |
| 2.2 氨基酸序列比对及系统进化分析 |
| 2.3 SjAK1基因的克隆、表达纯化与多克隆抗血清制备 |
| 2.4 rSjAK1酶活性测定 |
| 3 讨论 |
| 第二章 日本血吸虫不同发育时期SjAK1的表达水平及组织学定位检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 荧光定量PCR鉴定SjAK1在不同发育时期虫体中的表达 |
| 2.2 Western blot鉴定SjAK1在不同发育时期虫体中的表达 |
| 2.3 免疫组织化学法定位SjAK1 |
| 3 讨论 |
| 第三章 rSjAK1对小鼠抗日本血吸虫感染的免疫保护效果及机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 减虫率和减卵率 |
| 2.2 细胞因子水平变化 |
| 3 讨论 |
| 第四章 体外RNAi实验研究SjAK1在童虫生长发育过程中的功能 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 dsRNA制备与最佳干扰条件筛选 |
| 2.2 Western blot检测干扰童虫后沉默效果 |
| 2.3 体外培养童虫基因沉默后形态学观察 |
| 2.4 Tunel检测SjAK1沉默后童虫细胞凋亡 |
| 3 讨论 |
| 第五章 体外RNAi实验研究SjAK1在虫卵形成过程中的功能 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 SjAK1 dsRNA干扰合抱成虫最佳干扰条件筛选 |
| 2.2 Western blot检测干扰合抱成虫后沉默效果 |
| 2.3 体外培养合抱成虫SjAK1基因沉默后形态学观察 |
| 2.4 Tunel检测SjAK1沉默后童虫细胞凋亡 |
| 2.5 荧光定量PCR检测不同发育期雌虫中SjAK1的表达 |
| 2.6 荧光定量PCR检测未成熟卵及成熟卵中SjAK1的表达 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间主要科研成果 |
| 致谢 |
（3）西藏小型猪生长相关基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 第一节 研究背景与科学意义 |
| 1.1 小型猪研究的现状及其进展 |
| 1.2 国内、外小型猪的介绍 |
| 1.3 小型猪在生物医学中的应用 |
| 1.4 本研究的意义 |
| 第二节 生长相关基因国内外的研究现状 |
| 2.1 神经内分泌生长轴 |
| 2.2 与生长相关基因的研究 |
| 2.3 本研究的目标和内容 |
| 第二章 研究内容 |
| 第一节 西藏小型猪GH、GHR基因多态性的研究 |
| 前言 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二节 西藏小型猪GHR、IGF-1基因的克隆测序分析 |
| 前言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三节 西藏小型猪GH、GHR、IGF-1基因在不同年龄阶段和在不同组织中表达的差异分析 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四节 西藏小型猪GHR基因的真核表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 英文缩写词表 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）伏马菌素B1和赭曲霉毒素A噬菌体单链抗体库的构建及重组抗体蛋白的原核表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 伏马菌素研究进展 |
| 1 伏马菌素的理化特性 |
| 2 伏马菌素的毒性及作用机理 |
| 2.1 神经毒性 |
| 2.2 肺毒性 |
| 2.3 免疫系统的毒性 |
| 2.4 细胞毒性 |
| 2.5 肝肾毒性 |
| 2.6 致癌性 |
| 2.7 生殖毒性、胚胎毒性 |
| 2.8 伏马菌素与其他真菌毒素之间的互作毒性效应 |
| 3 伏马菌素的污染情况 |
| 4 伏马菌素的限量标准 |
| 5 伏马菌素的检测技术 |
| 5.1 薄层色谱法 |
| 5.2 气相色谱法 |
| 5.3 高效液相色谱法 |
| 5.4 液相色谱-质谱联用 |
| 5.5 酶联免疫法 |
| 5.6 其他方法 |
| 参考文献 |
| 第二章 赭曲霉毒素研究进展 |
| 1 赭曲霉毒素的理化特性 |
| 2 赭曲霉毒素的毒性及作用机理 |
| 2.1 OTA急性毒性 |
| 2.2 肾毒性 |
| 2.3 肝毒性 |
| 2.4免疫毒性 |
| 2.5 致癌性 |
| 2.6 致畸性 |
| 2.7 毒性作用机理 |
| 3 赭曲霉毒素的污染情况 |
| 4 赭曲霉毒素的限量 |
| 5 赭曲霉毒素的检测技术 |
| 5.1 薄层色谱法 |
| 5.2 高效液相色谱-荧光检测器联用法 |
| 5.3 液相-质谱联用法 |
| 5.4 免疫学检测法 |
| 5.5 其他检测方法 |
| 参考文献 |
| 第三章 单链抗体及噬菌体展示技术 |
| 1 单链抗体的构建 |
| 2 噬菌体展示系统 |
| 2.1 丝状噬菌体系统 |
| 2.2 T4噬菌体系统 |
| 2.3 λ噬菌体系统 |
| 2.4 T7噬菌体展示系统 |
| 3 单链抗体的表达 |
| 4 单链抗体的发展 |
| 4.1 靶向载体 |
| 4.2 细胞内免疫 |
| 4.3 构建其它工程抗体 |
| 4.4 其他方面研究 |
| 5 单链抗体及噬菌体展示技术的应用 |
| 5.1 新型疫苗的研发 |
| 5.2 获得稀有的单克隆抗体 |
| 5.3 诊断与免疫治疗 |
| 5.4 在蛋白质组学研究中的应用 |
| 5.5 噬菌体展示技术在真菌毒素方面应用 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 伏马菌素B_1和赭曲霉毒素A完全抗原的合成与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与耗材 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 紫外扫描法鉴定OTA及FB_1完全抗原 |
| 2.2 凝胶电泳法鉴定完全抗原 |
| 2.3 红外光谱法鉴定完全抗原 |
| 2.4 MALDI-TOF-MS鉴定完全抗原及测定偶联比 |
| 2.5 ELISA鉴定完全抗原免疫原性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 完全抗原的合成 |
| 3.2 凝胶电泳法鉴定偶联效果 |
| 3.3 完全抗原偶联结合比的确定 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 伏马菌素B_1单链抗体可变区基因克隆与噬菌体抗体蛋白的原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂及耗材 |
| 1.2 细胞株、菌株与质粒 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 引物 |
| 1.5 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)基因扩增 |
| 2.2 单链抗体可变区基因片段(ScFv)的组装与扩增 |
| 2.3 ScFv基因片段T-A亚克隆产物酶切鉴定结果 |
| 2.4 pCANTAB5E-ScFv重组质粒构建与鉴定 |
| 2.5 FB_1噬菌体抗体库滴度 |
| 2.6 免疫亲和筛选条件确定 |
| 2.7 噬菌体单链抗体库的富集结果 |
| 2.8 阳性噬菌体单链抗体筛选结果 |
| 2.9 噬菌体重组单链抗体的可溶性表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 噬菌体展示技术及免疫亲和筛选技术 |
| 3.2 ELISA筛选技术 |
| 3.3 单链抗体蛋白的原核表达与宿主菌的选择 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 赭曲霉毒素A单链抗体可变区基因克隆与噬菌体抗体蛋白的原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物 |
| 1.3 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)基因扩增 |
| 2.2 单链抗体可变区基因片段(ScFv)的组装与扩增 |
| 2.3 pCANTAB5E-ScFv重组质粒构建与鉴定 |
| 2.4 OTA噬菌体抗体库滴度 |
| 2.5 噬菌体单链抗体库的富集结果 |
| 2.6 阳性噬菌体单链抗体筛选结果 |
| 2.7 噬菌体重组单链抗体的可溶性表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 单链抗体可变区基因片段的扩增的引物设计 |
| 3.2 单链抗体可变区基因的来源选择 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第七章 伏马菌素B_1和赭曲霉毒素A单链抗体特性鉴定 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Western Blotting结果 |
| 2.2 ELISA分析单链抗体免疫活性结果 |
| 2.3 FB_1及OTA单链抗体效价 |
| 2.4 单链抗体活性的鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 全文总结 |
| 全文创新点 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文及其他 |
（6）绒山羊和绵羊Izumo4和Tssk6 cDNA克隆及与其它精卵融合相关蛋白质的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 研究论文 |
| 第一章 绒山羊和绵羊Izum4和Tssk6 cDNA克隆 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 绵羊和绒山羊睾丸组织总RNA的提取及cDNA检测 |
| 2.2 绒山羊和绵羊Izumo4和Tssk6 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
| 2.3 绒山羊和绵羊Izumo4和Tssk6 cDNA克隆与鉴定 |
| 2.4 绒山羊和绵羊Izumo4和Tssk6 cDNA测序结果与分析 |
| 2.5 绒山羊和绵羊Izumo4和Tssk6的氨基酸序列分析 |
| 2.6 绒山羊Izumo4和TSSK6蛋白质的结构分析 |
| 2.7 不同动物的Izumo4和TSSK6蛋白氨基酸序列的比较分析 |
| 3 讨论 |
| 第二章 绒山羊HIS-Izumo4和HIS-TSSK6的原核表达与分离纯化 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 pET-gIzumo4/Tssk6重组载体的构建与PCR和酶切鉴定 |
| 2.2 绒山羊Izumo4和TSSK6在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 |
| 2.3 HIS-Izumo4/TSSK6融合蛋白质的可溶性及包涵体分析 |
| 2.4 HIS-Izumo4/TSSK6融合蛋白的Western blot的鉴定 |
| 2.5 HIS-Izumo4/TSSK6融合蛋白质的纯化与浓度测定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 小鼠抗绒山羊Izumo4和TSSK6腹水多克隆抗体的制备及纯化 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠抗绒山羊Izumo4和TSSK6腹水多克隆抗体的鉴定 |
| 2.2 小鼠抗山羊CRISP2多克隆抗体的效价测定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 Izumo4和TSSK6在睾丸组织和精子中的定位检测 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 绒山羊睾丸组织中Izumo4和TSSK6的定位 |
| 2.2 绒山羊精子中Izumo4和TSSK6的定位 |
| 3 讨论 |
| 第五章 Izumo4和TSSK6与其它蛋白之间的相互作用研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 真核表达载体的构建 |
| 2.2 免疫共沉淀及Western blot结果 |
| 2.3 酵母双杂交结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 文献综述 |
| 前言 |
| 1 Izumo家族 |
| 1.1 发现和功能 |
| 1.2 结构与分布 |
| 2 Pdia3蛋白二硫异构氧化还原酶 |
| 2.1 结构与分布 |
| 2.2 功能 |
| 3 Tssk6-睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸激酶6 |
| 3.1 发现与表达 |
| 3.2 结构与功能 |
| 4 精卵融合蛋白相互作用的展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间参与的科研项目和发表的学术论文 |
（7）基于微囊藻毒素处理后鲢鱼肝脏差减文库的构建和分析以及部分基因的克隆（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 微囊藻毒素的产生、结构、毒性与危害 |
| 1.1 水体富营养化的形成及影响 |
| 1.2 微囊藻毒素的产生 |
| 1.3 微囊藻毒素的结构 |
| 1.4 微囊藻毒素的污染现状 |
| 2 微囊藻毒素对鱼类的毒理学效应 |
| 2.1 微囊藻毒素的致毒机制 |
| 2.2 微囊藻毒素对鱼类的致毒效应 |
| 3 淡水鱼类对微囊藻毒素的去除作用研究 |
| 3.1 鱼类对微囊藻毒素的生物净化 |
| 3.2 微囊藻毒素去毒机理及相关基因 |
| 4 抑制差减杂交技术（SSH）及其应用 |
| 4.1 SSH 的基本原理与技术流程 |
| 4.2 SSH 方法的优缺点 |
| 4.3 SSH 在鱼类基因克隆中的应用进展 |
| 5 cDNA 末端快速扩增（RACE）技术 |
| 5.1 RACE 的原理及方法 |
| 5.2 RACE 的优点和缺点 |
| 5.3 RACE 的应用进展 |
| 6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 鲢鱼肝脏MC-LR 暴露及不同时间GST 表达分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 微囊藻毒素诱导的鲢鱼肝脏SSH 文库的构建及分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 cDNA 的合成和Rsa I 酶切 |
| 2.2 差减效率的验证 |
| 2.3 抑制差减文库的建立及分析 |
| 2.4 EST 测序及分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 高质量RNA 是构建高质量文库的基础 |
| 3.2 SSH 文库的质量检测 |
| 3.3 鲢鱼肝脏参与去除微囊藻毒素的相关基因 |
| 第四章 鲢鱼肝脏差异表达基因的半定量表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 正向文库F529、F559 和F570 在肝脏组织各时间点的表达 |
| 2.2 反向文库R52、R515 和R5161 在肝脏组织各时间点的表达 |
| 3 讨论 |
| 第五章 鲢鱼PEPCK 和PDIA3 基因的克隆及其生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 鲢鱼PEPCK 基因RACE 扩增结果 |
| 2.2 鲢鱼 PDIA3 基因 RACE 扩增结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）家蚕减数分裂阻滞基因及RNA和输出因子结合蛋白基因的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 昆虫精子形成调控的分子机制 |
| 1.1 果蝇精子发生和形成的形态学特征 |
| 1.2 果蝇睾丸的胚原始增殖中心的基因表达 |
| 1.3 初级精母细胞激活组织特异性转录程序 |
| 1.4 初级精母细胞中的基因表达 |
| 1.5 X 染色体的基因表达 |
| 1.6 减数分裂阻滞基因：在初级精母细胞中调控基因表达 |
| 1.7 精子延长中的转录活性 |
| 1.8 结语 |
| 参考文献 |
| 第二章 RNA 的核输出机制 |
| 2.1 核孔复合物 |
| 2.2 经典的 importin-β 受体介导的出核运输 |
| 2.3 tRNA 核输出 |
| 2.4 miRNA 的核输出 |
| 2.5 snRNA 的核输出 |
| 2.6 mRNA 的核输出 |
| 2.7 rRNA 的核输出 |
| 2.8 结语 |
| 参考文献 |
| 第三章 研究目的与研究内容 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 研究的主要内容 |
| 3 技术路线 |
| 第四章 材料与方法 |
| 1 一般材料 |
| 1.1 载体与菌种 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 生物材料 |
| 1.4 工具酶及试剂盒 |
| 1.5 其它试剂 |
| 1.6 主要实验试剂的配制 |
| 2 实验常用仪器设备 |
| 3 常用实验方法 |
| 3.1 碱裂解法制备质粒DNA |
| 3.2 PCR 扩增 |
| 3.3 酶切反应 |
| 3.4 连接反应 |
| 3.5 感受态细胞的制备 |
| 3.6 连接产物的转化 |
| 3.7 重组质粒的筛选 |
| 3.8 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.9 分离回收目的片段 |
| 3.10 SDS-PAGE 蛋白质电泳 |
| 3.11 SDS-PAGE 凝胶的染色和脱色 |
| 3.12 Western blotting |
| 3.13 总RNA 的提取 |
| 3.14 RNA 反转录成 cDNA |
| 3.15 纯化过柱 |
| 3.16 多克隆抗体的制作 |
| 3.17 定量 PCR（Quantitative PCR.qPCR） |
| 3.18 免疫荧光检测 |
| 3.19 石蜡组织切片制作和染色 |
| 参考文献 |
| 第五章 家蚕 aly 基因 cDNA 的克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bmaly 基因的电子克隆 |
| 2.2 Bmaly ORF 的克隆与鉴定 |
| 2.3 Bmaly ORF 的分析 |
| 2.4 Bmaly 的保守结构域预测 |
| 2.5 Aly 的同源性比较 |
| 2.6 Aly 的进化分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 Bmaly 基因在家蚕不同组织中的表达差异 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 q-PCR 分析 Bmaly 在不同组织中的表达 |
| 2.2 基于基因芯片的 Bmaly 的表达谱 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 家蚕 aly 的原核表达、抗体制备和细胞定位 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BmAly 重组蛋白的诱导表达及过柱纯化 |
| 2.2 Western blotting 检测 BmAly 抗体的特异性。 |
| 2.3 BmAly 亚细胞定位 |
| 3 讨论 |
| 3.1 Bmaly 基因的稀有密码子对原核表达的影响 |
| 3.2 原核表达重组蛋白的纯化 |
| 3.3 BmAly 的亚细胞定位 |
| 参考文献 |
| 第八章 注射 Bmaly siRNA 对家蚕精细胞发育的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 注射 siRNA 对精细胞发育的影响 |
| 2.2 注射 siRNA 对蚕卵受精率的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第九章 家蚕 ref 基因的克隆、序列分析及其细胞定位 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 基因的克隆 |
| 1.3 Bmref 序列分析 |
| 1.4 家蚕 BmREF 原核表达质粒的构建及诱导表达 |
| 1.5 SDS-PAGE 和 Western blotting |
| 1.6 鼠抗 His-BmREF 抗体的制备 |
| 1.7 BmREF 的细胞定位 |
| 1.8 表达谱分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 家蚕 BmREF ORF 的克隆与鉴定 |
| 2.2 Bmref 高级结构分析 |
| 2.3 REF 多重比对和进化分析 |
| 2.4 BmREF 原核表达及其抗体制备 |
| 2.5 BmREF 的细胞定位 |
| 2.6 Bmref 的组织表达谱 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 1 已取得的成果 |
| 2 有待进行的研究 |
| 附录 |
| 1 英文简写对照表 |
| 2 载体图谱 |
| 3 pPigT7 和 AcA3IFP2 结构 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 1 研究论文 |
| 2 GenBank 登录序列 |
| 致谢 |
（9）小麦生理型雄性不育花药活性氧代谢和基因表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 小麦杂种优势 |
| 1.1.1 小麦杂种优势利用概况 |
| 1.1.2 我国杂交小麦育种的三种主要途径 |
| 1.2 植物雄性不育机理 |
| 1.2.1 花粉败育过程细胞学研究和超微结构观察 |
| 1.2.2 雄性不育性的生理生化基础 |
| 1.2.3 激素调控和植物雄性不育 |
| 1.2.4 活性氧代谢与作物雄性不育 |
| 1.3 雄性不育分子机理研究 |
| 1.3.1 小麦雄性不育分子标记研究 |
| 1.3.2 线粒体基因组水平的比较研究 |
| 1.3.3 小麦雄性不育cDNA 表达谱和蛋白质差异比较 |
| 1.4 化学杀雄不育相关基因的分离 |
| 1.4.1 生理型雄性不育差异基因分离对等系的建立 |
| 1.4.2 生理型雄性不育差异基因研究现状 |
| 1.5 主要差异显示技术比较及其在雄性不育机理研究中的应用 |
| 1.5.1 差别显示技术（DDRT-PCR) |
| 1.5.2 抑制消减杂交技术 |
| 1.5.3 cDNA-AFLP 技术 |
| 1.5.4 基因芯片技术 |
| 1.6 蛋白质组学技术 |
| 1.7 本实验选题目的和意义 |
| 第二章 化杀剂SQ-1 涂抹小麦不同组织诱导其不育效应的比较 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.2 试验处理 |
| 2.2.3 各处理诱导的雄性不育效应计算方法 |
| 2.2.4 不同处理花粉粒的细胞学和扫描电镜观察 |
| 2.2.5 化杀剂SQ-1 诱导小麦花粉败育发生期估计 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.3.1 低剂量化杀剂SQ-1 涂抹处理诱导的不育效果 |
| 2.3.2 以5.0μg 和8.3μg 剂量涂抹不同叶位叶片和小麦穗部诱导的雄性不育率 |
| 2.3.3 对花粉粒败育发生时期的估计 |
| 2.3.4 不同处理花粉细胞学观察和比较 |
| 2.3.5 各处理扫描电镜的观察 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 小麦生理型雄性不育花粉粒败育时期 |
| 2.4.2 叶片功能可能影响诱导的不育效应 |
| 2.4.3 化杀剂在植株体内运输方向 |
| 2.4.4 花粉败育期的数量变化和败育机理分析 |
| 第三章 化学杂交剂SQ-1 诱导的小麦生理型雄性不育花药的活性氧代谢 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 利用SQ-1 构建对等生理系 |
| 3.2.2 试验试剂和仪器 |
| 3.2.3 酶液制备 |
| 3.2.4 酶活性的测定方法 |
| 3.2.5 超氧阴离子（O_2~- .）产生速率、H_2O_2和 MDA 含量的测定 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 处理植株的育性表现和饱和授粉结实率 |
| 3.3.2 处理和对照植株花药中 O_2~-.、H_2O_2和 MDA 含量比较 |
| 3.3.3 处理和对照植株花药 SOD、POD 、CAT 和 APX 酶活性比较 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 植物体内的活性氧平衡 |
| 3.4.2 生理型雄性不育和活性氧代谢的关系 |
| 3.4.3 生理型雄性不育与抗氧化酶活性的关系 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 SQ-1 诱导的小麦生理型雄性不育花药的差异表达分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 常规试验试剂和仪器 |
| 4.2.3 试验技术体系和流程 |
| 4.2.4 克隆、测序和同源性分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 化学杂交剂诱导的雄性不育效果 |
| 4.3.2 化杀剂SQ-1 对花药形态和小孢子发育的影响 |
| 4.3.3 总RNA 质量检测和反转录第二链 |
| 4.3.4 预扩增结果电泳检测分析 |
| 4.3.5 选择性扩增结果 |
| 4.3.6 差异表达TDFs 的阳性单克隆菌落PCR 和双酶切筛选 |
| 4.3.7 差异TDFs 代表的同源基因功能分类分析 |
| 4.3.8 差异TDFs 代表的同源基因功能分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 材料的控制 |
| 4.4.2 试验中对技术环节的控制 |
| 4.4.3 cDNA-AFLP 差异显示技术分析的有效性 |
| 第五章 育性差异表达基因片段的克隆、序列特性以及半定量表达 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 供试材料和处理 |
| 5.2.2 差异表达基因的电子延伸 |
| 5.2.3 小麦花药总RNA 的提取和纯化 |
| 5.2.4 第一链cDNA 和第二链cDNA 的合成 |
| 5.2.5 电子克隆后的差异基因扩增或cDNA 序列扩增 |
| 5.2.6 目的片段的回收、克隆转化及测序 |
| 5.2.7 序列特性分析 |
| 5.2.8 部分育性相关基因的半定量表达分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 小麦Urm1 基因的克隆和特性分析 |
| 5.3.2 泛素融合基因的电子克隆与序列特性分析 |
| 5.3.3 小麦花药发育相关的 U-box domain 蛋白基因的电子克隆(TDF269) |
| 5.3.4 丙酮酸脱氢酶E1 α亚基的克隆和分析 |
| 5.3.5 小麦Arf GTPase激活蛋白电子克隆和特性分析 |
| 5.3.6 小麦细胞色素P450 家族蛋白克隆与序列分析 |
| 5.3.7 小麦顺乌头酸脱氢酶电子克隆 |
| 5.4 育性相关基因在不同发育期小麦花药中的半定量表达分析 |
| 5.4.1 总RNA 和反转录结果检测 |
| 5.4.2 抗氧化胁迫相关基因在生理型不育花药中的表达 |
| 5.4.3 泛素途径相关基因表达在生理型不育花药中的表达 |
| 5.4.4 能量代谢相关基因在生理型不育花药中的表达分析 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 电子拼接技术和基因克隆 |
| 5.5.2 RT-PCR 表达技术分析 |
| 5.5.3 相关基因表达差异与生理型雄性不育关系 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 结论 |
| 6.1.1 化杀剂SQ-1 诱导小麦败育的时期、类型 |
| 6.1.2 活性氧代谢与生理型不育花粉败育 |
| 6.1.3 基因差异表达与雄性不育 |
| 6.1.4 基因克隆、表达和雄性不育 |
| 6.2 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、人的睾丸组织硫氧还蛋白cDNA的克隆及序列测定（论文参考文献）
- [1]不同发育期白牦牛睾丸蛋白质组学分析及生殖相关候选基因HSP60生物学研究[D]. 阮崇美. 甘肃农业大学, 2017(12)
- [2]日本血吸虫腺苷酸激酶1基因功能分析与鉴定[D]. 高彦茹. 武汉大学, 2017(07)
- [3]西藏小型猪生长相关基因的研究[D]. 岳敏. 南方医科大学, 2014(05)
- [4]褶纹冠蚌硫氧还蛋白基因克隆及空间结构分析[J]. 刘晓妮,胡宝庆,文春根,陶志英,刘大伟. 南昌大学学报(理科版), 2013(02)
- [5]伏马菌素B1和赭曲霉毒素A噬菌体单链抗体库的构建及重组抗体蛋白的原核表达[D]. 王莹. 南京农业大学, 2012(11)
- [6]绒山羊和绵羊Izumo4和Tssk6 cDNA克隆及与其它精卵融合相关蛋白质的作用研究[D]. 乌吉斯古冷. 内蒙古大学, 2012(01)
- [7]基于微囊藻毒素处理后鲢鱼肝脏差减文库的构建和分析以及部分基因的克隆[D]. 张开岳. 上海海洋大学, 2011(08)
- [8]家蚕减数分裂阻滞基因及RNA和输出因子结合蛋白基因的研究[D]. 钟金凤. 苏州大学, 2011(06)
- [9]小麦生理型雄性不育花药活性氧代谢和基因表达分析[D]. 王俊生. 西北农林科技大学, 2010(10)
- [10]介导人硫氧还蛋白基因转移的重组腺病毒构建[J]. 邹向晖,邹宁,周令望,于维汉. 中华地方病学杂志, 2007(05)