一、用T7噬菌体展示筛选系统筛选与靶蛋白相结合的蛋白（论文文献综述）
翁少亭[1]（2020）在《利用rAAV-SaCas9系统敲除肌细胞的myostatin基因并评价其对肌肉萎缩的改善作用》文中指出目的:一体化的AAV-Cas9-sg RNA系统有免疫原性低,宿主范围广,安全性高,能长时间稳定表达,构建快捷等优势,已经在基因组编辑和基因表达调控上得到应用。但是,该系统自身的容量小,蛋白表达水平少,基因的特异性识别以及编辑能力较低等都限制了体内应用。与此同时,通过CRISPR/Cas9调控TGF-β家族信号通路影响肌肉细胞增殖与分化,从而改善癌症,恶病质,肌肉衰减综合征等肌肉萎缩性疾病的治疗方法有广阔前景。因此,一种理想的AAV-Cas9-sg RNA系统是该技术应用于基因研究与治疗的基础。本文对AAV-Cas9-sg RNA系统进行了优化构建出r AAV-Sa Cas9-sg RNA系统,并通过体内外敲除肌细胞的myostatin基因,分析敲除后的肌细胞形态变化和相关细胞因子的变化,探索利用r AAV-Sa Cas9-sg RNA系统敲除肌细胞myostatin基因改善肌肉萎缩性疾病的效果。方法:1.我们在p X601质粒中插入了嘌呤霉素抗性基因,然后设计出打靶myostatin基因的sg RNA,构建出有敲除能力的p X601-puro-sg Mstn质粒。然后通过转染C2C12细胞,嘌呤霉素抗性培养基进行细胞筛选,有限浓度稀释法培养单细胞克隆,最后鉴定出myostatin基因敲除的单克隆细胞系。通过RT-PCR和Western Bloting分析C2C12单克隆细胞系中TGF-β信号通路,AKT-m TOR信号通路以及MRFs中关键细胞因子的变化;并通过CCK8法和流式细胞术分析C2C12单克隆细胞系在细胞增殖活性以及细胞周期的变化。2.我们用EF1α启动子,t RNA启动子替换了p X601质粒中的CMV与U6启动子,构建出新的含Sa Cas9的质粒R-p X601。然后在质粒R-p X601中插入了e-GFP荧光蛋白的表达序列,通过3质粒共转染HEK293细胞的方法包装并纯化出r AAV-Sa Cas9-sg Mstn。通过基因测序和Western Bloting分析r AAV-Sa Cas9-sg Mstn对myostatin基因及其蛋白的表达影响;通过流式细胞术以及荧光成像的方法摸索不同病毒量以及时间段r AAV-Sa Cas9-sg Mstn在体内与体外表达的效果。然后用摸索条件后的AAV-Sa Cas9-sg Mstn作用于肌肉萎缩的小鼠模型并分析小鼠肌细胞组织学及细胞学变化。3.最后我们分别包装了含有R-p X601和p X601的AAV重组病毒,并分别对老龄鼠的大腿肌肉进行了myostatin基因编辑。通过组织切片及组织免疫荧光的方法对肌纤维以及卫星细胞进行了分析。最后通过RT-PCR和Western Bloting分析相关信号通路中细胞因子的变化,探究部分敲除老龄鼠的myostatin基因对肌细胞增殖的影响。结果:1.我们成功构建了含嘌呤霉素抗性的p X601-puro-sg Mstn质粒。通过T7酶切鉴定,测序分析以及打靶效率分析等证明构建质粒在细胞中有基因编辑能力;通过该质粒转染筛选出myostatin基因敲除的C2C12单克隆细胞系;通过对C2C12单克隆细胞系相关信号通路TGF-β,AKT-m TOR以及MRFs的分析证明敲除myostatin后细胞周期变活跃,胞内蛋白质合成增加以及促肌细胞生成蛋白增加。通过CCK-8及流式细胞术结果分析证明myostatin蛋白表达对C2C12细胞增殖以及细胞周期有明显促进作用。2.我们证明r AAV-Sa Cas9系统的启动子能够稳定、长期地表达基因编辑元件,并且一定范围内随着r AAV在体内外剂量的增加,myostatin的编辑效率和e GFP蛋白的表达水平增加。通过e GFP蛋白的表达水平可以间接了解Cas9蛋白的基因编辑效率。此外,我们还证明了在小鼠肌肉萎缩模型中通过靶向敲除部分myostatin基因能改善小鼠肌肉细胞的性状。3.我们用两个系统R-p X601和p X601分别成功包装出r AAV9,并证明它们有效地编辑了myostatin基因。通过敲除老龄鼠的myostatin基因,我们观察到试验鼠体重增加,肌纤维数量和横截面积增加。myostatin基因敲除导致TGF-β信号传导途径改变,并增加Myo D、Pax7和Myo G蛋白水平,增加卫星细胞数量,促进肌肉细胞分化与增殖。此外,敲除myostatin基因使MURF1和Atrogin1蛋白水平下降,有效抑制了肌肉细胞萎缩。结论:我们构建了一个小巧的一体化r AAV-Sa Cas9基因组编辑系统,它能有效的进行体内外myostatin基因的敲除。敲除myostatin基因后的肌细胞增殖分化能力增强并且抑制其凋亡,通过分析相关细胞因子发现myostatin基因对肌调控生长因子以及促蛋白合成/降解因子有明显影响。这在基因治疗肌肉萎缩疾病,如恶病质,癌症以及老龄性肌肉衰减综合征等一些慢性消耗性疾病上有潜在的应用价值。
丁园[2]（2020）在《氯噻啉模拟表位多肽的研制与应用》文中研究表明
丁园[3]（2020）在《氯噻啉模拟表位多肽的研制与应用》文中研究指明免疫分析技术具有简便、快速、低成本和能够同时对多个样品进行检测的特点,已作为农药筛查技术而被广泛研究。由于农药是单抗原决定簇分析物,故常采用竞争模式进行检测。竞争物是该模式的核心试剂,其质量直接影响免疫分析的检测性能。但是化学合成方法研制竞争物的盲目性大、成本高、周期长,导致免疫检测的性能不能满足实际检测需求。噬菌体展示多肽技术可高效、经济的获得与抗体特异性结合的模拟表位多肽,用作化学合成竞争抗原的替代物。目前,噬菌体展示多肽模拟表位常用于建立噬菌体酶联免疫吸附分析（P-ELISA）,但该方法的检测范围一般较窄。同时,噬菌体展示多肽模拟表位的活性多肽片段连接在噬菌体外壳蛋白上,造成整体粒径较大,流动性差,且存在生物安全隐患等缺陷,限制了在免疫分析中的应用。本研究以氯噻啉为研究对象,通过噬菌体展示多肽技术制备了氯噻啉模拟表位多肽,作为竞争抗原建立了 P-ELISA,提高了检测敏感性;引入化学发光系统,建立了噬菌体化学发光酶免疫分析（P-CLEIA）,扩宽了检测范围;通过蛋白重组的方式构建了模拟表位多肽与纳米荧光素酶（NanoLuc）和绿色荧光蛋白（EmGFP）的重组模拟表位,并建立了系列新颖的检测技术,克服了噬菌体展示多肽的缺点,拓展了噬菌体展示多肽模拟表位的应用,提升了免疫分析的性能。主要研究结果如下:1、氯噻啉噬菌体展示多肽模拟表位的制备利用实验室已制备的抗氯噻啉单克隆抗体（mAb1E7）对噬菌体展示环七肽库、环八肽库和线十二肽库进行三轮亲和淘选,获得了 6种氯噻啉的噬菌体展示模拟表位多肽,氨基酸序列分别为:PRIWADS、TYLNSAK、LPPRMIYE、QPWCPPSICGD、TMHLPYCPTNIC和DYHDPSLPTLRK。在P-ELISA中,6种模拟表位多肽的敏感性（半数抑制浓度,IC50）在2.97～5.74 ng mL-1之间,其中序列为TMHLPYCPTNIC（L4-29）的模拟表位多肽显示出最优的敏感性,即IC50为2.97 ngmL-1。2、氯噻啉噬菌体酶免疫分析方法的建立利用L4-29（TMHLPYCPTNIC）建立了两种可检测农产品和环境样品中氯噻啉残留量的噬菌体酶免疫分析方法:P-ELISA和P-CLEIA。通过对反应缓冲液进行优化,获得两种方法的最佳工作条件均为2.5%甲醇,pH 8和0.14 mol L-1 NaCl。在最优条件下,P-ELISA的IC50、最低检测限（LOD）和线性范围（IC10～IC90）分别为1.45、0.55和0.55～3.82 ng mL-1;P-CLEIA的IC50、LOD和线性范围分别为0.86、0.13和0.13～5.84 ng mL-1。较基于化学合成竞争抗原的ELISA,P-ELISA和P-CLEIA对氯噻啉检测的敏感性分别提高了 60倍和101倍。此外,两种噬菌体酶免疫分析方法的敏感性均高于目前建立的所有氯噻啉的免疫分析方法。P-CLEIA的敏感性略高于P-ELISA,同时线性范围较P-ELISA提高了 6.5倍。两种检测方法对除吡虫啉外的氯噻啉结构类似化合物均无明显交叉反应。P-ELISA和P-CLEIA对稻田水、土壤、甘蓝、大米、苹果、青菜、梨和番茄样品中氯噻啉的平均添加回收率分别在72.3～101.3%和73.9～102.6%之间。P-ELISA和P-CLEIA对稻田水和梨真实样品中氯噻啉残留量的检测结果与高效液相色谱的检测结果具有很好的一致性。研究结果表明噬菌体展示多肽可作为氯噻啉免疫分析的竞争抗原,P-CLEIA是一种敏感性更高、线性范围更宽的分析方法。3、氯噻啉生物发光重组模拟表位的制备及生物发光免疫分析方法的建立将氯噻啉的模拟表位多肽C2-15（LPPRMIYE）与NanoLuc融合表达制备了两种生物发光重组模拟表位:C2-15-NanoLuc（多肽位于N端）和NanoLuc-C2-15（多肽位于C端）。其中NanoLuc-C2-15表现出与mAb 1E7更高的亲和性,用于建立了生物发光酶免疫分析（BLEIA）和生物发光侧流免疫层析（BLLFIA）方法。由于NanoLuc的高发光效率,在无外源激发光源的情况下,可使用智能手机对BLLFIA的信号进行检测。BLEIA 的 IC50、LOD 和线性范围分别为 3.3、0.2 和 0.2～57.3 ng mL-1;BLLFIA为6.4、0.3和0.3～81.7 ng mL-1。两种生物发光酶免疫分析的敏感性相似,且与基于噬菌体展示多肽的P-ELISA接近（IC50=4.02 ngmL-1）。特异性方面,BLEIA和BLLFIA对吡虫啉的交叉反应（CR）分别为93.6%和95.1%,与其他氯噻啉结构类似化合物均无交叉反应。BLEIA和BLLFIA对稻田水、土壤、糙米和柑橘样品中氯噻啉的平均添加回收率分别在79.0～104.1%和78.0～110.2%之间。此外,BLEIA和BLLFIA对糙米真实样品中氯噻啉残留量的检测结果与高效液相色谱的检测结果具有很好的一致性。研究结果表明多肽与NanoLuc的重组蛋白保留了噬菌体展示多肽与抗体特异性结合的特性,并且可以提供检测信号,克服了噬菌体展示多肽粒径较大,流动性差,且存在生物安全隐患等缺陷,避免了偶联反应造成的批次差异。4氯噻啉荧光重组模拟表位的制备及磁分离荧光免疫分析方法的建立将氯噻啉的噬菌体展示多肽模拟表位C2-15与EmGFP融合表达,制备了两种荧光重组模拟表位:C2-15-EmGFP（多肽位于N端）和EmGFP-C2-15（多肽位于C端）。两种重组模拟表位与mAb 1E7亲和性相似,但C2-15-EmGFP的产率更高,用于建立了一种磁分离荧光免疫分析（MSFIA）。MSFIA的IC50、LOD和线性范围分别为11.0、1.87和1.87～66.0 ng mL-1,略高于基于噬菌体展示多肽的P-ELISA（IC50=4.02 ng mL-1）。MSFIA操作简单、分析时间短,适合用于高通量检测。该检测方法对除吡虫啉外的氯噻啉结构类似化合物均无明显交叉反应。此外,MSFIA对稻田水、土壤、糙米和黄瓜样品中氯噻啉的平均添加回收率在75.3～114%之间。MSFIA对黄瓜真实样品中氯噻啉残留量的检测结果与高效液相色谱的检测结果一致性高。5、基于氯噻啉荧光重组模拟表位的双信号侧流免疫层析方法的建立使用C2-15-EmGFP建立了一种基于荧光猝灭的双信号免疫层析试纸条（FQICS）。C2-15-EmGFP（含有His tag）作为荧光供体,mAb 1E7标记的胶体金做为荧光猝灭剂,抗His tag抗体作为检测（T）线用于捕获重组多肽,羊抗鼠IgG抗体作为质控（C）线用于捕获mAb 1E7。多肽与抗体的结合使荧光淬灭,T线出现胶体金累积产生的色度信号;氯噻啉的存在使多肽与抗体解离,色度信号减弱,荧光信号恢复。分别通过视觉和ImageJ软件对FQICS的色度和荧光信号进行分析,其中荧光信号的强度与分析物浓度呈正比,色度的强度与分析物的浓度成反比。ImageJ的定量分析结果显示,色度信号的敏感性（ICs0=9.62 ngmL-1）和荧光信号的敏感性（半数饱和浓度,SC50=10.1 ng mL-1）相似。通过肉眼进行视觉检测的结果表明,荧光信号（8.00 ng mL-1）比色度信号的灵敏度（64.0 ngmL-1）提高了 8倍。FQISC对土壤和小麦样品中氯噻啉的平均添加回收率在80.1～97.5%之间。此外,FQICS对土壤和小麦真实样品中氯噻啉残留量的检测结果与高效液相色谱的检测结果具有很好的一致性。研究结果表明荧光信号“turn-on”模式的双信号试纸条提高了视觉检测的敏感性,同时也使得检测结果更加直观。
平芳[4]（2020）在《靶向乙型肝炎病毒核心蛋白定量检测方法的研究》文中研究表明乙型肝炎（hepatitis B）是一种由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）引起的全球范围的传染病,主要在肝脏发生病变。临床上,通过检测HBV血清标志物来辅助判断HBV感染与否、评价预后、治疗方案和药物反应等。近年来随着越来越多的研究,乙肝病毒核心蛋白（hepatitis B core protein,HBc）作为新型检测HBV手段受到广泛关注。HBc单体构成同型二聚体,进一步包裹前基因组RNA（pregenome RNA,pgRNA）和HBV聚合酶组装为正20面体的核壳体。核壳体腔内包含HBV松弛环状DNA（relax circular DNA,rcDNA）和病毒聚合酶的复合体,最终和HBV包膜蛋白（hepatitis B surface protein,HBs）相互作用形成成熟病毒颗粒。HBV感染肝脏机制的深入研究发现,HBc尤为重要。目前乙肝病毒学界的共识认为,HBc的表达量与肝细胞核内HBV共价闭合环状DNA（covalenty closed circular DNA,cccDNA）的功能活性正相关,通过定量检测HBc可以指示慢性乙肝患者体内cccDNA是否已经被清除或功能性失活。正对上述问题,我们在外源表达HBc新方法、靶向HBc特异性抗体和HBc定量检测这三方面内容开展相关研究工作。第一部分乙型肝炎病毒核心蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达目的:研究枯草芽孢杆菌中分泌表达重组HBc可行性。方法:1.HBc基因插入pBES-DNA穿梭质粒的MCS区域,获得pBES/HBc重组质粒。2.将pBES/HBc重组质粒酶切线性化后与信号肽DNA（Signal peptide library,SP DNA）库进行连接,连接产物转化stellar感受态细胞,收获全部阳性菌落并提取混合质粒。3.将混合质粒用化转的方法转入枯草芽孢杆菌RIK1285感受态细胞,检测信号肽,将包含不同信号肽的菌液进行放大培养,收集培养上清检测HBc分泌量。结果:重组HBc在枯草芽孢杆菌培养上清中存在,且有不同状态;经Western blot发现,Anti-HBc可以上清中重组HBc进行结合,具有高度特异性。结论:重组HBc在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达,而且重组HBc蛋白表现出与天然状态类似的生物学活性。第二部分靶向乙型肝炎病毒核心蛋白的单链抗体库的构建目的:用T7噬菌体文库筛选的方法,建立靶向HBc单链抗体库。方法:1.将重组HBc/183和HBc/149作为抗原,免疫Balb/c雌性小鼠（6-8周）8周后,提取小鼠脾细胞mRNA,逆转录为cDNA。2.设计引物,cDNA作为模板,进行第一步PCR反应后,分别获得轻链可变区（VL）,重链可变区（VH）基因DNA片段,进行第二步重叠延伸PCR技术（SOE PCR）反应,将轻链和重链拼接得到单链抗体（ScFv）基因库。3.ScFv基因片段双酶切后与T7Select10-3b连接,构成原代重组T7噬菌体库。4.重组HBc/183和HBc/149作为固相抗原与重组T7噬菌体进行亲和筛选,通过3轮筛选,富集得到与HBc/183和HBc/149结合的噬菌体文库,挑选重组T7噬菌体进行ELISA检测,筛选出亲和性高的重组T7噬菌体,对ScFv进行测序。结果:通过igblast软件分析ScFv基因片段框架区（FR）和互补决定区（CDR）的氨基酸序列。高富集氨基酸序列用来制备ScFv抗体库。结论:得到与重组HBc/183和HBc/149高亲和性结合的ScFv氨基酸序列,为临床检测HBc作基础。第三部分靶向乙型肝炎病毒核心蛋白的抗体对的筛选目的:筛选出靶向HBc的抗体对,用于HBc定量检测。方法:1.制备靶向HBc不同基因片段的亲和性抗体,共23种,其中1-14号靶向HBc蛋白C端150-183氨基酸区域,23-31号靶向HBc蛋白N端1-149氨基酸区域。2.每个ELISA平板与除其自身之外的ALP标记抗体形成抗体对,采用固定在平板上的抗体-抗原-ALP标记抗体模式,检测HBc。3.PBS作为对照组,不同ng级别的HBc样本组。用化学发光的方法检测不同组合的抗体对的发光值,筛选高亲和性的抗体对。结果:进行统计学分析,从中选出亲和性较高的抗体对。结论:不同抗体组对于HBc蛋白的亲和性不同,不同抗体组对于HBc蛋白不同检测限的检测有统计学意义。
朱锡群,易伟[5]（2018）在《应用T7噬菌体展示技术筛选与sLRIG1亲和结合蛋白》文中进行了进一步梳理目的用T7噬菌体展示技术（phage-displayed technique,PDT）筛选与可溶性多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1（soluble leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1,s LRIG1）相互作用的蛋白,为进一步研究sLRIG1作用于人脑胶质瘤的机制找到突破点。方法利用BacPAK6杆状病毒蛋白表达系统（baculovirus expression system,BEVS）获得人sLRIG1重组蛋白,以该蛋白为靶标,采用亲和淘洗方法经6轮筛选人肝细胞cDNA T7噬菌体展示文库;随机挑选96个筛选到的噬菌体行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段并送测序。结果经过6轮筛选,噬菌体投入和产出量比达1. 85×106PFU,趋于稳定。回收的DNA片段多在250～750bp,纯化回收后得到35个克隆样本,送测序后得到35条有效表达序列标签,对其行同源性搜索及功能预测等生物信息学分析,最终获得12个可能与sLRIG1蛋白有相互作用的蛋白或多肽,这些蛋白大多与肿瘤相关。结论通过PDT可获得与sLRIG1蛋白相互结合的蛋白,这些结果为下一步研究sLRIG1的生物功能及其对人脑胶质瘤的作用及机制奠定了基础。
常洋涛[6]（2018）在《基质γ-羧基谷氨酸蛋白（MGP）相互作用蛋白的筛选研究》文中认为肾结石是泌尿外科常见病,发病率仅次于尿路感染和前列腺疾病,是泌尿外科第三大多发病,且具有较高复发率,临床常表现为肾脏功能损害和尿路梗阻。目前肾结石疾病的形成机制尚不明确,已有研究表明蛋白质与肾结石形成密切相关,在结石的形成过程中发挥着重要作用。基质γ-羧基谷氨酸蛋白（MGP）是由多个谷氨酸残基构成的维生素K依赖的分泌蛋白,在人体中多个组织器官中均有表达。目前已经确认其在调节细胞外基质钙化过程中起重要作用,且已发现其对血管钙化有抑制作用,并可能与骨形态发生蛋白-2（Bone Morphogenetic Protein,BMP-2）的相互作用有关。一些研究发现MGP蛋白与肾结石形成也有密切相关性,其可能有抑制结晶形成的功能,但分子机制尚不清楚。而系统筛选和研究MGP的相互作用蛋白,能进一步阐明其与肾结石形成的关系和分子机制。因此本实验拟通过T7噬菌体展示系统从人cDNA文库中钓取MGP相互作用蛋白,并对其与互作蛋白之间的相互作用进行初步研究。首先,我们以pT7CFE1-NHis-GST-CHA为载体构建哺乳动物真核表达系统用的MGP表达质粒pT7CFE1-NHis-GST-CHA-MGP,通过蛋白体外表达系统得到大量的人源MGP蛋白。接着以体外表达得到的人MGP蛋白为诱饵蛋白,在ELISA板上进行包被,然后使用人cDNA文库T7噬菌体展示系统,筛选可能与MGP存在相互作用的多肽,Phage EILSA法进一步筛选验证所得多肽是否与MGP存在相互作用,筛选确认了SLC27A6等12个与MGP可能存在相互作用的候选互作蛋白。最后利用分子模拟的方法对MGP蛋白及SLC27A6进行了同源建模和分子对接研究,在计算机水平上确认了其存在相互作用,并初步研究了其蛋白相互作用的方式。综上所述,本实验成功构建了MGP的高效表达质粒,并在体外实现了MGP蛋白的高效表达,再以得到的MGP蛋白为诱饵蛋白,利用T7噬菌体表达筛选系统在体外成功的筛选验证得到了MGP的12个候选相互作用蛋白,为进一步研究MGP蛋白抑制肾结石形成的分子机制以及其他生理功能奠定了基础。
刘文丽[7]（2018）在《基于噬菌体展示技术的亲和多肽筛选及其在肿瘤识别中的应用》文中研究说明噬菌体展示技术是一种功能强大的分子文库展示技术,可针对特定的靶标有效地筛选出特异性的多肽或蛋白分子。由于多肽分子具有分子量小、易合成修饰、生物免疫原性低等优点,因此多肽作为一种生物识别分子被广泛应用于生物医学领域。常见的生物识别分子,如抗体虽然亲和力高、特异性好,但分子量大、提取方法复杂,核酸适体虽然灵活性高,但其二级结构和结合效果易受周围环境的影响,因此多肽作为生物识别分子具有独特的优势。目前肿瘤相关问题是人们关注的热点,肿瘤标志物作为一种与肿瘤的发生密切相关的生物标志物,常用于肿瘤的诊断、监测和预后,因此以肿瘤标志物为靶标筛选出特异性的多肽识别分子具有重要意义。传统的噬菌体展示技术主要是将靶标固定在固相载体上,经过多轮淘选以获得具有结合能力的噬菌体克隆,虽然该技术能有效地筛选出具有特异性亲和能力的多肽,但是筛选过程中存在文库易偏向性扩增、易交叉污染、单克隆的挑取和验证步骤繁琐等问题,因此如何发展出快速、高效、简单的筛选新方法是目前噬菌体展示技术亟待解决的一个重要问题。本论文以发展噬菌体展示技术新方法及其应用为研究目标,结合微流控技术,建立快速、高效、高通量、自动化的噬菌体展示技术新平台。本工作主要展开了以下两个工作:（1）利用传统的噬菌体展示技术以肿瘤标志物为靶标进行筛选,并筛选得到了对应的特异性结合多肽。分别针对蛋白CD71和c-Met筛选得到了具有特异性的识别多肽,并模拟了其二级结构,为了考察这些多肽分子的结合能力,对其结合能力、特异性以及对肿瘤细胞的识别能力进行了分析。（2）结合微流控芯片试剂消耗量少、通量高、易集成等优势,建立了基于液滴微流控噬菌体展示技术新方法。根据微流控相关理论,设计了一种具有螺旋结构的双入口十字交叉芯片,用于液滴的生成。以CD71为靶标,先在芯片外对噬菌体文库进行预富集,再对预富集的文库实现芯片上的筛选。利用微流控液滴生成技术,将单个分散的噬菌体和包被了靶标的微球一起包裹到微液滴中,利用液滴中的宿主菌对噬菌体进行大量扩增实现信号放大,当融合噬菌体与靶标具有结合能力时噬菌体可以结合到微球表面,最后破乳收集微球并对噬菌体核酸染色,荧光显微镜下挑取微球直接获得具有结合能力的单克隆。通过该方法最后获得了具有特异性结合能力的多肽,并进一步对这些多肽的结合能力进行了分析考察。这种筛选新方法具有液滴生成快速、通量高、试剂消耗少的优点,还降低了交叉污染的风险,提高了筛选效率。
陈晶[8]（2016）在《抗黄曲霉毒素B1单链抗体噬菌体库的构建、筛选及性质分析》文中研究说明黄曲霉毒素 B1（Aflatoxin B1,AFB1）是一类由寄生曲霉（Aspergillusparasiticus,Aparasiticus）和产毒黄曲霉（Aspergillus flavus,A.flavus）等产生的有毒次级代谢产物,具有较强的致癌性和毒性,且结构非常稳定,一般高温加热都不能将其破坏,对人畜的生命安全具有严重的威胁。而在现阶段,无法通过有效的方法保证食品完全不受AFB1的污染,所以,世界上绝大多数国家都制定了食品和饲料中AFB1的最大允许含量,并积极探索快速、高效检测产品中AFB1含量的方法。在众多的检测方法中,采用免疫学原理进行检测的方法由于其成本较低、灵敏度高、操作简单快速等优点而成为研究热点。免疫学检测依赖于高亲和力、高特异性的抗体,由于传统抗体制备过程耗时长、价格昂贵、具有安全隐患等弊端,促使人们大力开发基因工程抗体。作为第三代基因工程抗体之一的单链抗体（Singlechain Fvfragment,ScFv）由于免疫原性低、分子量小、易于改造和表达而受到人们的广泛关注。噬菌体展示抗体库技术具有操作简单,库容量大,筛选通量高等优点,直接从噬菌体抗体库中筛选出有具有较高亲和力的单链抗体,为人们获得高质量抗体提供了强有力的技术支撑。本课题以AFB1为研究对象,从AFB1-BSA免疫小鼠的脾细胞内扩增ScFv基因,将ScFv片段插入pCANTAB5e载体中,应用噬菌体展示技术筛选抗AFB1-ScFv,并对其性质进行分析,研究结果如下。1抗AFB1单链抗体基因文库的构建采用AFB1-BSA完全抗原免疫Balb/c小鼠,免疫5次后,断尾取血分离抗血清,以ELISA法检测抗血清的效价和灵敏度,在第五次免疫后抗血清效价最高达到25600,灵敏度最高为35.5 ng/mL。提取小鼠脾细胞RNA,反转录生成cDNA,利用简并引物分别扩增出小鼠抗体的全套重链可变区和轻链可变区基因片段,采用重叠延伸 PCR（Gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）连接成完整的ScFv基因。利用SifI和Notl两个酶切位点将ScFv基因与pCANTAB5e载体连接后转化E.coli TGl,构建抗AFB1单链抗体基因文库,根据抗性平板上的转化子数量计算得出ScFv基因文库库容为5×l06 cfu/mL。2抗AFB1 ScFv噬菌体文库的构建、筛选及鉴定使用辅助噬菌体M13KO7感染带有ScFv基因文库的E.coli TG1,培养后离心,沉析上清液,得到初级单链抗体噬菌体库,实验测得库容约为2×l013 pfu/mL。使用抗原AFB1-OVA,对获得的单链抗体噬菌体库进行筛选,经过五轮筛选后,得到了两个呈阳性的单链抗体噬菌体,分别为ScFv-A和ScFv-B,提取质粒后测序得到两个单链抗体的核酸序列。3抗AFB1 ScFv的性质分析根据ScFv核酸序列推导得出氨基酸序列,将氨基酸序列输入SWISS-MODEL服务系统中,通过序列比对得到与ScFv同源性较高的序列。将相似性较高的多肽序列作为模板,利用Discovery Studio（DS）软件模拟得到ScFv-A和ScFv-B蛋白的三维结构。再将其三维结构与抗原AFB1进行分子对接,预测得到ScFv-A中重链可变区33位的Trp和106位的Ser,ScFv-B重链可变区33位的Tyr、52位的Ser、102位的Tyr在与AFB1结合时起关键作用。。构建重组表达载体pET-30a-ScFv-A和pET-30a-ScFv-B,转化菌株E.coli BL21（DE3）,纯化表达目的蛋白,利用SDS-PAGE和ELISA对目的蛋白进行性质分析,结果表明,两种单链抗体均可在E.coli BL21中表达出有活性的可溶性蛋白,大小约为30 kDa。采用间接竞争ELISA进行分析,结果表明ScFv-A和ScFv-B的灵敏度分别约为72 μg/mL和60 μg/mL。
朱有葱[9]（2015）在《生殖支原体MgPa特异性结合多肽的筛选、鉴定与人尿道上皮细胞cDNA文库的构建》文中指出生殖支原体（Mycoplasma genitalium,Mg）是介于病毒与细菌之间、缺乏细胞壁、呈高度多型性,可在无生命培养基中繁殖的原核细胞型微生物,可引起泌尿生殖系统感染,被归类于性传播疾病病原体之一。近年来,Mg感染率呈现上升趋势,但目前仍然没有满足临床需要的药物和疫苗可供使用。Mg最关键的外膜粘附蛋白为生殖支原体粘附素蛋白（Mg Pa）,其C端具有较强的免疫原性,自发性的无细胞黏附活性的Mg突变株则缺乏Mg Pa,因此,Mg Pa在Mg的致病性方面起着至关重要的作用。本研究利用构建好的原核表达载体PET-30a（+）/Mg Pa在大肠杆菌中诱导表达Mg Pa的重组蛋白（r Mg Pa）,采用噬菌体展示随机肽库技术筛选Mg Pa重组蛋白的特异性结合多肽,并对筛选到的特异性多肽进行鉴定。本研究目的:1、利用课题组前期构建好的含生殖支原体粘附素蛋白（Mg Pa）优势表位（1 0751 364 aa）的重组载体,表达并纯化Mg Pa,为研究Mg Pa的生物学功能奠定前期实验基础。2、利用噬菌体展示随机肽库筛选并鉴定Mg Pa的特异性结合多肽,为研究Mg Pa的致病机制提供实验依据。3、构建人尿道上皮细胞（SVHUC-1）的T7噬菌体展示c DNA文库,为研究人尿道上皮细胞与生殖支原体的相互作用奠定基础。本研究方法:1、利用课题组前期构建好的含生殖支原体粘附素蛋白（Mg Pa）优势表位（1 0751 364aa）重组载体（r Mg Pa）的重组菌株,用IPTG诱导表达r Mg Pa,用SDA-PAGE和Western blot进行分析与鉴定,再经Ni-NAT亲和层析纯化柱纯化重组蛋白,最后用BCA法测定其浓度。2、以r Mg Pa为靶分子,对噬菌体展示随机12肽库和7肽库进行3轮生物淘选,收集淘选后的噬菌体,对其进行扩增培养,利用碘化钠法提取并纯化噬菌体克隆的单链DNA,并进行DNA测序分析,推导出展示在噬菌体表面的外源性氨基酸序列。用ELISA、竞争性结合实验和斑点印迹实验等方法检测阳性噬菌体与r Mg Pa结合的特异性。3、用Trizol试剂提取SV-HUC-1细胞总RNA,分离纯化出m RNA,经反转录合成得到其双链c DNA,在双链c DNA末端加上定向的Eco RⅠ/HindⅢ黏性末端,然后收集并纯化200bp以上的双链c DNA片段,连接于T7噬菌体载体,经体外包装后转入BLT5403宿主菌,构建成T7噬菌体展示c DNA文库。本研究结果1、SDS-PAGE显示,Mg Pa的重组菌株在IPTG诱导下成功表达出一分子量约为37k D的目的蛋白（含6×His）,利用Ni-NAT纯化柱纯化后获得了纯度较高的目的蛋白,用BCA法经核酸蛋白仪测定,其浓度达到1900μg/m L。2、利用r Mg Pa对噬菌体展示随机12肽库进行3轮生物淘选,第一轮至第三轮淘选的产率依次为1.78×10-6、8.0×10-6、7.3×10-5,说明噬菌体克隆有明显富集;随机挑取了38个噬菌体克隆扩增,提取单链DNA进行测序分析,结果表明38个噬菌体展示外源肽序列中有2组一致性的核心序列,分别为:V-H-W-D-F-R-QW-W-Q-P-S和D-W-S-S-W-V-Y/H-R-D-P-Q-T/S。噬菌体展示随机7肽库中筛选到了一条核心序列:H-Y-I-D-F-R-W。3、ELISA实验的结果显示:在从噬菌体随机12肽库中筛选到的11个代表性克隆中,有10个（P1P10）与r Mg Pa的结合较高,为阳性噬菌体克隆;竞争性结合实验的结果表明,10个阳性噬菌体克隆与r Mg Pa重组蛋白的特异性结合能被不同稀释比例的抗r Mg Pa抗体部分抑制,且随着其稀释比例的增加其抑制效果相应的下降;斑点印迹实验检测阳性噬菌体均能与r Mg Pa发生特异性结合。4、将文库扩增后,用噬斑实验检测SV-HUC-1细胞T7噬菌体展示c DNA文库的库容,结果为1.2×106pfu/cm3;用PCR鉴定随机挑取的噬菌斑,计算其重组率达93.75%,且插入片段都大于200bp。本研究结论:1、成功表达并纯化出了分子量为37k D、浓度为1 900μg/m L的重组蛋白r Mg Pa。2、成功筛选到了能与Mg Pa特异性结合的2条12肽:（V-H-W-D-F-R-Q-W-W-Q-P-S和D-W-S-S-W-V-Y/H-R-DP-Q-T/S）和1条7肽（H-Y-I-D-F-R-W）。3、成功构建了SVHUC-1细胞T7噬菌体展示c DNA文库,为研究Mg与人尿道上皮胞相互作用受体奠定实验基础。
唐瑞,杨勇波[10]（2014）在《噬菌体展示技术筛选人肠道病毒71型3A蛋白相互作用蛋白》文中研究指明目的利用T7噬菌体展示技术筛选与人肠道病毒71型3A蛋白相互作用的蛋白。方法构建3A蛋白的原核表达载体,表达并纯化3A蛋白,以3A蛋白为靶蛋白,应用T7噬菌体展示技术对人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到产物进行DNA序列分析及同源性研究。结果表达并纯化了3A蛋白,经过4轮筛选后,选择37个阳性克隆,采用T7特异性引物扩增插入片段,将PCR产物送公司进行测序。经过同源性分析,确定了2个与人肠道病毒3A蛋白相互作用蛋白。结论通过T7噬菌体展示技术可以得到与3A蛋白相互作用蛋白,通过研究此蛋白的功能就可以初步推测出3A蛋白可能的功能,为进一步研究人肠道病毒的致病机制鉴定了基础。
二、用T7噬菌体展示筛选系统筛选与靶蛋白相结合的蛋白（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用T7噬菌体展示筛选系统筛选与靶蛋白相结合的蛋白（论文提纲范文）
（1）利用rAAV-SaCas9系统敲除肌细胞的myostatin基因并评价其对肌肉萎缩的改善作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1.CRISPR系统的发展、作用机制和优点 |
| 1.1 CRISPR系统的发现和发展 |
| 1.2 CRISPR系统的基本结构 |
| 1.3 CRISPR/Cas多样性和分类 |
| 1.4 CRISPR系统作用机制 |
| 1.5 CRISPR/Cas系统的运送载体 |
| 1.6 CRISPR/Cas9 系统的应用 |
| 1.7 风险问题与改进方法 |
| 2.MSTN结构以及相关信号通路 |
| 2.1 MSTN简介 |
| 2.2 MSTN的分类及结构 |
| 2.3 MSTN对肌源细胞的影响 |
| 2.4 MSTN对骨骼肌相关信号通路的影响 |
| 2.5 MSTN与肌肉萎缩性疾病的治疗 |
| 第一章 敲除Myostatin基因的C2C12 单克隆细胞系的增殖变化 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 细胞和质粒 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 sgRNA在 Mstn基因打靶位点的设计 |
| 2.5 载体的构建 |
| 2.6 细胞复苏,培养以及转染 |
| 2.7 DNA酶切及测序鉴定 |
| 2.8 嘌呤霉素基因插入重组载体 |
| 2.9 质粒转染C2C12细胞 |
| 2.10 RT-PCR分析 |
| 2.11 Western blot分析 |
| 2.12 CCK-8测定C2C12细胞增殖活力 |
| 2.13 PI测定C2C12细胞生长周期 |
| 2.14 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 sgRNA位点的筛选与酶切效率鉴定 |
| 3.2 pX601-SaCas9-puro-sgRNA载体构建 |
| 3.3 T7酶切鉴定基因编辑效率及测序结果 |
| 3.4 Mstn基因敲除的C2C12 细胞系测序鉴定 |
| 3.5 MSTN蛋白表达鉴定 |
| 3.6 CCK-8法检测细胞增殖 |
| 3.7 流式分析MSTN基因敲出的C2C12 细胞周期的变化 |
| 3.8 RT-PCR和 Western Bloting检测C2C12 细胞相关细胞生长因子的表达 |
| 4 讨论 |
| 第二章 重组rAAV-SaCas9 基因编辑系统在体内外的表达并靶向敲除肌肉Myostatin基因改善肌肉萎缩 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 细胞、小鼠和质粒 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 载体的构建 |
| 2.5 细胞培养和转染 |
| 2.6 CRISPR/Cas9 系统的重组AAV的包装及纯化 |
| 2.7 rAAV-DJ/8 在体外的转导 |
| 2.8 rAAV9在体内转导 |
| 2.9 建立小鼠肌肉萎缩模型 |
| 2.10 DNA酶切及测序鉴定 |
| 2.11 靶向深度测序分析 |
| 2.12 细胞及肌肉组织蛋白质提取及Western Bloting分析 |
| 2.13 组织学和免疫荧光分析 |
| 2.14 小鼠肌肉重量 |
| 2.15 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 SaCas9系统重组载体的构建以及打靶位点筛选 |
| 3.2 重组SaCas9系统在体外基因组编辑效率 |
| 3.3 rAAV-DJ/8-SaCas9 感染C2C12 细胞及eGFP蛋白表达 |
| 3.4 rAAV-DJ/8-SaCas9 感染的C2C12 细胞中Mstn基因的敲除效果 |
| 3.5 rAAV9-SaCas9 感染小鼠肌细胞及eGFP蛋白的表达 |
| 3.6 rAAV9-SaCas9 感染的小鼠肌细胞中Mstn基因的敲除效果 |
| 3.7 rAAV9-SaCas9 对肌肉萎缩小鼠的肌肉质量的作用 |
| 3.8 rAAV9-SaCas9 对肌肉萎缩细胞的作用效果 |
| 3.9 rAAV9-SaCas9 在小鼠组织中的扩散 |
| 3.10 rAAV9-SaCas9 在基因组中的脱靶概率 |
| 4.讨论 |
| 第三章 AAV-SaCas9 介导的Myostatin基因编辑对老年小鼠肌肉萎缩的改善作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 载体构建 |
| 2.5 细胞培养和转染 |
| 2.6 载有CRISPR/Cas9 系统的rAAV包装 |
| 2.7 rAAV的纯化与滴度测定 |
| 2.8 rAAV9在体内转导 |
| 2.9 DNA酶切及测序鉴定 |
| 2.10 靶向测序分析 |
| 2.11 RT-PCR分析 |
| 2.12 Western Bloting分析 |
| 2.13 组织学和免疫荧光分析 |
| 2.14 小鼠肌肉重量 |
| 2.15 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 重组SaCas9系统基因编辑载体的构建 |
| 3.2 重组SaCas9系统对基因的编辑效率 |
| 3.3 rAAV-SaCas9 对老龄鼠肌细胞Mstn基因的敲除效率 |
| 3.4 rAAV-SaCas9 对老龄鼠骨骼肌质量的影响 |
| 3.5 老龄鼠肌细胞Mstn基因敲除后对细胞形态的影响 |
| 3.6 Mstn缺失对衰老龄鼠肌细胞周期以及相关信号通路的影响 |
| 3.7 Mstn缺失通过激活肌源性细胞因子促进细胞增殖和分化 |
| 3.8 Mstn缺失通过抑制泛素-蛋白酶体连接酶减少肌细胞中蛋白降解 |
| 4.讨论 |
| 总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
（3）氯噻啉模拟表位多肽的研制与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 农药残留 |
| 1.1 农药残留的危害 |
| 1.2 我国农药残留的现状 |
| 2 农药残留检测技术 |
| 2.1 色谱分析法 |
| 2.2 生物测定法 |
| 2.3 酶抑制法 |
| 2.4 免疫分析法 |
| 3 农药等小分子的免疫检测技术的研究进展 |
| 3.1 农药等小分子免疫检测的主要模式 |
| 3.2 农药等小分子竞争免疫分析中核心试剂的研究进展 |
| 3.3 农药等小分子免疫检测方法的研究进展 |
| 4 噬菌体展示肽库技术的研究进展 |
| 4.1 噬菌体展示系统原理 |
| 4.2 噬菌体展示系统的分类 |
| 4.3 噬菌体展示肽库的筛选 |
| 4.4 噬菌体展示肽在农药等小分子的免疫检测中的应用 |
| 5 氯噻啉残留检测现状 |
| 5.1 氯噻啉概况 |
| 5.2 氯噻啉残留检测概况 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 氯噻啉噬菌体展示多肽模拟表位的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验试剂与仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 噬菌体展示随机肽库的淘选与鉴定 |
| 2.2 阳性克隆的敏感性测定 |
| 3 讨论与结论 |
| 第三章 氯噻啉噬菌体酶免疫分析方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验试剂与仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 化学发光的发光光谱与动力曲线 |
| 2.2 噬菌体与包被抗体用量优化 |
| 2.3 反应缓冲液优化 |
| 2.4 标准曲线 |
| 2.5 特异性 |
| 2.6 添加回收率 |
| 2.7 HPLC一致性 |
| 3 讨论与结论 |
| 第四章 氯噻啉生物发光重组模拟表位的研制及生物发光免疫分析方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验试剂与仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组模拟表位的表达与纯化 |
| 2.2 重组模拟表位与mAb1E_7的亲和性及敏感性测定 |
| 2.3 生物发光的发光光谱与动力曲线 |
| 2.4 甲醇浓度优化 |
| 2.5 标准曲线 |
| 2.6 特异性 |
| 2.7 添加回收率 |
| 2.8 HPLC一致性 |
| 3 讨论与结论 |
| 第五章 氯噻啉荧光重组模拟表位的研制及磁分离荧光免疫分析方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验试剂与仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组模拟表位的表达与纯化 |
| 2.2 重组模拟表位与抗体亲和性及敏感性测定 |
| 2.3 重组模拟表位解离时间优化 |
| 2.4 甲醇浓度优化 |
| 2.5 标准曲线 |
| 2.6 特异性 |
| 2.7 添加回收率 |
| 2.8 HPLC一致性 |
| 3 讨论与结论 |
| 第六章 基于氯噻啉荧光重组模拟表位的双信号侧流免疫层析的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验试剂与仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 FQICS原理 |
| 2.2 氯噻啉抗体与胶体金的偶联鉴定 |
| 2.3 荧光重组模拟表位与标记后胶体金用量优化 |
| 2.4 甲醇浓度优化 |
| 2.5 标准曲线 |
| 2.6 特异性 |
| 2.7 添加回收率 |
| 2.8 HPLC一致性 |
| 3 讨论与结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ: 文中各类缩写的中英文全称对照表 |
| 附录Ⅱ: 各种缓冲溶液及培养基配制方法 |
| 附录Ⅲ: 攻读学位期间取得的学术成果 |
| 基金项目 |
| 致谢 |
（4）靶向乙型肝炎病毒核心蛋白定量检测方法的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 乙型肝炎病毒核心蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 靶向乙型肝炎病毒核心蛋白的单链抗体库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 靶向乙型肝炎病毒核心蛋白的抗体对的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果及发表论文 |
（5）应用T7噬菌体展示技术筛选与sLRIG1亲和结合蛋白（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
（6）基质γ-羧基谷氨酸蛋白（MGP）相互作用蛋白的筛选研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 0.1 肾结石疾病概述 |
| 0.2 蛋白与肾结石形成 |
| 0.3 基质γ-羧基谷氨酸蛋白(MGP)及其与肾结石的关系 |
| 0.4 MGP与其它蛋白的相互作用 |
| 0.5 T7噬菌体展示系统 |
| 0.6 分子模拟技术用于研究蛋白相互作用 |
| 0.7 研究的目的与意义 |
| 第1章 重组质粒pT7CFE1-NHis-GST-CHA-MGP的构建及MGP蛋白的体外表达 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 重组质粒pT7CFE1-NHis-GST-CHA-MGP的构建 |
| 1.1.2 1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit体外表达MGP蛋白 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 生化试剂耗材 |
| 1.2.2 主要仪器设备 |
| 1.2.3 试剂的配制 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 pMD19-MGP和pT7CFE1-NHis-GST-CHA质粒的转化、扩增 |
| 1.3.1.1 质粒转化 |
| 1.3.1.2 质粒小量提取 |
| 1.3.1.3 质粒酶切验证 |
| 1.3.1.4 质粒中提扩增 |
| 1.3.2 片段回收 |
| 1.3.3 酶连重组 |
| 1.3.4 重组质粒的酶切验证和序列测定 |
| 1.3.5 1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit表达MGP |
| 1.3.5.1 实验前质粒样本纯化 |
| 1.3.5.2 高效表达MGP蛋白 |
| 1.3.5.3 BCA法测定表达MGP蛋白的浓度 |
| 1.3.6 Pierce~(TM) HRV 3C Protease 1000 Unit Kit纯化MGP蛋白 |
| 1.3.7 纯化后MGP蛋白Western Blot检测 |
| 1.4 实验结果与讨论 |
| 1.4.1 重组质粒pT7CFE1-NHis-GST-CHA-MGP的构建 |
| 1.4.1.1 质粒pMD19-MGP的双酶切验证结果 |
| 1.4.1.2 pMD19-MGP质粒和pT7CFE1-NHis-GST-CHA质粒中提后的双酶切验证结果 |
| 1.4.1.3 重组质粒pT7CFE1-NHis-GST-CHA-MGP的双酶切验证结果 |
| 1.4.2 BCA法测定MGP蛋白浓度 |
| 1.4.3 Western Blot检测纯化后MGP蛋白 |
| 1.5 结论 |
| 第2章 T7噬菌体展示系统筛选MGP蛋白相互作用蛋白 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 生化试剂及耗材 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌BLT5403的扩增和保存 |
| 2.3.1.1 大肠杆菌BLT5403的复苏 |
| 2.3.1.2 大肠杆菌BLT5403生长曲线测定 |
| 2.3.1.3 大肠杆菌BLT5403的保存 |
| 2.3.2 T7噬菌体的扩增和保存 |
| 2.3.3 噬菌体的滴度测定 |
| 2.3.3.1 T7原始噬菌体滴度测定 |
| 2.3.3.2 扩增后的T7噬菌体滴度测定 |
| 2.3.4 噬菌体展示技术可行性实验 |
| 2.3.5 阳性对照实验 |
| 2.3.6 MGP蛋白的包被和生物淘洗 |
| 2.3.6.1 MGP蛋白的包被 |
| 2.3.6.2 生物淘洗 |
| 2.3.7 噬菌斑DNA提取与序列测定 |
| 2.3.7.1 噬菌斑DNA的提取 |
| 2.3.7.2 噬菌斑DNAPCR扩增与序列测定 |
| 2.3.7.3 噬菌斑DNAPCR扩增后的胶回收 |
| 2.3.8 PhageELISA法进一步筛选与验证MGP相互作用蛋白 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 人cDNA文库T7噬菌体的初始滴度测定结果 |
| 2.4.2 人cDNA文库T7噬菌体的扩增后的滴度测定结果 |
| 2.4.3 噬菌体展示技术可行性实验结果 |
| 2.4.4 噬菌体展示阳性对照实验结果 |
| 2.4.5 生物淘洗过程中的噬菌体滴度测定结果 |
| 2.4.6 噬菌斑DNAPCR扩增的结果 |
| 2.4.7 噬菌斑DNA序列测定结果 |
| 2.4.8 Phage ELISA法进一步筛选与验证MGP相互作用蛋白 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 分子模拟方法对MGP及其候选互作蛋白SLC27A6的初步研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 MODELLER |
| 3.1.2 Z-DOCK |
| 3.1.3 MGP蛋白结构 |
| 3.1.4 SLC27A6蛋白 |
| 3.2 模拟方法 |
| 3.2.1 蛋白质同源建模 |
| 3.2.2 分子对接 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 MGP和SLC27A6蛋白结构的同源建模 |
| 3.3.2 MGP与SLC27A6蛋白对接结果分析 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 结果与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表学术论文及参加科研情况 |
（7）基于噬菌体展示技术的亲和多肽筛选及其在肿瘤识别中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 分子文库展示技术 |
| 1.1.1 分子文库展示技术的意义 |
| 1.1.2 分子文库展示技术 |
| 1.2 噬菌体展示系统及其应用 |
| 1.2.1 噬菌体展示简介 |
| 1.2.2 噬菌体展示系统 |
| 1.2.3 噬菌体展示技术在生物医学中的应用 |
| 1.3 基于微流控的噬菌体展示技术 |
| 1.3.1 微流控简介 |
| 1.3.2 微流控在噬菌体展示中的意义 |
| 1.3.3 微流控在噬菌体展示中的应用 |
| 1.4 论文的研究目的及主要设想 |
| 第二章 CD71特异性多肽的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 仪器、材料和试剂 |
| 2.2.2 噬菌体筛选流程 |
| 2.2.3 噬菌体滴度的测定 |
| 2.2.4 噬菌体文库的富集 |
| 2.2.5 噬菌体单克隆的挑取和结合力验证 |
| 2.2.6 噬菌体克隆的DNA提取及序列分析 |
| 2.2.7 多肽的表征 |
| 2.2.8 siRNA沉默肿瘤细胞CD71的表达 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 噬菌体文库的富集情况 |
| 2.3.2 噬菌体单克隆的结合力表征 |
| 2.3.3 测序结果及分析 |
| 2.3.4 多肽与CD71的亲和能力分析 |
| 2.3.5 多肽与肿瘤细胞的结合能力分析 |
| 2.3.6 肿瘤细胞对多肽的内吞情况考察 |
| 2.3.7 多肽的特异性考察 |
| 2.3.8 多肽Y1的竞争实验 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 c-Met亲和多肽的筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 仪器、材料和试剂 |
| 3.2.2 噬菌体筛选流程 |
| 3.2.3 噬菌体滴度的测定 |
| 3.2.4 噬菌体单克隆的挑取和结合力验证 |
| 3.2.5 噬菌体克隆的DNA提取及序列分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 噬菌体文库的富集情况 |
| 3.3.2 噬菌体单克隆的结合力表征 |
| 3.3.3 基因测序及翻译 |
| 3.3.4 多肽与c-Met的结合能力考察 |
| 3.3.5 多肽对c-Met蛋白亲和能力的考察 |
| 3.3.6 温度和时间对多肽L28结合能力的影响 |
| 3.3.7 多肽与肿瘤细胞的结合能力分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于液滴微流控的噬菌体展示技术 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 仪器、材料和试剂 |
| 4.2.2 微流控芯片的制作流程 |
| 4.2.3 液滴生成芯片的结构 |
| 4.2.4 液滴中大肠杆菌ER2738的生长情况考察 |
| 4.2.5 噬菌体滴度测定 |
| 4.2.6 基于液滴微流控的噬菌体展示筛选过程 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 液滴微流控芯片的设计 |
| 4.3.2 可行性验证 |
| 4.3.3 阳性噬菌体单克隆的挑取 |
| 4.3.4 单克隆测序及其序列分析 |
| 4.3.5 多肽对CD71结合能力的考察 |
| 4.3.6 多肽与肿瘤细胞的结合能力分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者攻读硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
（8）抗黄曲霉毒素B1单链抗体噬菌体库的构建、筛选及性质分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 黄曲霉毒素B_1 |
| 1.1 AFB_1的性质及危害 |
| 1.2 AFB_1的检测方法 |
| 1.2.1 生物测定法 |
| 1.2.2 理化分析法 |
| 1.2.3 免疫分析法 |
| 2 抗体研究 |
| 2.1 抗体结构 |
| 2.2 重组抗体 |
| 2.2.1 多价抗体 |
| 2.2.2 人源化抗体 |
| 2.2.3 单链抗体 |
| 3 噬菌体展示技术 |
| 3.1 噬菌体展示技术的原理 |
| 3.2 噬菌体展示系统种类 |
| 3.2.1 丝状噬菌体展示系统 |
| 3.2.2 T4噬菌体展示系统 |
| 3.2.3 T7噬菌体展示系统 |
| 3.2.4 λ噬菌体展示系统 |
| 3.3 噬菌体展示技术的应用 |
| 3.3.1 应用于新型疫苗研制 |
| 3.3.2 应用于蛋白质相互作用研究 |
| 3.3.3 应用于抗体库展示 |
| 4 本研究的目的意义和内容 |
| 4.1 目的和意义 |
| 4.2 研究内容 |
| 第二章 抗AFB_1单链抗体基因文库的构建 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 供试动物 |
| 1.2 菌种与质粒 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂及耗材 |
| 1.5 相关溶液的配制 |
| 1.5.1 ELISA相关试剂 |
| 1.5.2 相关试剂及培养基的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物免疫 |
| 2.2 抗血清的制备及分析 |
| 2.2.1 抗血清的制备 |
| 2.2.2 抗血清效价分析 |
| 2.2.3 抗血清灵敏度分析 |
| 2.3 提取RNA |
| 2.4 合成cDNA |
| 2.5 扩增抗体可变区基因 |
| 2.5.1 扩增VH和VL基因序列 |
| 2.5.2 PCR产物回收 |
| 2.6 基因文库构建 |
| 2.6.1 ScFv基因片段的扩增 |
| 2.6.2 重组质粒pMD19-T-ScFv的构建与鉴定 |
| 2.6.3 文库构建 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 抗AFB_1多克隆抗体的制备及其性质研究 |
| 3.1.1 抗血清的效价分析 |
| 3.1.2 抗血清灵敏度分析 |
| 3.2 ScFv基因的克隆 |
| 3.2.1 提取脾脏细胞总RNA |
| 3.2.2 扩增可变区基因 |
| 3.2.3 扩增ScFv基因 |
| 3.3 重组质粒pMD19-T-ScFv转化结果鉴定 |
| 3.4 重组质粒pCANTAB5e-ScFv转化 |
| 4 小结讨论 |
| 4.1 实验小结 |
| 4.2 讨论 |
| 第三章 抗AFB_1 ScFv噬菌体文库的构建、筛选及鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验菌株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂及耗材 |
| 1.4 相关试剂配制 |
| 2 |
| 2.1 辅助噬菌体M13KO7的制备与浓度测定 |
| 2.1.1 辅助噬菌体的扩增 |
| 2.1.2 辅助噬菌体浓度测定 |
| 2.2 抗AFB_1 ScFv噬菌体抗体库的构建及浓度测定 |
| 2.2.1 噬菌体抗体库的构建 |
| 2.2.2 噬菌体抗体库的浓度测定 |
| 2.3 抗AFB_1 ScFv噬菌体抗体库的筛选和富集 |
| 2.4 阳性ScFv噬菌体克隆的初步鉴定 |
| 2.4.1 表达重组抗体 |
| 2.4.2 Phage ELISA |
| 2.4.3 阳性噬菌体抗体的序列分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 测定噬菌体抗体库库容 |
| 3.2 抗AFB_1噬菌体抗体库的淘选与鉴定 |
| 3.2.1 噬菌体抗体库的淘选 |
| 3.2.2 阳性噬菌体筛选结果 |
| 3.3 ScFv核酸序列与氨基酸的分析 |
| 3.3.1 核酸序列分析 |
| 3.3.2 氨基酸序列分析 |
| 4 小结讨论 |
| 4.1 实验小结 |
| 4.2 讨论 |
| 第四章 抗AFB_1 ScFv的性质分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验菌株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂及耗材 |
| 1.4 相关试剂配制 |
| 1.4.1 SDS-PAGE相关溶液 |
| 1.4.2 蛋白表达和纯化相关溶液 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 ScFv的重组表达 |
| 2.1.1 ScFv的表达载体构建 |
| 2.1.2 ScFv的原核表达及检测 |
| 2.1.3 ELISA分析抗AFB_1ScFv性质 |
| 2.2 ScFv的生物信息学分析 |
| 2.2.1 ScFv的同源建模 |
| 2.2.2 ScFv的分子对接 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 ScFv的重组表达 |
| 3.1.1 ScFv的表达载体构建 |
| 3.1.2 ScFv的原核表达及检测 |
| 3.2 ScFv效价和灵敏度的检测 |
| 3.3 ScFv的生物信息学分析 |
| 3.3.1 ScFv的同源建模 |
| 3.3.2 ScFv的分子对接 |
| 4 小结讨论 |
| 4.1 实验小结 |
| 4.2 讨论 |
| 第五章 论文总结 |
| 1 主要结论 |
| 2 展望 |
| 2.1 单链抗体基因多样性 |
| 2.2 ScFv亲和力 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 引物序列 |
| 附录2 ScFv核酸序列 |
| 附录3 pCANTAB5e质粒图谱 |
（9）生殖支原体MgPa特异性结合多肽的筛选、鉴定与人尿道上皮细胞cDNA文库的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 生殖支原体简介 |
| 1.2 病原体受体研究简介 |
| 1.3 噬菌体展示技术简介 |
| 第二章 RMGPA特异性结合多肽的筛选与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 人尿道上皮细胞T7噬菌体展示CDNA文库的构建与鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间的科研成果 |
| 本研究受以下基金资助 |
| 致谢 |
（10）噬菌体展示技术筛选人肠道病毒71型3A蛋白相互作用蛋白（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 3A原核表达载体的构建 |
| 1.3.2 3A融合蛋白表达及纯化 |
| 1.3.3 免疫印迹检测 |
| 1.3.4 3A相互作用蛋白的筛选 |
| 1.3.4. 1 噬菌体滴度测定 |
| 1.3.4. 2 筛选相互作用蛋白 |
| 1.3.5 噬菌斑的扩增 |
| 1.3.6 序列比对及同源性分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 3A融合表达及纯化 |
| 2.2 免疫印迹法检测纯化的融合蛋白 |
| 2.3 筛选人肝cDNA文库中3A相互作用蛋白 |
| 2.4 目的基因PCR扩增 |
| 2.5 序列比对及同源性分析 |
| 3 讨论 |
四、用T7噬菌体展示筛选系统筛选与靶蛋白相结合的蛋白（论文参考文献）
- [1]利用rAAV-SaCas9系统敲除肌细胞的myostatin基因并评价其对肌肉萎缩的改善作用[D]. 翁少亭. 河南农业大学, 2020(04)
- [2]氯噻啉模拟表位多肽的研制与应用[D]. 丁园. 南京农业大学, 2020
- [3]氯噻啉模拟表位多肽的研制与应用[D]. 丁园. 南京农业大学, 2020
- [4]靶向乙型肝炎病毒核心蛋白定量检测方法的研究[D]. 平芳. 重庆医科大学, 2020(12)
- [5]应用T7噬菌体展示技术筛选与sLRIG1亲和结合蛋白[J]. 朱锡群,易伟. 医学研究杂志, 2018(11)
- [6]基质γ-羧基谷氨酸蛋白（MGP）相互作用蛋白的筛选研究[D]. 常洋涛. 辽宁大学, 2018(01)
- [7]基于噬菌体展示技术的亲和多肽筛选及其在肿瘤识别中的应用[D]. 刘文丽. 厦门大学, 2018(07)
- [8]抗黄曲霉毒素B1单链抗体噬菌体库的构建、筛选及性质分析[D]. 陈晶. 华中农业大学, 2016(05)
- [9]生殖支原体MgPa特异性结合多肽的筛选、鉴定与人尿道上皮细胞cDNA文库的构建[D]. 朱有葱. 南华大学, 2015(04)
- [10]噬菌体展示技术筛选人肠道病毒71型3A蛋白相互作用蛋白[J]. 唐瑞,杨勇波. 国际检验医学杂志, 2014(16)