一、逆转录病毒载体携带HBV载体表达显性阴性突变体抗HBV作用的研究（论文文献综述）
马宁[1]（2020）在《候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究》文中研究表明第一部分候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析目的:本部分的研究目的:1.应用3种遗传模型分析干扰素及其受体系列基因（IFNA1、IFNA2、IFNA5、IFNL4、IFNLR1、IFNAR2）、氧化应激系列基因（CYBA、NCF4、NOX4、SOD2、GCLM）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）及lnc-RP11-150O12.3外显子区的rs2275959位点和HBV慢性肝病发生发展的关联。2.分析同一染色体上物理位置接近的SNPs构成的单倍体型和HBV慢性肝病发生发展的关联。3.应用3种统计方法分析各个系列SNPs的交互作用和HBV慢性肝病发生发展的关联。方法:1. 候选基因SNPs的选择。Pubmed数据库检索功能SNPs或者区域,这些SNPs或者区域可能会影响和HBV感染有关基因的m RNA的转录、蛋白质的表达,继而影响HBV慢性肝病的发生发展。然后通过UCSC数据库和Ensemble数据库检索其具体物理位置和在中国北方汉族人群中的罕见等位基因频率（MAF）,Hapmap数据库查询单倍体型信息,SNPinfo Web Server预测SNPs的功能。共21个SNPs（IFNA1-rs1332190、rs1831583,IFNA2-rs649053,IFNA5-rs7031048、rs3758236,IFNAR2-rs1051393、rs12233338,IFNLR1-rs10903035、rs11249006、rs7525481、rs4649203,IFNL4-rs12971396、rs8113007、rs7248668,CYBA-rs4673,NCF4-rs1883112,NOX4-rs1836882、rs3017887,SOD2-rs4880,GCLM-rs41303970,RP11-150O12.3-rs2275959）纳入本研究。2.样本收集。从石家庄市第五医院以及河北医科大学第一、二、四附属医院中选择符合纳入标准的研究对象3128例,包括:阴性对照者（Negative Control,Ne C）840例,HBV自然清除者（Natural Clearance,NC）496例、慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）691例、HBV相关肝硬化（Liver Cirrhosis,LC）680例、HBV相关性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者421例,其中CHB组、LC组和HCC组统称为HBV相关肝病组（HBV-induced liver diseases,HLD）。抽取研究对象空腹静脉抗凝血备用,同时以问卷形式收集研究对象的基线资料、检查结果、患病情况。3.基因分型。从抗凝全血中提取DNA,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）检测方法对21个候选基因的SNPs进行分型检测。4.统计学分析。多组计量资料的比较采用单因素方差分析（正态分布且方差齐）或K-W H秩和检验（正态分布方差不齐/非正态分布）,两个或多个样本率或构成比的比较采用χ2检验。用非条件Logistic回归分析SNPs和疾病发生发展的关联性,并计算比值比（odds ratio,OR）和95%置信区间（95%confidence intervals,95%CI）。分析研究对象的基线资料与HBV慢性肝病发生发展的关系。应用共显性、显性和隐性模型分析21个SNPs与HBV慢性肝病易感性（HBV相关肝病组vs.阴性对照组）、HBV自然清除（HBV相关肝病组vs.HBV自然清除组）、HCC易感性（HCC组vs.LC+CHB组,HCC组vs.阴性对照组）的关联。以P≤0.05为差别有统计学意义,检验水准均为双侧,采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理和分析。Haplo View软件进行单倍体型和疾病的关联分析。SNPStats软件对阴性对照个体21个位点的基因型频率行Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验。广义多因子降维法（Generalized Multifactor Dimensionality Reduction,GMDR）、Logistic回归分析（相乘模型）、叉生分析法（相加模型）进行基因-基因交互作用分析。结果:1 21个SNPs的等位基因频率符合H-W遗传平衡定律（P>0.05）,证明研究对象具有群体代表性。2 干扰素及其受体系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系2.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示共显性模型下有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393GT/TT vs.GG（P=0.001,OR=1.430;P=0.006,OR=1.471）、IFNLR1-rs4649203GG vs.AA（P=0.002,OR=1.676）、IFNLR1-rs7525481TT vs.CC（P=0.002,OR=5.907）,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006AG/GG vs.AA（P=0.000,OR=0.228;P=0.00234,OR=0.130）、IFNAR2-rs122333338CC vs.TT（P=0.003,OR=0.115）。显性模型中,有4个位点进入方程,其中危险因素有3个:rs1051393（GT+TT）、rs4649203（AG+GG）、rs7525481（CT+TT）,其OR值分别为1.372、1.222、3.975;保护性因素有1个:rs11249006（AG+GG）,OR=0.239。隐性模型中有2个位点进入方程:rs4649203GG和AA+AG比较属于危险因素:OR=1.478;rs122333338CC和TT+TC比较属于保护性因素:OR=0.185。以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组,IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单体域,单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素（P=0.0038,OR=1.208）,CAG是疾病的保护性因素(P=3.428×10-32,OR=0.116)。GMDR结果提示rs7525481、rs11249006、rs10903035构成的3因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照3因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.186（1.672,2.858）倍。相乘交互作用结果提示rs7525481＿T和rs11249006＿A的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=2.258、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.240,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.240倍。和rs649053＿G的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=1.513、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.364,二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.364倍。rs7525481＿T和rs10903035＿G存在负相加交互作用,归因于两个位点的交互作用导致疾病发生的超额相对危险度是-2.67[RERI=-2.670（-4.670,-0.670）],两因素同时存在时（CT+TT、AG+GG）发病的危险性是它们各自单独存在时危险性之和的0.389倍[S=0.389（0.267,0.568）]。2.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:显性模型中IFNLR1-rs4649203AG+GG和野生型纯合体AA相比,属于危险因素（P=0.008,OR=1.344）,携带AG及GG基因型的群体不易清除HBV。未发现与HBV清除能力相关的单倍体型。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV持续感染的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.658,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.658倍。10对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。2.3 与HBV相关性肝细胞癌（HBV-HCC）进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有2个位点进入方程:携带rs1051393TT的个体比携带GG基因型的个体更容易由HBV慢性肝病发展为HCC（P=0.021,OR=1.497）;rs7248668GA和GG相比,属于危险基因型（P=0.002,OR=1.876）。显性模型中,仅1个位点进入方程:rs7248668GA+AA和GG相比属于危险因素,有更大的可能发展为HCC（P=0.006,OR=1.720）。隐性模型中有2个位点进入方程:rs1051393TT和GG+TG比较属于危险因素:（P=0.006,OR=1.512）;rs649053GG和AA+AG比较属于危险因素:（P=0.019,OR=1.421）。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668＿A构成单体域,单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素（P=0.0362,OR=1.440）,CAG是保护性因素（P=0.0423,OR=0.721）。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV-HCC发生的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=2.325,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了1.325倍。rs4649203＿A和rs7248668＿A的主效应导致HBV-HCC发生的危险度分别为OR=1、OR=1.774,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.995,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了0.995倍。14对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。3 氧化应激系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系3.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,阴性对照组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有3个位点进入程:突变型杂合体rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.01,OR=1.412）;携带rs1883112AG/GG的个体与携带AA基因型的个体相比更不易患病（P=0.011,OR=0.783;P=0.007,OR=0.672）;突变型纯合体rs41303970AA和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.027,OR=1.951）。显性模型中,有3个位点进入方程,其中保护性因素有2个:rs1883112（AG+GG）、rs1836882（TC+CC）,其OR值分别为0.755、0.831;危险因素有1个:rs4673（AG+AA）,其OR值为1.358。隐性模型中有3个位点进入方程:rs1883112GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.755;rs4880GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.507;携带rs41303970AA的个体比携带AG+GG的个体容易患病:OR=1.991。未发现与HBV慢性肝病易感性相关的单倍体型。GMDR结果提示rs1883112、rs1836882、rs4880、rs3017887构成的4因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照4因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.029（1.479,2.782）倍。rs1836882＿A和rs1883112＿T在导致HBV慢性肝病发生中存在正相乘交互作用趋势（P=0.061,OR=1.200）。15对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作3.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:共显性模型中突变型杂合体CYBA-rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.045,OR=1.398）。该系列另5个位点均和HBV自发清除能力无关。3.3 与HBV-HCC进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,结果未发现与HBV-HCC有关的SNPs位点。4 RP11-150O12.3-rs2275959T与HBV慢性肝病发生发展的关系以CHB与LC为对照组,HCC为病例组,分析rs2275959T与HBV-HCC之间的相关性,结果表明共显性模型下CT、TT与CC相比均为HCC易感性的危险因素（P=0.016,OR=1.427;P=0.006,OR=1.561）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.005,OR=1.477）。以阴性对照组为对照组,HCC为病例组,共显性模型下该位点的TT与CC相比为HCC易感性的危险因素（P=0.003,OR=1.748）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.016,OR=1.463）;隐性模型下TT和CC+CT相比是危险因素（P=0.014,OR=1.459）。结论:1.干扰素及其受体系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393T、IFNLR1-rs4649203G、IFNLR1-rs7525481T,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006G、IFNAR2-rs122333338C。rs4649203G同时和HBV自然清除有关。IFNAR2-rs1051393T、IFNL4-rs7248668A、IFNA2-rs649053G是HBV-HCC的危险因素。2.IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668A构成的单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素。3.干扰素及其受体基因的SNPs存在交互作用,可能对HBV慢性肝病的发生发展起重要作用。4. 氧化应激系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有2个:CYBA-rs4673A、GCLM-rs41303970A,保护性SNPs有3个:NCF4-rs1883112G、NOX4-rs1836882C、SOD2-rs4880G。rs4673A同时和HBV自然清除有关。5. Rs2275959T与HBV-HCC的发生有关。第二部分lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与mi R-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响目的:探索RP11-150O12.3多态性位点rs2275959T对HCC发生发展作用的分子机制。方法:1.生信分析。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构;Lnc RNASNP2数据库检索通过rs2275959位点和RP11-150O12.3结合的mi RNA及RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织的表达情况;UCSC数据库下载RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织中的表达量数据。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测4株肝癌细胞株及LO2肝细胞中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量,细胞爬片荧光探针原位杂交（Fish）实验在4株细胞株中对RP11-150O12.3进行定位;q RT-PCR检测RP11-150O12.3和mi R-6739-3p在30对肝癌及其癌旁组织中的表达量;数量性状分析肝癌组织中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量是否会因为rs2275959基因型的不同而改变,相关性分析不同rs2275959基因型个体肿瘤组织中RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的表达量是否具有相关性;荧光素酶报告基因检测技术验证RP11-150O12.3及mi R-6739-3p的海绵吸附作用;最后利用q RT-PCR方法检测RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的结合是否影响RP11-150O12.3的表达量。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。利用慢病毒包装及感染技术构建RP11-150O12.3稳定过表达及敲减的QGY7703肝癌细胞系;在体外利用MTT及克隆形成实验,在体内利用裸鼠皮下成瘤实验检测RP11-150O12.3对肝癌细胞QGY7703增殖能力的影响;利用Transwell小室法检测过表达及敲减RP11-150O12.3后QGY7703细胞迁移和侵袭能力的变化;最后利用流式细胞术分析RP11-150O12.3是否影响细胞周期与细胞凋亡。结果:1.生信分析结果。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构显示,rs2275959野生型碱基C附近的序列（ACAGAACAAA）较易和其它核酸互补结合,而突变碱基U位于茎-环交界处,其下游序列（AAAUGCAUG）存在6对A-U对及3对C-G对会形成稳定的氢键,增加分子间作用力,使分子更稳定。Lnc RNASNP2数据库显示当rs2275959为野生型C时RP11-150O12.3和mi R-6739-3p有海绵吸附作用,当rs2275959突变为U时,该吸附作用会消失。Lnc RNASNP2数据库显示RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于癌旁组织,从UCSC数据库下载的原始数据支持这一结论。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测发现RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞系中的表达量显着高于LO2正常肝细胞(P=1.7×10-4,P=2.6×10-5,P=0.002)。Fish实验检测RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep3B 3株肝癌细胞及LO2正常肝细胞中的表达,均主要定位于细胞浆中。mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均显着低于LO2正常肝细胞（P=0.000）。在30对新鲜肝癌组织及其癌旁组织中检测RP11-150O12.3的表达量,结果表明其在肝癌组织中的表达量显着高于癌旁组织(Z=-3.898,P=9.7×10-5)。Rs2275959基因型不同,肝癌组织中RP11-150O12.3的表达量亦不同,从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=1.765）到携带CT基因型的个体（Median=4.496）再到携带TT基因型的个体（Median=5.836）其表达量有逐渐升高的趋势(PCC-CT=0.348,PCC-TT=0.040)。而mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于癌旁组织（Z=-3.363,P=0.001）。从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=2.848）到携带CT基因型的个体（Median=1.459）再到携带TT基因型的个体（Median=1.106）其表达量有逐渐降低的趋势(PCC-CT=0.203,PCC-TT=0.045)。携带rs2275959CC及CT基因型个体的癌组织中两种RNA的表达量呈负相关关系(rs=-0.734,P=3.5×10-4),携带TT基因型个体的癌组织中二者表达量没有相关性（rs=0.009,P=0.979）。双萤光素酶报告基因技术结果提示rs2275959-C能介导RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR实验结果进一步说明这种吸附作用能够导致RP11-150O12.3表达量下降。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。本研究成功构建了过表达及敲减RP11-150O12.3的稳定细胞系。MTT实验结果显示:过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞与空载质粒对照细胞（Control）相比,培养48h后增殖能力增强（P=0.04）;将QGY7703细胞的RP11-150O12.3敲减后,与无关序列对照组（sh Control）相比,48h后细胞增殖能力下降（P=0.042）。过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的相对克隆形成率显着高于Control组（P=0.005）,而将RP11-150O12.3敲减后,QGY7703细胞的相对克隆形成能力明显下降(P=4.26×10-4)。裸鼠成瘤实验结果显示,皮下注射过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着高于皮下注射Control组细胞的小鼠(Pweight=0.004),皮下注射敲减RP11-150O12.3的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着低于皮下注射sh Control组细胞的小鼠(Pweight=0.011)。Transwell小室法检测RP11-150O12.3过表达或敲减后QGY7703细胞迁移与侵袭能力的变化,结果显示,RP11-150O12.3T过表达组细胞的迁移和侵袭能力均显着高于Control组（P=0.028,P=0.010）,RP11-150O12.3敲减组细胞的迁移和侵袭能力均显着低于sh Control组（P=0.002,P=0.024）。流式细胞术检测细胞周期结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703细胞过表达RP11-150O12.3T后G0/G1期的比例明显下降（P=0.001）,S期的比例明显升高(P=1.9×10-4),说明RP11-150O12.3T能促进细胞周期从G0/G1期向S期转变。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3表达量下调的QGY7703细胞G0/G1期的比例升高(P=1.13×10-4),S期比例明显下降（P=0.049）,使细胞阻滞于G0/G1期。细胞凋亡实验结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703过表达RP11-150O12.3T后细胞凋亡比例明显降低（P=0.0011）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异更加明显(P=1.12×10-4)。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3下调的QGY7703细胞凋亡比例明显增高（P=0.003）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异也有所提高（P=0.001）。结论:1.RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞中的表达量高于LO2正常肝细胞,其表达位置在细胞浆。而mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均低于LO2正常肝细胞。2.RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于其对应的癌旁组织,从携带rs2275959CC基因型的个体到携带CT基因型的个体再到携带TT基因型的个体肝癌组织中RP11-150O12.3表达量有逐渐升高的趋势,mi R-6739-3p表达量有逐渐降低的趋势,并且mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于其癌旁组织。携带CC及CT基因型个体的癌组织中RP11-150O12.3和mi R-6739-3p表达量呈负相关关系。3.RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的相互作用依赖于rs2275959C碱基且导致RP11-150O12.3的表达量下调。4.RP11-150O12.3作为一个促癌基因,在体外能促进HCC细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞周期的进展,并抑制细胞凋亡;在体内能促使裸鼠成瘤。
袁伦志[2]（2019）在《人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究》文中认为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染在全球范围内造成了严重的疾病负担。HBV感染具有严格的宿主种属特异性和肝细胞嗜性,其感染人肝细胞后能够持续复制,诱发宿主免疫耐受状态、逐步形成慢性化、直接或间接诱导一系列病理生理学变化并造成重症肝炎、肝衰竭、肝纤维化、肝硬化和肝癌等终末期肝脏疾病。目前,虽然预防性疫苗的普及已经在很大程度上控制HBV新发感染率,但是已批准上市的临床药物仍然无法彻底清除病毒,实现功能性治愈。由于HBV的天然宿主人类和猩猩等大型灵长类动物用于研究收到严格的伦理限制,因此发展能够最大限度模拟HBV感染和发病的动物模型成为进一步认识HBV感染发病机制,以及研发和评价新一代抗HBV药物所面临的一项挑战。数十年来,研究人员建立了转基因小鼠、尾静脉高压注射小鼠、旱獭、北京鸭和树鼩等替代模型,然而它们都不能完全模拟HBV在人类中感染发病的自然史,因此,建立人源化小鼠动物模型,特别是人肝和人免疫系统双嵌合的人源化小鼠动物模型,用于支持HBV感染发病相关研究具有相当的重要性。然而,目前已有的人源化小鼠动物模型一直存在原代人细胞来源匮乏和体外难以扩增、个体差异大、多种细胞移植不匹配、伦理问题、造模周期长、实验窗口期短和难以模拟HBV感染相关的终末期肝脏疾病等限制。因此,建立一种方便易用的、能够支持HBV感染发病研究的新型人源化小鼠动物模型对于进一步推进HBV相关基础研究和治疗策略的发展十分必要。本论文中,我们利用临床分离的健康人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs）在免疫缺陷小鼠体内同时重建了同源的人源肝脏和免疫系统,并将此种双嵌合人源化小鼠用于乙肝病毒感染及相关病理生理学研究。我们对乙肝病毒的生物学特征、流行病学、感染自然史、相关肝脏疾病、天然宿主动物、感染细胞和动物模型等方面进行综述研究,基于前期研究和对最新研究成果的考察,我们发现hBMSCs具有重建人类肝脏和免疫系统的巨大的潜力,并选择其作为我们构建新型双嵌合人源化小鼠模型的细胞材料。我们使用hBMSCs移植暴发性肝衰竭免疫缺陷FRGS小鼠,发现其能够在小鼠体内迅速转分化为具有活性的人肝细胞和多种人免疫细胞,同时证明暴发性肝衰竭的肝脏微环境是驱动hBMSCs在免疫缺陷FRGS小鼠体内大量快速转分化为人源肝细胞和免疫细胞的重要驱动因素。我们在hBMSCs移植的免疫缺陷FRGS小鼠（hBMSC-FRGS）体内建立了HBV慢性感染,实现A,B,C,D四种常见HBV基因型病毒感染超过50周。我们连续监测了 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内病毒DNA及蛋白水平,证明被HBV感染的小鼠血清内含有具备感染活力的HBV病毒颗粒。我们初步研究了HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内的免疫病理生理学变化,在感染进行和持续和过程中同步分析了小鼠肝内人源免疫细胞、人源细胞因子、肝脏炎症进展和HBV特异性人源抗体水平等指标,证明HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠出现持续的肝脏炎症和免疫耐受状态。我们在HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内观察到一系列的指示肝硬化发生发展的典型性指标,包括:肝硬化血清学指标持续增高、小鼠肝脏组织中肝硬化相关人源基因表达持续上调、小鼠肝脏组织中胶原纤维堆积持续增加、纤维结节生成、肝小叶结构被破环、肝板塌陷、肝脏外表粗糙体积固缩等。综上所述,我们建立了肝脏和免疫系统双重人源化的hBMSC-FRGS小鼠模型,将其用于HBV感染和相关免疫病理生理学研究,并通过长期观察发现HBV感染后小鼠产生肝脏炎症并且逐步发展为典型的肝硬化。
许桂丹[3]（2019）在《HBV C编码链反基因锁核酸阻断HepG2.2.15细胞内病毒复制效果》文中认为第一部分HepG2.2.15细胞培养及HBV活性与亚型鉴定目的:鉴定HepG2.2.15细胞乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）活性及亚型。方法:常规培养HepG2.2.15细胞,收集6孔板对数生长期的培养上清液和细胞,采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测HBsAg、HBeAg和HBcAb水平;实时荧光定量聚合酶链反应技术（FQ-PCR）测定HBV-DNA浓度;高通量基因测序技术鉴定HBV亚型;分子杂交技术检测HBV基因型及耐药突变情况;细胞免疫组化法检测细胞内HBsAg及HBeAg表达。将细胞设0.25、0.5、1.0、2.0和4.0×105个/mL五个培养浓度,每隔48h收集培养上清液,连续收集5次,检测HBeAg和HBV-DNA的含量。结果:HBV活性测定结果:HBsAg（OD值）为0.36±0.11;HBeAg（OD值）为2.37±0.08;HBcAb（OD值）为1.73±0.17;HBV-DNA为（4.75±0.06）×105IU/mL。病毒S、C区基因测序后序列比对结果显示与HBV ayw亚型相符,符合率大于99%。HBV基因分型为B、D复合型,无耐药突变位点。细胞免疫组化检测结果显示胞内HBsAg和HBeAg均呈阳性表达。细胞浓度为1.0×105个/mL时,增殖较快、较稳定,细胞状态最佳。结论:HepG2.2.15细胞HBV活性表达良好,无耐药突变位点,可作为体外HBV相关研究的良好模型。第二部分HBV C编码链反基因锁核酸设计、筛选及鉴定目的:针对HBV C区编码链设计、筛选及鉴定出能特异性阻断Hep G2.2.15细胞内HBV复制与表达的有效治疗靶点的反基因锁核酸（locked nucleic acid,LNA）片段。方法:利用RNAstructure5.0软件针对HBV C区编码链19141928nt、19691983nt、20022016nt、20532067nt、20692073nt、21622176nt和24042418nt位点设计合成7条（分别以SQ1-7表示）反基因LNA片段,以阳离子脂质体lipofectamine 3000（lipo3000）介导转染Hep G2.2.15细胞,分别于给药后第3、6、9 d收集培养上清液,采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测HBe Ag水平;实时荧光定量聚合酶链反应技术（FQ-PCR）测定HBV-DNA浓度。进行LNA药物/lipo3000最佳比例的筛选。结果:针对HBV C区编码链21622176nt和24042418nt位点的反基因LNA片段（即SQ6和SQ7）对HBV-DNA复制和HBe Ag表达的抑制效果最明显,用药后第3、6、9 d,SQ6对HBe Ag的平均抑制率分别为43.91%、59.95%和59.07%,HBV-DNA分别为42.91%、50.11%和51.14%;SQ7对HBe Ag的平均抑制率分别为44.18%、60.81%和60.02%,HBV-DNA分别为47.26%、54.16%和52.22%。LNA药物/lipo3000比例为4μg/6μL时,抑制效果最明显,用药后第3、6、9 d,SQ6对HBe Ag平均抑制率分别为44.16%、60.14%和60.27%,HBV-DNA分别为47.71%、56.66%和53.26%。结论:针对HBV C区编码链21622176nt和24042418nt位点的反基因LNA片段抗HBV效果最佳,且反基因LNA药物与lipo3000最适比例为4μg/6μL。第三部分HBV C编码链反基因锁核酸体外抗HBV效果研究目的:探讨HBV C编码链反基因LNA体外抗HBV效果。方法:利用RNAstructure5.0软件针对HBV C区编码链21622176nt、24042418nt位点分别设计合成反基因LNA片段（即SQ6、SQ7）。实验设空白对照组、lipo3000对照组、无关序列对照组（USQ）、恩替卡韦（ETV）对照组、SQ6和SQ7实验组,以lipo3000介导Hep G2.2.15细胞,各组隔天对应给药,连续5次,收集给药后第2、4、6、8、10 d的培养上清液,收集第10 d的细胞,采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测上清液HBe Ag水平;实时荧光定量聚合酶链反应技术（FQ-PCR）检测上清液HBV-DNA含量;逆转录聚合酶链反应技术（RT-PCR）检测细胞内HBV C m RNA表达。采用CCK8实验和流式细胞技术检测反基因LNA对细胞增殖和凋亡的影响。结果:用药后第2、4、6、8、10 d,SQ6组对HBe Ag的平均抑制率分别为34.86%、47.99%、61.62%、61.51%和59.49%,对HBV-DNA的平均抑制率分别为33.38%、54.97%、59.99%、53.94%和50.59%,SQ6与相比,P<0.001;SQ7组对HBe Ag的平均抑制率分别为36.33%、50.93%、64.67%、62.45%和61.36%,对HBV-DNA的平均抑制率分别为33.71%、55.82%、61.17%、54.95%和51.82%,SQ7与其余各组相比,P<0.001。空白对照组、lipo3000对照组、USQ、ETV、SQ6和SQ7组HBV C m RNA扩增产物与内参基因扩增产物（设为1）电泳灰度比值分别为0.973±0.017、0.967±0.011、0.969±0.019、0.602±0.013、0.376±0.009和0.371±0.007。CCK8和流式细胞实验结果显示反基因LNA对细胞增殖、凋亡无明显影响。结论:针对HBV C编码链2162-2176 nt和2404-2418nt位点的反基因LNA能有效抑制Hep G2.2.15细胞内HBV复制与表达,且对细胞增殖、凋亡无明显影响。
毛莹莹[4]（2016）在《基于腺相关病毒载体的人工miRNA抗乙型肝炎病毒基因治疗研究》文中研究表明乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）引起的传染病。HBV感染是一个非常严重的全球性公共卫生问题,是严重危害人类健康的重大传染病之一。据统计,全球大约有3.5亿慢性HBV感染者,每年全球大约有100万人死于与HBV感染相关的疾病,包括肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌等。中国是乙型病毒性肝炎的高流行地区,人群感染率高,在某些地区感染率高达35%以上,给国家带来沉重的社会经济负担。我国HBV携带者约9300万人,其中慢性乙肝患者高达2500万,是我国最为严重的三大传染病之一,也是我国肝细胞癌（HCC）高发的重要原因。目前临床上对乙肝病毒感染的主要治疗药物包括干扰素、核苷及核苷酸类似物等,但是这些药物只能在少数慢性感染患者中产生长期应答,并不能彻底清除乙肝病毒,并且也存在着复发率高、药物毒副作用较大和药品价格昂贵等问题,因此发展慢性乙肝新的治疗策略仍是医学上面临的巨大挑战。基因治疗作为生物技术新的里程碑,是生物技术产业发展的主方向之一,曾被Science杂志评为2009年10大科学突破之一,而其中值得关注的是,重组腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体在治疗先天性黑蒙病中及B型血友病等疾病的基因治疗临床试验中取得了突破性的进展,第一个用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病（LPLD）的AAV载体介导的基因治疗药物Glybera已在欧美国家批准上市。AAV以其低致病性、低免疫原性、能导致外源基因长期表达等优点被视为最具有开发潜质的病毒载体之一。而根据多篇文章报道,在众多AAV血清型中,8型腺相关病毒（AAV-8）对肝脏细胞的转导效率较高,是肝脏疾病基因治疗常用载体。miRNA是一类由内源性非蛋白质编码基因转录加工形成的长约21 nt的小分子单链RNA,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经Dicer酶加工后生成,在动植物中参与转录后基因表达调控。人工miRNA （artificial miRNA, amiRNA）是指将天然miRNA的成熟序列替换为人工设计的靶向某一基因的反义序列,可模拟内源miRNA的作用机制人为地沉默目的基因,由于amiRNA利用了miRNA的天然生成途径,同时相对于shRNA具有干扰效果更好、体内毒性更低等优点而逐渐成为研究的新热点。本课题应用8型腺相关病毒载体携带三个串联表达的amiRNA进行抗HBV的基因治疗研究。本课题第一部分探索了应用肝靶向性较好的AAV-8载体介导3个串联表达的amiRNA对乙肝模型小鼠体内HBV抑制作用的研究。本课题组成员在前期研究中构建了3条靶向不同基因型HBV的基因组保守区并去除任何靶向人和小鼠非特异序列的amiRNA,实验证明其对HBsAg和HBeAg匀有显着的抑制效果且3个串联表达的amiRNA较单个的amiRNA有更高的抑制HBV复制的作用。本研究中,我们构建了携带肝特异性启动子的3个串联amiRNA的rAAV表达质粒并命名为pAAV-liver-amiRNA135,通过将pAAV-liver-amiRNA135与不同基因型HBV表达质粒共转染HepG2细胞,在体外证明其对不同基因型HBV的HBsAg、HBeAg的表达以及HBV DNA的复制均有显着抑制作用（p<0.01）。接着,我们将pAAV-liver-amiRNA135包装成与质粒相比对肝脏细胞转导效率更高的重组腺相关病毒载体即AAV8-amiRNA135,然后对其进行药效学评价,为后期较深入的临床前研究和临床研究提供参考。首先,我们利用乙肝病毒低复制转基因小鼠联合水动力注射HBV表达质粒以维持小鼠肝内HBV长期高复制表达的方法构建了肝内HBV高复制的乙肝模型鼠并进行AAV8-amiRNA135的梯度药效学实验。将AAV8-amiRNA135以5×1011vg/只、5×1010vg/只、5×109vg/只、5×108vg/只经尾静脉分别注射模型小鼠,并以注射5×1011vg/只携带不靶向人类及老鼠任何基因的amiRNA序列的AAV8-Neg为阴性对照组,以注射5×1011vg/只携带双荧光素酶基因的AAV8-luc载体为空白对照组,在注射后不同时间点内采静脉血,用定量ELISA方法检测血清中HBsAg及HBeAg的表达水平,结果显示,AAV8-amiRNA135对乙肝模型小鼠血清HBsAg及HBeAg的抑制效果具有剂量依赖性,尤其是注射5×1011vg/只AAV8-amiRNA135的乙肝模型小鼠血清中HBsAg、 HBeAg;表达水平显着下降,甚至接近阴性水平。更重要的是,我们发现单次尾静脉注射AAV8-amiRNA135能有效抑制HBV复制至少15个月。接着,我们通过颈椎脱臼法处死小鼠,提取肝脏组织乙肝病毒核心颗粒DNA来检钡HBV DNA的拷贝数水平,结果显示,肝脏组织中HBVDNA拷贝数随着该病毒载体注射剂量的增大而显着降低（p<0.01）,说明了amiRNA135的表达能有效抑制肝内HBVDNA的复制。此外,我们对肝脏组织进行了HE染色及针对乙肝表面抗原HBsAg和核心抗原HBcAg的免疫组织化学染色。HE染色结果显示,阴性对照组小鼠肝组织切片可见明显炎症细胞浸润,肝小叶结构紊乱,肝炎病理特征较明显；注射5×109vg AAV8-amiRNA135小鼠肝脏组织与阴性对照组相比,炎症细胞相对较少,有较为整齐的肝小叶结构；注射剂量为5×1010vg及5×1011vgAAV8-amiRNA135的小鼠,肝细胞形态正常,肝小叶排列整齐且无明显炎症细胞浸润,说明注射剂量为5x1010vg及5×1011Vg的AAV8-amiRNA135能有效抑制肝炎反应且无明显肝毒性。通过免疫组织化学染色法检测肝脏组织中HBsAg和HBcAg的表达水平,结果显示,肝脏组织中HBsAg和HBcAgP阳性细胞数均随着AAV8-amiRNA135注射剂量的增大而减少,说明AAV8-amiRNA135对乙肝转基因小鼠肝组织中HBsAg,及HBcAg的表达均有显着抑制作用,且抑制效果具有剂量依赖性。后续随着实验室高复制乙肝转基因小鼠模型的成功构建,我们进一步研究比较了AAV8-amiRNA135对不同品系的高复制乙肝转基因小鼠的抗HBV作用。HBV转基因小鼠选择了三个品系,分别为C16-4♀、2C♂和2B♂、2B♀。将AAV8-amiRNA135以5×10¨vg/只经尾静脉分别注射以上小鼠,以注射5×1011vg/只的AAV8-Neg为阴性对照组,在注射后第1、2、3周采静脉血检测血清中HBsAg及HBeAg的表达水平,结果显示,AAV8-amiRNA135对三个品系的乙肝转基因小鼠均有较好的抑制作用,其对血清中HBsAg的抑制效率均达到80%-90%,对HBeAg的抑制效率也达到40%-70%。注射病毒载体后第4周,通过颈椎脱臼法处死小鼠,对肝脏组织HBV DNA及HBV RNA拷贝数水平进行定量检测,结果显示,注射AAV8-amiRNA135的乙肝转基因小鼠肝组织中HBV DNA及HBV RNA拷贝数均显着低于阴性对照组（p<0.05）,说明了amiRNA135的表达能有效抑制不同品系乙肝转基因小鼠肝脏组织中HBVDNA及RNA的复制。综上所述,这一部分研究所构建的AAV8-amiRNA135载体对HBV具有广泛而显着的抑制作用,且单次载体灌注能有效发挥抑制作用至少15个月,本研究结果为慢性乙肝的基因治疗开辟了新路径。为进一步提高AAV介导的肝脏疾病基因治疗效率,本课题第二部分和第三部分内容旨在探索肝靶向性更高的重组腺相关病毒载体。在目前发现的众多AAV血清型中,已知AAV-8是肝脏基因治疗最常用的载体之一；AAV-DJ是将8种不同血清型AAV的衣壳基因通过DNA shuffling技术得到的嵌合型AAV载体,具有与AAV-8相同的肝靶向性且人体内存在的AAV抗体对它的中和性较低,因此也被认为是人类肝脏疾病基因治疗理想的载体之一。但尽管如此,AAV在肝脏基因转导的应用还具有一定的挑战性,例如,机体对AAV衣壳蛋白的免疫排斥、泛素蛋白酶体介导的蛋白降解途径均能使AAV在细胞内发生降解,从而降低其介导的基因传递效率。因此,为了降低AAV的免疫源性及胞内降解率,需要进一步优化AAV载体,从而提高其转导效率。据文献报道,对AAV衣壳蛋白表面特定的磷酸化/泛素化残基（如酪氨酸,赖氨酸,丝苏氨酸等）进行突变能进一步提高其转导效率,原因是这些位点突变后能阻断下游的泛素化介导的蛋白降解,从而提高AAV载体介导外源基因在细胞内的表达效率。我们首先利用磷酸化/泛素化位点预测软件,选定了三个AAV8的突变位点和三个AAV-DJ的突变位点,然后利用overlap-PC R方法进行定点突变,构建了三个AAV8的突变体：Y447F、Y703F和Y708F,以及三个AAV-DJ的突变体：K137,T251A, S503A。通过PEI转染法将突变的cap质粒、病毒包装辅助质粒pAAV-Helper及外源基因表达质粒共转染293T细胞,包装成表达GFP基因和/或双荧光素酶Gluc-Fluc基因的重组AAV载体。首先将表达双荧光素酶Gluc-Fluc基因的重组野生型AAV-8及其三个酪氨酸突变体（Y447F、Y703F和Y708F）以1×1010vg注射6-8周龄的C57BL/6小鼠,在注射后第7、14、21、28天取尾静脉血检钡Gluc的表达,结果显示,Y703F突变体介导Gluc的相对表达量在不同时间点均显着高于野生型AAV8约3-4倍（P<0.05）。注射42天后麻醉小鼠,利用活体成像方法检测各载体的体内靶向性,结果显示,三种突变体均具有肝靶向性,与野生型AAV-8一致,且Y703F介导的Fluc在肝脏组织中的平均光强度显着高于野生型AAV-8约2倍（P<0.01）。活体成像实验后处死小鼠,提取各组织DNA,调整上样DNA模板至相同浓度,用QPCR方法检测Fluc DNA的水平,结果显示,在肝脏组织中,四种载体介导的Fluc DNA拷贝数在106～107GC （genomecopy） /100ng总DNA,而在其他组织,例如肾脏、心脏及肌肉组织,四种载体介导的Fluc的DNA拷贝数则低至105～106GC/100ng ,总DNA,进一步说明了三个酪氨酸突变体的肝靶向性没有改变,而且Y703F突变体介导的Fluc对小鼠肝脏、肾脏及肌肉的转导效率均高于野生型AAV-8约3-7倍（P<0.01）。为了进一步验证该突变体的有效性,我们还比较了携带治疗性基因血管紧张素1-7 （Angiotemin 1-7 ,Ang （1-7））的wtAAV-8及其Y703F突变体在C57BL/6小鼠体内的转导效率,将两种病毒以1×1011vg经尾静脉分别注射小鼠,以注射1×1011vg Y703F-Luc为阴性对照组,在注射后第7,14,21,28天检测血清中Ang（1-7）的表达水平,结果显示,Y703F介导的Ang（1-7）表达水平从第14天开始显着高于wtAAV-8约2倍（p<0.01）；肝组织DNA拷贝数分析结果显示,Y703F介导的Ang（1-7）在肝脏的DNA拷贝数显着高于wtAAV-8约3倍（p<0.001）。因此我们得出,对AAV-8衣壳蛋白703位点上的酪氨酸残基进行突变能有效提高其对肝脏的转导效率,且该突变体具有与wtAAV-8相一致的肝靶向性。同样地,我们将表达双荧光素酶Gluc- F luc基因的AAV-DJ及其三个突变体（K137R, T251A, $503A）以l×1011vg注射6-8周龄的C57BL/6小鼠,在注射后第7、14、21、28天取尾静脉血检钡Gluc的表达,结果显示,S503A突变体介导Gluc的相对表达量在不同的时间点均高于AAV-DJ约3倍（P<0.01）。注射42天后麻醉小鼠,利用活体成像方法检测各载体的体内靶向性,结果显示,三种突变体均具有肝靶向性,与AAV-DJ一致。活体成像实验后处死小鼠,提取各组织DNA,调整上样DNA模板至相同浓度,用QPCR方法检钡Fluc DNA的水平,结果显示,在肝脏组织中,四种载体介导的Fiuc的DNA拷贝数在107～108 GC/100ng总DNA,而在肾脏、心脏、胰脏、肺、脑及肌肉组织,四种病毒载体介导的Fluc的DNA拷贝数则低至105～107 GC/100ng总DNA,进一步说明了三个突变体仍保持肝靶向性,而且S503A突变体介导的Fluc对小鼠肝脏、心脏及肌肉的转导效率均显着高于AAV-DJ约3倍（P<0.05）。然而,在体外实验中,我们将表达GFP基因的AAV-DJ及其三个突变载体以MOI=1000感染三种不同类型的细胞：293T、Hela和HepG2细胞,感染后48h检测四种病毒载体介导GFP对三种不同细胞系的转导效率,结果显示,K137R和S503A突变体介导的GFP对三种细胞的转导效率稍高于AAV-DJ约20%-30%（p<0.05）,而T251A突变体则无明显差异。因此我们得出,虽然体外感染效率只有稍微的提高,但AAV-DJ衣壳蛋白503位点上的丝氨酸残基进行突变能够有效提高其对小鼠体内肝脏、心脏及肌肉的转导效率,具有重要应用意义。综合本课题的三部分研究内容,我们主要取得了以下成果：1、本研究所研发的AAV8-amiRNA具有自主知识产权,实验证明该候选药物能在乙肝模型动物体内持续稳定地表达,从而达到长期稳定抑制HBV复制的作用。利用AAV-8作为载体携带3个串联表达的amiRNA在乙肝转基因小鼠体内表达,能有效抑制小鼠血清中HBsAg, HBeAg水平并显着降低肝脏HBsAg、HBcAg的表达水平以及HBVRNA, DNA的拷贝数；一次尾静脉注射能稳定发挥抑制作用至少15个月；对不同品系乙肝转基因小鼠均具有广泛而显着的抑制作用,该候选药物为乙肝的基因治疗开辟了新路径；2、通过overlapping-PCR方法对AAV-8衣壳蛋白进行单点突变,构建了三个AAV8的酪氨酸突变体（Y447F、Y703F、Y708F）,体内结果显示,Y703F突变能显着提高其对小鼠肝脏、肾脏及肌肉的转导效率且具有与wtAAV-8一致的肝靶向性；3、同样方法构建了三个AAV-DJ的突变体（K137R、 T251A, S503A）,虽然体外结果显示四个病毒载体对293T、Hela及HepG2细胞的感染效率差异较小,但体内结果显示,S503A突变能显着提高其对小鼠肝脏、心脏及肌肉的转导效率,且同样具有较好的肝靶向性。以上结果为肝脏疾病的基因治疗提供新线索。
李东[5]（2012）在《乙型肝炎病毒载体表达的APOBEC3C抗病毒作用研究》文中认为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染的主要临床表现是慢性乙型肝炎，迄今慢性乙型肝炎的治疗效果很不理想，所以科研人员都在积极探索新的治疗策略。Natsoulis等于90年代初率先提出了一种全新的抗病毒策略：利用衣壳蛋白靶向灭活病毒（capsid targeted viral inactivation，CTVI），他们将这个方法应用于治疗逆转录病毒的实验研究，这个方法的主要原理是构建抗病毒蛋白与衣壳蛋白重组形成的融合蛋白，病毒组装时很多衣壳蛋白单体聚合形成衣壳蛋白，融合蛋白可以被病毒当做真的衣壳蛋白单体被组装到病毒核心颗粒中，这样融合蛋白携带的抗病毒蛋白就可以直接作用于核心颗粒内部的病毒核酸，干扰核酸合成使之发生变异失去作用或直接破坏清除病毒核酸，从而达到控制病毒复制的目标。2001年Beterams和Nassal将这个方法扩展到HBV的实验研究。他们在HBV核心蛋白羧基端通过linker连接核酸酶（staphylococcal nuclease，SN）。构建SN与核心蛋白的融合蛋白，这种被命名为Core-SN的融合蛋白被装配到病毒核心颗粒中。在与HBV质粒共转染人肝癌细胞后，提取上清液检测HBV DNA，发现DNA滴度下降了95%，实验显示Core-SN对核心蛋白和RNA形成核心颗粒没有影响，然而干扰了核心颗粒内部DNA的合成。这个实验也有不足之处：钙离子浓度高的情况下SN才能发挥功能，然而钙离子浓度在细胞内比较低，也就是说SN对细胞内的病毒没有作用，只是对分泌到细胞外的病毒发挥作用，当然就更不能阻止细胞质内的HBV DNA进入细胞核转化为cccDNA，所以我们应当寻找能在细胞内直接发挥抗HBV作用的物质。载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽（apolipoprotein B mRNA-editing enzyme-catalyticpolypeptide，APOBEC）是近年来新发现的具有脱氨基作用的一类酶，可以使腺嘌呤（adenine，A）或胞嘧啶（cytosine，C）脱氨基分别转化为次黄嘌呤（inosine, I）或尿嘧啶（uracil，U），即A→I或C→U。2007年Thomas报道，APOBEC3C（A3C）对HBV具有抑制作用，HBV核心蛋白与A3C复合体非常稳定，A3C可以使多数的新合成HBVDNA基因组出现很多鸟嘌呤（guanine，G）→腺嘌呤突变，即G→A。这些研究结果表明HBV非常容易受到内源性人脱氨酶的影响，并提示A3C是机体固有的抗HBV宿主反应因子。然而A3C不容易进入核心颗粒内部。为此我们利用核衣壳导向的病毒灭活策略构建核心蛋白与A3C的融合蛋白，在核心蛋白组装时将A3C带进核心颗粒内部以便其更有效的发挥抗病毒作用。本实验分为两部分：第一部分我们研究A3C蛋白独立的抗HBV作用和机制。在第二部分我们利用核衣壳导向的病毒灭活策略构建核心蛋白与A3C的融合蛋白，观察Core-A3C融合蛋白的抗HBV作用和机制。主要方法是应用电化学发光免疫法（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）检测细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平；应用Southern blotting方法检测细胞裂解液和上清液中HBV DNA观察抗病毒作用及pCH-LJ3-A3C在辅助质粒存在下的复制能力；应用3D-PCR技术扩增核心蛋白相关的HBV DNA，测定HBV DNA序列，研究Core-A3C融合蛋白抑制病毒机制；应用免疫细胞化学方法研究融合蛋白在细胞中的定位。主要研究结果如下：第一部分：复制缺损型HBV载体表达A3C抗HBV作用。应用PCR技术扩增目的基因A3C，经过Xho I和BSP1407I双酶切替换pCH-LJ3-hrGFP中的hrGFP基因，构建质粒pCH-LJ3-A3C，质粒经酶切和测序鉴定正确。质粒pCH-LJ3-A3C与野生型HBV质粒pCH-3093共转染HepG2细胞系。首先，应用ECLIA法检测细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平。结果显示pCH-LJ3-A3C组HBsAg表达水平为对照组的104.4％%±2.25%；HBeAg表达水平为对照组的98.65%±0.85%，与对照组相比，均无统计学差异。随后，应用Southern blotting方法检测细胞裂解液和上清液HBV DNA，观察pCH-LJ3-A3C的抗病毒作用。结果显示pCH-LJ3-A3C可以抑制细胞浆内病毒DNA，使HBV DNA减少30%，pCH-LJ3-A3C可以抑制上清液中子代病毒颗粒使HBV DNA减少39%。之后，为了研究pCH-LJ3-A3C能否在辅助质粒帮助下恢复复制能力，pCH-LJ3-A3C与pCH-3142共转染HepG2细胞系，Southern blotting方法检测细胞裂解液和上清液HBVDNA。结果显示裂解液和上清液均检出病毒DNA。最后，为了研究其抑制病毒机制，应用3D-PCR技术扩增核心颗粒有关的HBV DNA，与pGEM-T测序载体连接，每组选取50个克隆测序。结果回报pCH-LJ3-A3C对新合成的HBV DNA发挥编辑功能产生了G→A的变异，总共36个克隆出现G→A的变异，G→A变异总数目达982。第二部分：HBV载体表达核心蛋白与A3C融合蛋白抗HBV作用。应用PCR技术扩增目的基因A3C，经过BstE II和Acor13H I双酶切，插入载体质粒pdssX中，构建质粒pCH-Core-A3C，质粒经酶切和测序鉴定正确。pCH-Core-A3C与野生型HBV质粒pCH-3093共转染HepG2细胞系。首先，应用ECLIA法检测细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平。结果显示pCH-Core-A3C组HBsAg表达水平为对照组的97.82%±1.37%，HBeAg表达水平为对照组的97.16%±0.86%，与对照组相比无统计学差异。随后，应用Southern blotting方法检测细胞裂解液和上清液HBV DNA，观察pCH-Core-A3C的抗病毒作用。结果显示pCH-Core-A3C可以抑制细胞浆内病毒DNA，使HBV DNA减少84%，pCH-Core-A3C可以抑制上清液中子代病毒颗粒使HBV DNA减少91%。之后，为了研究其抑制病毒机制，应用3D-PCR技术扩增核心颗粒有关的HBV DNA，与pGEM-T测序载体连接，每组选取50个克隆测序。结果回报pCH-Core-A3C对新合成的HBV DNA发挥编辑功能，产生了大量的G→A的变异，总共48个克隆出现G→A的变异，G→A变异总数目达2416。最后，应用免疫细胞化学方法研究融合蛋白在细胞中的定位。结果显示Core-A3C融合蛋白主要定位于细胞浆。综合前两部分研究我们得出主要研究结论如下：1．成功构建了HBV载体表达核心蛋白与A3C融合蛋白质粒pCH-Core-A3C；复制缺损型HBV载体表达A3C质粒pCH-LJ3-A3C。2．pCH-LJ3-A3C和pCH-Core-A3C质粒对细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平没有影响。3．pCH-Core-A3C转染HepG2细胞系，细胞免疫化学显示Core-A3C融合蛋白主要定位于细胞浆。4．pCH-LJ3-A3C在辅助质粒pCH-3142提供包装时形成了完整的HBV颗粒。5．与野生型HBV质粒pCH-3093共转染HepG2细胞系，Southern blotting方法检测发现pCH-LJ3-A3C和pCH-Core-A3C均可以抑制细胞裂解液和细胞上清液HBVDNA，且pCH-Core-A3C抑制病毒复制作用明显优于pCH-LJ3-A3C。6．应用3D-PCR技术扩增核心颗粒有关的HBV DNA并克隆至pGEM-T载体，每组选取50个克隆测序，pCH-LJ3-A3C和pCH-Core-A3C均对新合成的HBV DNA发挥编辑功能产生了G→A的变异，且pCH-Core-A3C的编辑作用明显优于pCH-LJ3-A3C。总之，我们构建了表达Core-A3C的HBV载体，发现其对野生型HBV具有较强的的编辑作用，同时还能在辅助病毒存在时形成子代病毒，为下一步的动物试验及基因治疗奠定了良好的基础。将来在人体内应用时，有望实现“一次性治疗”获得持久的抗HBV作用。
刘金霞[6]（2009）在《新型乙型肝炎病毒载体的构建及初步应用研究》文中认为乙型肝炎病毒（HBV）载体是近几年新发展的一种病毒载体,不仅具有天然嗜肝特异性,而且具备改造为肝靶向性基因治疗载体的基本条件。主要包括:在肝细胞内持续复制、反复感染,病毒本身对细胞没有明显的细胞毒性;能够携带外源基因并被包装成病毒颗粒;能够介导外源基因的转移和表达;但由于基因结构复杂,目前改造的HBV载体均存在载容量小、复制包装效率低及安全性差等缺点,而且HBV载体制备困难,感染效率低,为解决目前存在的困难,有必要使其与其他病毒载体联合应用。如与腺病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体或逆转录病毒载体联合应用,实现高载容量、高转染效率、高复制能力,充分发挥HBV载体嗜肝导向性,可以利用体内野生型HBV为之提供包装,在体内形成具有抗HBV作用的HBV样颗粒,或携带治疗性目的基因,进一步感染其他肝细胞,实现放大效应。因此,通过病毒载体之间的重组,拓宽了HBV载体应用领域,不仅有望用于抗HBV基因治疗,也可以用于制备DNA疫苗、筛选抗病毒药物或通过携带外源性标志基因用于HBV分子生物学研究等。本研究通过构建新型的HBV载体表达不同的目的基因,构建了持续分泌表达BsdR重组HBV的的细胞系,用于HBV的分子生物学研究或筛选HBV易感细胞系;或与腺病毒载体联合构建了表达MMP8等目的基因的质粒,用于抗肝硬化的基因治疗,为HBV的分子生物学研究和肝硬化的生物治疗等开辟了新途径。本研究共分3部分完成。第一部分新型HBV载体的构建目的应用分子生物学技术改造HBV载体,阻断其结构基因的表达,提高HBV载体作为基因治疗载体的安全性,使其更适用于作为基因治疗载体。方法:1 pCH-M5-GFP质粒的构建通过改变pCH-S-GFP的起始密码子或添加终止密码子,删除了HBV质粒中Core、HBV-DNAP、pre-S1、pre-S2、S and X等结构蛋白的表达,构建pCH-M5-GFP质粒。2 pCH-S-hRLuc和pCH-M5-hRLuc的构建在pCH-S-GFP和pCH-M5-GFP质粒S基因区,以hRLuc替换GFP,构建pCH-S-hRLuc和pCH-M5-hRLuc两个质粒。3外源基因的表达能力的检测HBV载体经基因改造后,通过质粒共转染肝细胞,应用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,应用荧光素酶检测试剂盒检测海肾荧光素酶的表达水平,鉴定新构建质粒pCH-M5-GFP、pCH-S-hrLuc和pCH-M5-hrLuc的外源基因的表达能力。4重组HBV复制能力的检测。与辅助质粒共转染后,提取细胞裂解液中的HBVDNA,Sorthern blot技术检测重组HBV复制能力。5重组HBV感染树鼩肝细胞能力的检测。原代培养树鼩肝细胞,感染浓缩的重组HBV颗粒1W后,观察细胞内GFP的表达水平。结果:1成功构建了不能表达HBV结构基因的新型HBV载体。2新型HBV载体外源基因的表达水平基因突变后表达GFP的质粒转染肝癌细胞系后,GFP表达水平明显强于原始质粒。3通过southern blot检测,在细胞裂解液中能够形成HBV复制中间体。4重组HBV感染树鼩肝细胞1W后,能够观察到GFP。结论:HBV载体通过变更起始密码子和终止密码子后,阻断结构基因表达,在S基因区插入报告基因GFP和hrLUC,构建了新质粒,其外源基因的表达水平高于对照原始载体质粒,能够形成HBV DNA复制中间体,而且形成的重组HBV能够感染树鼩肝细胞。第二部分新型HBV载体应用一:持续分泌表达BsdR的重组HBV细胞系的构建目的:构建一个持续分泌重组HBV的细胞系,该重组HBV表达杀稻瘟菌素抗性基因（BsdR）。方法:1构建具有G418抗性的无包装信号的HBV辅助质粒pcDNA3.1-CH3142与表达BsdR的HBV载体质粒。2上述2个质粒共转染HepG2细胞,经G418和杀稻瘟菌素共筛选,获得阳性细胞克隆。3经过ELISA和斑点杂交技术筛选出高分泌重组HBV-Bsd颗粒的细胞系。4 G418反复加压培养,Southern blot和Native Western blot技术,再次筛选,获得高表达Bsd的重组HBV的细胞系,并通过PCR技术检测重组HBV的表达水平。5应用PCR技术,对野生型HBV和重组HBV进行鉴定,证实所构建细胞系无野生型HBV形成。6应用免疫电镜技术观察到完整的有囊膜包被的重组HBV颗粒。结果:1转染后,经G418筛选后,获得50余个细胞克隆。2挑选其中36个进行扩增,经同位素标记探针斑点杂交法检测细胞上清液中HBV DNA,选取9个表达量较高者。3继续传代培养15代（约3个月）,检测其形成疏松环状DNA的能力,最终选定HBV-Bsd25,HBV-Bsd7,HBV-Bsd27三个细胞株。4细胞培养上清液中HBV DNA定量分别为4.1×106、3.6×106、1.2×106copies/mL。5未检测到野生型HBV的产生。6 HBV-Bsd25细胞培养上清液经PEG8000浓缩后进行氯化铯密度梯度离心,分段进行Southern Blot及Western Blot检测,观察到完整有囊膜包被的重组HBV颗粒形成。7电镜观察有完整的HBV颗粒。结论:成功构建稳定表达BsdR重组HBV的细胞系,实现了大量制备重组HBV载体,有助于HBV载体用于HBV易感细胞系的筛选。第三部分新型HBV载体质粒应用二:腺病毒-HBV嵌合载体表达胶原酶II抗肝硬化研究一、腺病毒-HBV嵌合载体的构建与表达目的构建表达MMP8、tMMP8、RFP2的HBV载体,再利用复制缺损型腺病毒载体进行包装,构建Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8、Ad-CH-RFP2三个质粒。观察细胞内tMMP8 mRNA和RFP的表达情况,证明目的基因的表达能力,及其启动子的嗜肝特异性。方法:1应用PCR技术和酶切重组技术构建表达MMP8、tMMP8、RFP2的HBV载体,经过酶切鉴定和测序鉴定正确后,再利用复制缺损型腺病毒载体进行包装,构建Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8、Ad-CH-RFP2三个质粒。2 PCR技术证实重组腺病毒载体正确性,获得理想基因片段。3正确后,进行大量提取,纯化,浓度测定,感染293细胞,进行空斑形成能力的检测。4肝细胞感染重组腺病毒后,观察细胞内MMP8及tMMP8 mRNA的表达情况,应用荧光显微镜RFP的表达情况.5 HBV载体在血管上皮细胞（ECV304）中低表达:以CMV启动子及HBVS启动子驱动的GFP质粒,转染血管上皮细胞及肝癌细胞,分别观察其GFP的表达。结果:1成功构建了表达不同目的基因的腺病毒-HBV嵌合载体质粒。2携带MMP8和tMMP8的重组腺病毒感染肝细胞后表达tMMP8。携带RFP2的重组腺病毒感染肝细胞后表达红色荧光。3不同启动子驱动的GFP质粒转染不同细胞后,在HepG2和ECV304的表达水平存在差异。结论:表达不同目的基因的腺病毒载体-HBV嵌合载体能够被成功构建。该载体转染肝癌细胞后,能够成功表达各种目的基因;重组腺病毒载体携带MMP8基因的质粒感染HepG2后,其细胞中存在MMP8 mRNA的表达,应用荧光显微镜可以观察到红色荧光蛋白;HBV载体s启动子驱使的GFP在ECV304中低表达,在HepG2呈现高表达。而CMV启动子驱使的GFP在ECV304和HepG2均呈现高表达,提示S启动子的载体质粒对肝癌细胞系有一定特异性。二、硫代乙酰胺诱导的大鼠肝硬化模型的实验研究目的观察TAA制备大鼠肝硬化模型前后,肝脏组织学及血清学指标的变化情况,HGF/C-met系统在肝硬化发生和转归过程中的表达水平,为腺病病毒-HBV前忽而载体表达胶原酶II在肝硬化的实验研究奠定基础。方法: 42只雄性Wistar大鼠应用硫代乙酰胺饮用水喂养,制备肝硬化模型。模型制备成功后,随机分为7组,每组6只。每隔2周处死一组大鼠,留取血清检测肝功能,并检测肝组织中羟脯氨酸含量,进行HE和天狼猩红染色,同时RT-PCR技术检测HGF及其受体c-Met,另以正常大鼠6只为对照。结果:HGF/c-Met mRNA表达显着高于正常对照组,随着停止应用TAA时间的延长,肝功能、组织学改变、羟脯氨酸含量及HGF/c-Met的mRNA表达水平均逐渐恢复。结论:应用TAA20周成功诱导了肝硬化模型;停止TAA后,肝组织学、肝功能和肝脏的羟脯氨酸均有不同程度的自愈趋势。肝脏组织学的好转晚于肝功能的变化。在肝组织自愈的的同时,HGF及其受体c-Met的表达水平均有不同程度的下降趋势,但各组之间无统计学差异。三、腺病毒-HBV嵌合载体表达胶原酶Ⅱ治疗肝硬化的实验研究目的通过利用腺病毒-HBV嵌合载体,表达胶原酶Ⅱ,治疗肝硬化大鼠模型,探讨其能否有效地降解Ⅰ型胶原,促进肝细胞再生,改善肝功能,逆转肝硬化。方法:1模型制备应用0.3%硫代乙酰胺饮用水诱导的方法,制备大鼠肝硬化模型。2分组给药120只肝硬化模型大鼠随机分四组,每组30只,分别给予Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8、Ad-CH-RFP2三种重组腺病毒尾静脉注射,以1.5×1011VP/Kg剂量,一次给药。另外留取30只大鼠作为正常对照组,给予正常应用水喂养。3标本留取分别于2W、4W、8W后颈椎脱髓法处死动物。分离血清,-20℃保存;留取肝组织,少部分用10%的福尔马林固定,进行组织病理学检查,余者无菌条件下保存在液氮中。4指标检测全自动生化分析仪检测肝功能、放射免疫法检测肝硬化指标。胃酸酶解法检测肝组织羟脯氨酸含量。HE、天狼星红染色、免疫组化的方法观察肝脏组织病理学改变,并进行Knodel评分和一型胶原所占面积百分比进行半定量分析。RT-PCR方法检测肝组织内MMP8、HGF、c-Met和GAPDH。5统计分析应用SAS统计分析软件,进行统计处理。结果:1 Ad-HBV嵌合载体对肝硬化大鼠模型MMP8 mRNA表达水平的影响治疗组大鼠肝脏能够表达MMP8,但对照组没有检测到MMP8 mRNA表达,而且随着停药时间的延长,其表达水平呈下降趋势,直到第12W仍有少量表达。2 Ad-HBV嵌合体对肝硬化大鼠模型肝功能的影响在第2W、第4W时,与两个对照组相比,各治疗组ALT均有明显下降,具有统计学意义（P<0.05）。第8周,治疗组肝功能接近正常组。3 Ad-HBV嵌合体对肝硬化大鼠模型肝纤维化指标的影响与两个对照组相比,各治疗组HA和LN均有明显下降,具有统计学意义（P<0.05）。在治疗第8W时,治疗组HA和LN接近正常组。4 Ad-HBV嵌合体对大鼠肝硬化模型肝组织学的影响与对照组相比,治疗组病理学改善较快,炎症细胞浸润及纤维组织增生明显减轻,肝小叶结构破坏减轻,有肝细胞再生现象。5 Ad-HBV嵌合体对大鼠肝硬化模型肝组织羟脯氨酸含量的影响羟脯氨酸是胶原和弹性蛋白水解后产生的的一种氨基酸,约占胶原重量14%,其他蛋白质中罕见。羟脯氨酸的含量也随着肝硬化的严重程度而改变,在应用腺病毒治疗2W时,肝组织内羟脯氨酸含量明显低于对照组。6 Ad-HBV嵌合体在大鼠肝硬化模型HGF/c-Met mRNA的表达与两个对照组相比,各治疗组HGF/cMet mRNA均有明显升高,具有统计学意义（P<0.05）。第8周,治疗组肝组织HGF/c-Met mRNA接近正常组。结论:应用重组腺病毒治疗大鼠肝硬化模型后,肝功能好转,肝组织学及肝组织内的羟脯胺酸明显改善,肝组织表达MMP8,能够有效地降解Ⅰ型胶原,肝硬化减轻,肝细胞再生。HGF/c-Met mRNA表达水平增加。这一创新,有望把MMP-8基因治疗肝硬化带入临床应用,开辟肝硬化软肝治疗新途径。
姚静娟[7]（2008）在《复制缺陷的HBV重组体对野毒株的抑制作用》文中研究指明尽管有高效的疫苗进行预防,临床上也开始使用多种抗病毒药物如干扰素-α（IFN-α）及核苷类似物等进行治疗,但慢性乙型肝炎仍严重威胁着人们的健康。近年来基因治疗在抗HBV治疗方面取得了较大进展,如核酶、Dominantnegative突变体（DN突变体）和小干扰RNA（siRNA）等。本课题用腺病毒载体基因改造的类似方法重组HBV基因组,保留HBV的包装信号,在X基因翻译起始部位引入终止子以终止X蛋白的表达,全长的C基因与S基因融合使C-S融合蛋白取代包装所需的核衣壳蛋白和表面蛋白,在重组HBV基因组后通过内部核糖体进入位点（Internal Ribosome Entry Site,IRES）连接了IL-2基因,构建了双表达载体。该重组HBV基因组利用HBV的天然嗜肝特性,在患者肝细胞内竞争性利用HBV野毒株的C蛋白和S蛋白包装病毒,将C、S蛋白融合产生的DN突变体的抗HBV作用在有野毒株存在的肝细胞内持续、放大作用;不表达X蛋白,消除了X蛋白的反式激活、损害宿主细胞的不利影响;并利用IRES同时表达IL-2以增强抗HBV的作用。一、基于腺病毒载体HBV复制缺陷重组体的构建以含1.3拷贝HBV野毒株基因组的质粒1.3 x wt HBV in pGEM3Z（p1.3HBV）为模板,分别以KpnⅠ/XbaⅠ、XbaⅠ/HindⅢ酶切并将酶切得到的2.4Kb、1.8Kb的HBV基因片断克隆至pUC19载体,使p1.3HBV含有的两个X基因克隆至pUC19载体,命名为2.4Kb/pUC19（还包含C基因和S基因的起始部分）和1.8Kb/pUC19。用定点突变试剂盒,设计引物使X基因的第8位氨基酸的密码子从CAA突变成终止密码子TAA。同样的方法,以2.4Kb/pUC19质粒为模板,以限制性内切酶MluⅠ位点（-ACGCGT-）取代C基因终止子密码子,且在S基因起始密码子前插入MluⅠ酶切位点。用MluⅠ单酶切该突变质粒以切除C基因末端与S基因起始密码子之间的序列,回收的大片断以T4连接酶连接产生CS融合基因。再次设计引物,删除C、S基因之间的MluⅠ酶切位点（-ACGCGT-）,并将CS+X-克隆到腺病毒载体PDC316上构建成CS+X-/PDC316。二、CS+X--IRES-IL-2/PDC316双表达重组体的构建以质粒IRES/pMD18-T为模板,设计引物经PCR反应在IRES基因片断两端引入SalⅠ酶切位点,克隆到载体pMD18-T。经酶切、测序鉴定后以SalⅠ单酶切质粒,将IRES克隆至PDC316质粒载体。以BamHI酶切IL-2/MNSM,将切下的IL-2基因定向克隆到IRES/PDC316质粒,构建了IRES-IL-2/PDC316质粒。以SalⅠ酶切IRES-IL-2/PDC316质粒,将IRES-IL-2基因片断定向克隆到CS+X-/PDC316,构建了的CS+X--IRES-IL-2/PDC316双表达质粒。三、复制缺陷的乙型肝炎病毒重组体抑制野毒株作用的体外研究将PCH3143质粒上的缺失包装信号的HBV基因组克隆至PDC316载体构建成辅助质粒3143/PDC16。应用脂质体将构建的CS+X--IRES-IL-2/PDC316、CS+X-/PDC316与辅助质粒3143/PDC16共转染HepG2细胞,并分别以质粒CS+X--IRES-IL-2/PDC316、1.3HBV/PDC316、3143/PDC316单独转染为对照。转染后48小时,1)以MTT比色法检测转染质粒对细胞的毒性;2)以RT-PCR检测CS+X--IRES-IL-2/PDC316转染后细胞内融合蛋白的表达,以双抗体夹心ELISA法检测培养上清中的IL-2;3)提取转染细胞培养上清中的病毒颗粒,以过量的DNaseⅠ消化过剩的转染质粒后进行PCR以检测上清中的HBV颗粒。结果证实:1)转染复制缺陷的HBV重组体对细胞无毒性作用;2)单独转染复制缺陷的HBV重组体可以在细胞内表达产生C-S融合蛋白,上清中的IL-2的表达量为（7.89±0.21ng/ml）,但该重组体不能包装成病毒颗粒分泌至细胞上清中;3)复制缺陷的HBV基因组在HBV辅助质粒3143/PDC316的帮助下能有效复制并包装成子代病毒颗粒分泌到胞外。为观察复制缺陷的HBV重组体对野毒株的作用,将HepG2细胞分别用以下质粒或重组体进行共转染:1)CS+X-/PDC316和野生型1.3倍HBV/PDC316质粒,2)CS+X--IRES-IL-2/PDC316和野生型1.3倍HBV/PDC316,3)PDC316和野生型1.3倍HBV/PDC316。转染后48小时收集培养的细胞和上清进行用定量PCR进行HBV的定量检测检测。结果显示,三组细胞中的HBV定量分别为6.45×106copies/ml、5.75×106copies/ml和2.23×107copies/m,CS+X-/PDC316、CS+X--IRES-IL-2/PDC316对野毒株的抑制率分别为71.08%、75.29%,上清中的病毒定量分别为4.06×106copies/ml,5.06×106copies/ml和1.87×107copies/ml,CS+X-/PDC316、CS+X--IRES-IL-2/PDC316对野毒株的抑制率分别为74.20%、72.94%。这些结果表明,复制缺陷的HBV重组体在体外能有效抑制HBV野毒株的复制。结论:本课题成功构建了一种全新的、基于腺病毒载体、能表达IL-2的复制缺陷HBV重组体。该重组体与包装信号序列缺失的辅助质粒PCH3143共转染HepG2细胞后可进行包装、复制,与HBV野毒株共转染HepG2细胞则可显着抑制HBV野毒株的复制。
林占洲[8]（2008）在《构建YMDD变异乙型肝炎病毒稳定表达细胞系的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景乙型肝炎病毒（HBV）感染是一种严重影响人类健康的全球性疾病。它可导致各种急、慢性疾病,包括致命的重型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等。目前治疗慢性乙型肝炎（CHB）的抗病毒药物主要有干扰素及核苷（酸）类似物两大类。核苷（酸）类似物进入体内后通过竞争掺入,取代病毒复制过程中延长聚合酶链所需的与之结构相似的核苷酸,由于核苷（酸）类似物缺乏3′端羟基而不能继续延伸DNA链,从而抑制病毒复制。但是由于核苷（酸）类似物对作为复制模板的共价闭合环状DNA（cccDNA）无作用,核苷（酸）类似物仅能抑制HBV复制而不能完全清除HBV,因此CHB患者需要长时间服用核苷（酸）类似物治疗以抑制病毒复制。然而长期服用核苷（酸）类似物有可能出现病毒变异而导致耐药问题。其耐药的基础是复制过程中,HBV需要利用自身的DNA聚合酶将前基因组RNA逆转录为DNA,由于HBV聚合酶没有校正活性,容易出现错配而导致突变。核苷（酸）类似物作用于HBV的聚合酶区,而聚合酶区基因突变可能导致某些特定部位的氨基酸被置换,使之与药物的结合力下降,从而出现药物敏感性降低和耐药。拉米夫定耐药的变异为HBV DNA聚合酶基因P区第739个核苷酸A突变为G,使第204位的蛋氨酸被缬氨酸替代（rtM204V）,即YMDD突变为YVDD,且往往同时还伴有第180位的亮氨酸被蛋氨酸所置换（rtL180M）的变异。核苷（酸）类似物耐药为目前慢性乙型肝炎抗病毒治疗中所面临的主要难题之一,因此有必要建立核苷（酸）类似物耐药模型用于抗病毒药物的开发、筛选、耐药机理的研究。由于HBV感染有高度的种属和组织特异性,仅感染人和猩猩,而猩猩价格昂贵,来源困难,故动物模型缺乏。在HBV相关研究中,多使用转基因动物模型和体外细胞模型。转基因动物模型由于动物本身的免疫状态及遗传背景尚不十分明确,其使用受到限制。目前体外细胞培养模型主要有三大类:第一类是HBV直接感染细胞模型;第二类是不产生基因整合的瞬时转染细胞模型;第三类是HBV基因与细胞基因组基因整合并持续产生HBV颗粒的稳定表达细胞株。感染模型的细胞来源困难,难以长期培养,使用较少。瞬时转染细胞模型缺点仍为不能长期培养,同时受实验条件影响大。基于耐药研究、药物筛选及评价方面的考虑,细胞模型需要稳定分泌出耐药HBV病毒颗粒。目前国外已有构建此类细胞株及相关的研究,但尚无公认、广泛使用的商品化稳定表达耐药HBV细胞株,因此有必要建立稳定表达耐药HBV体外细胞模型。将DNA有效整合入细胞基因组,其方法主要有非病毒载体法及病毒载体法。前者包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、电击穿孔法及显微注射法等,这些方法得到稳定细胞株的效率相当低。后者主要是逆转录病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体等方法。其中逆转录病毒载体及慢病毒载体对目的基因转移效率高,容易得到稳定表达株。逆转录病毒载体为基于逆转录病毒构建的病毒载体。在构建时,删去了pol、env和gag基因,保留了5’端和3’端的LTR及包装信号ψ序列,并增加了多克隆位点、抗性标记,与质粒拼接而成。而病毒颗粒识别、包装等过程所必须的gag、pol与env基因整合在相应的包装细胞基因组内。逆转录病毒载体转染包装细胞后,将载体DNA插入包装细胞基因组。载体DNA转录出含标记基因、目的基因、包装信号的RNA序列,结合包装细胞内已提供gag、pol与env蛋白,包装出有感染能力的假病毒颗粒。这种假病毒颗粒可感染靶细胞,并将整条病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA上,使之成为其一部分,并能稳定表达目的基因。研究目的构建含rtM204V、rtL180M突变位点的拉米夫定耐药1.3拷贝HBV基因及其重组逆转录病毒载体,通过逆转录病毒载体系统的方法建立表达YMDD变异HBV的稳定细胞株,并进一步鉴定所构建细胞株HBV复制及抗原表达情况。通过本研究探索构建其他核苷（酸）类似物耐药HBV稳定细胞株的方法。研究方法1.使用突变引物YVS、YVA对重组杆状病毒载体上的1.3拷贝野生株HBV的进行rtM204V定点突变。通过突变引物526MS、526MA对目的基因进行rtL180M位点突变。PCR-RFLP鉴定突变是否成功。携带已经突变的目的基因的杆状病毒重组载体瞬时转染细胞以测定目的基因复制活性。2.携带1.3拷贝拉米夫定耐药HBV基因的重组杆状病毒载体质粒与逆转录病毒载体pLNCX2分别进行HindⅢ、SalⅠ双酶切。纯化回收目的片段进行连接,获得含反向目的基因的重组逆转录病毒载体pRV-oYVDDHBV。通过引物HSS和HSA扩增出1.3拷贝拉米夫定耐药HBV基因,并使得PCR产物5’端带有HindⅢ位点,3’端带有SalⅠ位点,经酶切、连接后获得含正向目的基因的重组逆转录病毒载体pRV-YVDDHBV。使用酶切、PCR及测序的方法鉴定所构建重组载体。3.重组逆转录病毒载体脂质体法转染PT67包装细胞,含G418培养基压力筛选后挑取稳定转染细胞克隆,获得含病毒培养上清。4.倍比稀释含重组病毒颗粒的包装细胞培养上清,梯度浓度的含病毒上清感染NIH3T3细胞,含G418培养基压力筛选,以确定病毒滴度。取经感染并筛选后仍存活的NIH3T3细胞,其培养上清再次感染新复苏的NIH3T3细胞,G418压力筛选以确定有无辅助病毒存在。5.含重组病毒颗粒的包装细胞培养上清感染HepG2细胞,经G418筛选稳定细胞株,挑取稳定细胞克隆并扩大培养,最终获得经单克隆分化成长起的细胞株。Abbott化学发光全自动免疫分析仪检测HepG2-YVDDHBV培养上清中的HBsAg及HBeAg的表达,荧光定量法检测上清HBV DNA,免疫组化检测细胞内HBcAg的表达,鉴定上清中HBV复制及抗原表达情况,测序鉴定HBV耐药变异情况。研究结果1.PCR-RFLP的方法鉴定rtM204V突变成功。用逆转录病毒载体多克隆位点两端引物进行PCR及测序,证实定点突变成功。携带已经突变的目的基因的杆状病毒重组载体瞬时转染HepG2细胞,ELISA方法检测HBsAg及HBeAg的表达均阳性。2.HindⅢ及SalⅠ双酶切重组逆转录病毒载体及逆转录病毒载体多克隆位点两端引物PCR检测,两种方法均证实正向插入耐药HBV基因及反向插入耐药HBV基因两种重组逆转录病毒载体构建成功。3.重组逆转录病毒载体转染包装细胞并经过2周G418压力筛选,得到产病毒包装细胞多株。选取正向和反向插入目的基因两实验组细胞各一株行病毒滴度滴定。G418筛选10天后,106倍浓度稀释上清所感染的培养孔则均无细胞生长,而此浓度下感染的培养孔内则有细胞克隆存在,考虑病毒滴度均约在1×105CFU/ml。经检测无辅助病毒存在。4.含反向插入1.3拷贝HBV基因的重组病毒上清感染HepG2细胞并行G418筛选,获得的稳定细胞株常规ELISA法检测培养上清中的HBsAg及HBeAg均为阴性。5.含正向插入1.3拷贝耐药HBV基因的病毒上清感染HepG2细胞,共筛选出7株HBsAg及HBeAg均表达阳性的细胞克隆。挑取其中表达较高一株继续培养并行进一步鉴定,命名为HepG2-YVDDHBV。同时在未突变野生株HBV病毒实验对照组筛选出一株命名为HepG2-WHBV。6.检测HepG2-YVDDHBV培养上清中的HBsAg及HBeAg的表达及HBV DNA定量,2.2.15细胞株及未突变野生株HepG2-WHBV作为对照。结果均为阳性,但HepG2-sYVDDHBV的HBsAg、HBeAg表达及HBV DNA复制与2.2.15细胞株相比均明显低。持续培养8周HepG2-YVDDHBV细胞株培养上清的HBsAg、HBeAg均有持续表达。7.免疫组化检测细胞内HBcAg的表达,结果显示HepG2-YVDDHBV细胞内HBcAg阳性。研究结论成功构建了含rtM204V/rtL180M位点突变的1.3拷贝拉米夫定耐药HBV基因的重组逆转录病毒载体。成功将重组载体转染PT67包装细胞,获得感染性重组病毒颗粒。通过逆转录病毒载体系统的方法,建立了含rtM204V/rtL180M变异HBV基因的稳定细胞株HepG2-YVDDHBV。经检测其HBsAg及HBeAg的表达均阳性,免疫组化可检测到细胞内HBcAg的表达,荧光定量法检测上清中HBVDNA为阳性。培养时间超过8周,HBsAg及HBeAg、HBV DNA持续阳性。测序结果显示上清中HBV存在rtM204V及rtL180M变异,初步认为该细胞株支持拉米夫定耐药HBV复制及表达,但其表达复制水平较低,距实用阶段尚有差距。
孙殿兴,刘风军,胡大荣,胡学玲,范公忍,韩聚强[9]（2007）在《重组逆转录病毒转导HBV载体表达显性阴性突变体抗HBV作用的研究》文中研究说明目的探讨重组逆转录病毒转导HBV载体表达显性阴性突变体的抗HBV作用。方法在逆转录病毒载体中插入两种不同类型表达显性阴性突变体的HBV基因复制单元,制备重组逆转录病毒pRV-CP、pRV-CS和空载体G1Na对照,并转染HepG2.2.15细胞,ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBV DNA,PCR检测上清液中重组HBV颗粒。结果转染HepG2.2.15细胞后3d、5d、7d、9d和11d,pRV-CP、pRV-CS和G1Na对照组对HBsAg表达的平均抑制率分别为（28.9±4.73）%（P<0.01）、（39.3±7.04）%（P<0.01）和（2.6±3.77）%;对HBeAg表达的平均抑制率分别为（40.38±2.59）%（P<0.01）、（33.1±4.27）%（P<0.01）和（3.1±3.02）%;对HBV复制的抑制率分别为67.2%和55.8%,对照组为13.4%。只有pRV-CP组培养上清液中检测出突变型HBV颗粒。结论重组逆转录病毒能转导HBV载体表达显性阴性突变体,对HBV复制及抗原表达有抑制作用,有望用于抗HBV治疗。
王岚[10]（2007）在《乙型肝炎病毒（adr亚型）全基因组转基因小鼠的建立》文中研究说明本研究首先利用已有的adr亚型HBV全基因组与逆转录病毒载体连接构建正连重组质粒pLNCB及反连的重组质粒pLNCBR,鉴定正确后分别转染PA317细胞,包装出毒,进行正向及反向的鉴定后,扩大培养,浓缩病毒,分别选取正向及反向病毒滴度高的病毒,进行受精卵透明带注射构建HBV（adr）全基因组转基因小鼠。对HBV（adr）全基因组转基因小鼠进行PCR、Southern-blotting检测,结果显示:本实验获得了HBV（adr）全基因组转基因小鼠,阳性率为8.7%。同时对HBV（adr）全基因组转基因小鼠进行乙型肝炎病毒标志物ELISA及肝脏、肾脏组织进行了病理、免疫组化（HBsAg、HBcAg）等检测。实验结果表明,构建的转基因小鼠可以传代,血液检测出现HBsAg阳性,病理检测肝脏出现点状坏死或灶状坏死;免疫组化结果表明,在肝脏及肾脏中均出现HBsAg及HBcAg的表达。
二、逆转录病毒载体携带HBV载体表达显性阴性突变体抗HBV作用的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、逆转录病毒载体携带HBV载体表达显性阴性突变体抗HBV作用的研究（论文提纲范文）
（1）候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与 miR-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 宿主基因多态性对乙型肝炎病毒慢性感染易感性及疾病进展的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1. 乙型肝炎病毒 |
| 1.1 HBV的起源与进化 |
| 1.2 HBV的病毒结构 |
| 1.3 HBV的基因组结构及其编码蛋白 |
| 1.4 HBV的感染机制和生命周期 |
| 2. 乙型肝炎病毒感染及其造成的相关肝脏疾病 |
| 2.1 HBV感染的主要宿主 |
| 2.2 HBV的全球流行状况 |
| 2.3 HBV感染的自然历史过程 |
| 2.4 HBV感染慢性化诱发的相关肝脏疾病 |
| 2.5 HBV感染的诊断和治疗 |
| 3. 乙型肝炎病毒感染细胞模型 |
| 3.1 基于人肝癌细胞系的HBV稳定复制细胞系 |
| 3.2 基于原代人肝细胞和原代树鼩肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.3 基于人肝脏祖细胞系HepaRG的HBV感染细胞模型 |
| 3.4 基于受体过表达的人肝癌细胞系的HBV感染细胞模型 |
| 3.5 基于受体过表达的原代猪肝细胞和原代猴肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.6 基于人干细胞分化获得类肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 4. 乙型肝炎病毒感染动物模型 |
| 4.1 灵长类HBV感染模型 |
| 4.2 树鼩HBV感染模型 |
| 4.3 土拨鼠替代模型 |
| 4.4 北京鸭替代模型 |
| 4.5 HBV转基因小鼠 |
| 4.6 基于病毒基因组转染的HBV复制小鼠模型 |
| 4.7 人类肝脏单嵌合小鼠模型支持HBV感染及抗病毒研究 |
| 4.7.1 免疫缺陷小鼠和细胞移植 |
| 4.7.2 uPA缺陷的免疫缺陷小鼠模型 |
| 4.7.3 HSV-tk/NOG小鼠模型 |
| 4.7.4 Fa~(-/-)Rag2~(-/-)IL2rg~(-/-)(FRG)小鼠模型 |
| 4.7.5 FRGS小鼠模型 |
| 4.8 人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型支持HBV相关疾病研究 |
| 4.8.1 AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型 |
| 4.8.2 人肝和人免疫系统双嵌合的FRGN和uPA-NOG小鼠 |
| 4.8.3 A2/NSG-hu HSC/Hep小鼠 |
| 4.8.4 HIS-Hep-FRGN小鼠 |
| 4.8.5 HIS-HUHEP-uPA/NRG小鼠 |
| 5. 人骨髓间充质干细胞的生物学特性 |
| 5.1 人骨髓间充质干细胞的发现 |
| 5.2 人骨髓间充质干细胞的分离纯化和体外培养 |
| 5.3 人骨髓间充质干细胞的多向分化分化潜能和免疫调节功能 |
| 5.4 人骨髓间充质干细胞移植治疗暴发性肝衰竭的分子机制 |
| 6. 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 7. 研究中用到的主要仪器、耗材和试剂 |
| 7.1 主要仪器 |
| 7.2 常规耗材 |
| 7.3 生物化学与细胞生物学常规基础试剂 |
| 7.4 定性和定量检测试剂盒 |
| 7.5 实验用主要溶液及培养基配制 |
| 7.6 常规PCR引物 |
| 7.7 常规抗体和荧光素 |
| 7.8 实验动物和细胞 |
| 8. 常规分子生物学及细胞生物学实验方法 |
| 8.1 ELISA/CLEIA检测 |
| 8.2 Western Blot检测 |
| 8.3 细胞免疫荧光实验 |
| 8.4 免疫组化和病理学染色实验 |
| 8.5 常规流式细胞技术 |
| 8.6 常规哺乳动物细胞培养方法 |
| 9. hBMSC-FRGS小鼠模型构建和鉴定 |
| 9.1 hBMSCs分离、传代培养、冻存、复苏和鉴定 |
| 9.2 FHF-FRGS小鼠的构建及hBMSCs移植手术 |
| 9.3 肝脏灌流分离肝内实质细胞和非实质细胞 |
| 9.4 分离鉴定人源细胞及检测相关标志物 |
| 9.5 鉴定人源肝细胞和鼠源肝细胞是否发生融合 |
| 10. HBV感染相关病毒学和病理学检测 |
| 10.1 不同基因型HBV病毒生产与纯化 |
| 10.2 HBV蛋白与核酸检测方法 |
| 10.3 hBMSC-FRGS小鼠人源免疫反应分析 |
| 10.4 肝硬化诊断方法 |
| 11. 数据处理与统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 hBMSCs移植暴发性肝衰竭FRGS小鼠 |
| 12.1 hBMSCs表型鉴定 |
| 12.2 hBMSCs移植拯救FHF-FRGS小鼠免于死亡 |
| 12.3 hBMSC-FRGS小鼠实现人源肝细胞嵌合 |
| 12.4 hBMSC-FRGS小鼠实现多种人源免疫细胞嵌合 |
| 12.6 嵌合肝脏内的人源肝和鼠源肝细胞未发生融合 |
| 12.7 hBMSC-FRGS小鼠长期安全性评估 |
| 12.8 FHF肝脏微环境是hBMSCs转分化的关键驱动因素 |
| 12.9 第一部分小结 |
| 第二部分 hBMSC-FRGS小鼠支持慢性化HBV感染 |
| 13.1 hBMSC-FRGS小鼠支持多种基因型HBV感染 |
| 13.2 hBMSC-FRGS小鼠支持C基因型HBV感染慢性化 |
| 13.3 第二部分小结 |
| 第三部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠免疫病理生理学研究 |
| 14.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠肝人源内免疫细胞变化 |
| 14.2 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内人源细胞因子变化 |
| 14.3 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠发生重症肝炎 |
| 14.4 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠产生特异性针对HBV抗原的T细胞 |
| 14.5 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠血清HBV特异性抗体水平变化 |
| 14.6 第三部分小结 |
| 第四部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠诱发人源肝硬化 |
| 15.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清学肝硬化指标变化 |
| 15.2 HBV感染肝hBMSC-FRGS小鼠组织学肝硬化指标变化 |
| 15.3 肝硬化区域种属特异性鉴定 |
| 15.4 第四部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 16. HBV细胞模型和动物模型的发展历程 |
| 17. 基于间充质干细胞的人类肝脏再生和免疫系统重建 |
| 18. HBV感染慢性化和诱导肝脏疾病发生的关键机制 |
| 19. 新型HBV抗病毒治疗策略与关肝脏疾病的防治措施 |
| 第五章 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间科研成果 |
（3）HBV C编码链反基因锁核酸阻断HepG2.2.15细胞内病毒复制效果（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 HepG2.2.15细胞培养及HBV活性与亚型鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 HBV C编码链反基因锁核酸设计、筛选及鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 HBV C编码链反基因锁核酸体外抗HBV效果研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 本文结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（4）基于腺相关病毒载体的人工miRNA抗乙型肝炎病毒基因治疗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 AAV8介导amiRNA抑制乙肝转基因小鼠体内HBV复制 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 参考文献 |
| 第二章 衣壳蛋白表面磷酸化位点突变提高AAV-8的体内转导效率 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 参考文献 |
| 第三章 衣壳蛋白表面磷酸化位点突变提高AAV-DJ的体内转导效率 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 英文缩写 |
| 致谢 |
（5）乙型肝炎病毒载体表达的APOBEC3C抗病毒作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 复制缺损型乙型肝炎病毒载体表达的APOBEC3C 抗病毒作用研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒载体表达的核心蛋白与APOBEC3C融合蛋白抗病毒作用研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 APOBEC3 酶家族及内源性抗乙型肝炎病毒作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
（6）新型乙型肝炎病毒载体的构建及初步应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 新型乙型肝炎病毒载体的构建与初步应用实验研究 |
| 引言 |
| 第一部分 新型乙型肝炎病毒载体的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HBV 载体应用一：表达BsdR 的复制缺损型HBV 载体的稳定细胞系的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 HBV 载体应用二：腺病毒-HBV 嵌合载体表达胶原酶II抗肝硬化研究 |
| 一、腺病毒-HBV 嵌合载体的构建与表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 二、硫代乙酰胺诱导大鼠肝硬化模型的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 三、腺病毒-HBV 嵌合载体表达胶原酶2 治疗肝硬化的动物实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 乙型肝炎病毒载体的研究进展 |
| 综述二 肝纤维化的生物治疗 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）复制缺陷的HBV重组体对野毒株的抑制作用（论文提纲范文）
| 英文缩写 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 含HBV复制缺陷病毒基因组的重组腺病毒载体的构建 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分 CS+X~--IRES-IL-2/PDC316双表达载体的构建 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 HBV复制缺陷病毒的体外包装及抗HBV作用研究 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
（8）构建YMDD变异乙型肝炎病毒稳定表达细胞系的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 构建乙型肝炎病毒拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 使用逆转录病毒载体系统新策略构建乙型肝炎病毒拉米夫定耐药株的稳定表达细胞株 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 附录 主要英文缩略词表 |
| 硕士期间的工作 |
| 致谢 |
| 研究生毕业论文统计学审稿证明 |
（10）乙型肝炎病毒（adr亚型）全基因组转基因小鼠的建立（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 综述一：乙型肝炎病毒细胞及动物模型研究进展 |
| 综述二：动物转基因技术研究进展及应用前景 |
| 实验一：乙型肝炎病毒（adr）全基因组重组逆转录病毒载体的构建及鉴定 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、小结 |
| 实验二：乙型肝炎病毒全基因组（adr）重组逆转录病毒包装及滴度测定 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、小结 |
| 实验三：HBV（adr）全基因组转基因小鼠的建立、鉴定及ELISA、病理、免疫组化检测 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、小结 |
| 结论 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间的科研和论文 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 致 谢 |
四、逆转录病毒载体携带HBV载体表达显性阴性突变体抗HBV作用的研究（论文参考文献）
- [1]候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究[D]. 马宁. 河北医科大学, 2020(01)
- [2]人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究[D]. 袁伦志. 厦门大学, 2019(08)
- [3]HBV C编码链反基因锁核酸阻断HepG2.2.15细胞内病毒复制效果[D]. 许桂丹. 右江民族医学院, 2019(01)
- [4]基于腺相关病毒载体的人工miRNA抗乙型肝炎病毒基因治疗研究[D]. 毛莹莹. 南方医科大学, 2016(02)
- [5]乙型肝炎病毒载体表达的APOBEC3C抗病毒作用研究[D]. 李东. 第三军医大学, 2012(11)
- [6]新型乙型肝炎病毒载体的构建及初步应用研究[D]. 刘金霞. 河北医科大学, 2009(10)
- [7]复制缺陷的HBV重组体对野毒株的抑制作用[D]. 姚静娟. 第二军医大学, 2008(02)
- [8]构建YMDD变异乙型肝炎病毒稳定表达细胞系的实验研究[D]. 林占洲. 南方医科大学, 2008(06)
- [9]重组逆转录病毒转导HBV载体表达显性阴性突变体抗HBV作用的研究[J]. 孙殿兴,刘风军,胡大荣,胡学玲,范公忍,韩聚强. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2007(04)
- [10]乙型肝炎病毒（adr亚型）全基因组转基因小鼠的建立[D]. 王岚. 吉林大学, 2007(03)