一、细胞免疫中共刺激分子研究进展（论文文献综述）
邸雪梅[1]（2021）在《猪血凝性脑脊髓炎病毒DNA疫苗的构建及其在小鼠体内的免疫原性评价》文中研究表明猪血凝性脑脊髓炎（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis,PHE）是由猪血凝性脑脊髓炎病毒（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV）引起的猪的一种急性传染病,临床上以呕吐、衰竭以及中枢系统障碍为主要特征,病死率约为30%～100%。PHEV为β冠状病毒属成员之一,其基因组主要编码5种结构蛋白,其中纤突糖蛋白（S）以同源三聚体形式存在,构成了病毒表面的独特纤突结构。三聚体S糖蛋白包含主要的抗原和抗病毒中和决定簇,在介导病毒入侵以及诱导中和抗体产生方面起着关键作用,是疫苗开发的主要靶点。S蛋白可在结构和功能上划分为两个亚基,即S1和S2。S1（N末端球状头）负责与宿主细胞受体结合,S2负责膜融合机制。接种疫苗是预防和控制传染病最为经济、有效的公共卫生干预措施,但目前仍无市售的PHEV疫苗产品,严重阻碍了临床上PHE防治工作的开展。鉴于此,本研究拟以PHEV S蛋白为靶标,研制新型高效的DNA亚单位疫苗,以期为防控PHEV感染流行提供重要的技术储备。本研究首先构建了表达不同长度S基因的真核质粒,经真核表达系统鉴定正确后,大量制备候选DNA疫苗,即pFUSE-S1、pFUSE-S△TM、pFUSE-S△CD。将候选疫苗与佐剂（A1）预混,分别免疫小鼠,免疫组设置如下:pFUSE-S1、pFUSE-S1+A1、pFUSE-S△TM、pFUSE-S△TM+A1、pFUSE-S△TM、pFUSE-S△CD+A1、pFUSE、pFUSE+A1。每周采集免疫受试小鼠血液,分离血清后,检测PHEV特异性抗体、PHEV中和抗体、细胞因子IFN-γ以及IL-4水平。结果表明,三组候选疫苗免疫小鼠后,小鼠血清内特异性抗体水平,随着免疫天数的增加逐渐升高;其中,pFUSE-S△TM组特异性抗体水平最高。pFUSE-S△TM组的中和抗体水平最高,效价可达1:22,显着高于空载体对照组;其次pFUSE-S△CD组,效价水平可达1:20,显着高于空载体对照组。三组疫苗的IFN-γ水平都显着高于对照组,其中pFUSE-S△TM组IFN-γ水平最高,可达106.7 pg/m L;三组疫苗的IL-4水平都显着高于对照组,其中pFUSE-S△TM组IL-4水平最高,可达80.7 pg/m L。免疫35天后,每组随机选取3只小鼠脱颈处死,无菌分离脾脏,进行T淋巴细胞亚群检测。结果表明,三组候选疫苗均可以诱发T淋巴细胞增殖,其中pFUSE-S△TM组CD3+CD4+淋巴细胞百分数高达48.9%,CD3+CD8+淋巴细胞百分数高达70.6%,极显着高于对照组。免疫35天后进行攻毒保护试验,每日观察小鼠精神状态,攻毒结束后进行脑组织病毒载量检测和脑组织HE染色,结果显示,各疫苗免疫组小鼠精神状态均好于空载体对照组。三组候选疫苗组的小鼠脑组织病毒载量均低于对照组,差异显着;脑部病理组织学检查显示,疫苗免疫组小鼠脑部损伤程度均轻于空载体对照组。上述结果表明,本研究研制的DNA亚单位疫苗pFUSE-S1、pFUSE-S△TM、pFUSE-S△CD均可在不同程度上引起机体的细胞免疫和体液免疫,其中以疫苗pFUSE-S△TM,pFUSE-S△CD的效果最优,更适合作为疫苗的候选株,为未来猪血凝性脑脊髓炎病毒疫苗的研发提供了参考。
王馥婧[2]（2021）在《碳青霉烯酶耐药菌的围术期感染诱发肺炎的早期预防措施探索和NDM-1靶向治疗开发》文中研究说明背景:碳青霉烯类抗生素作为人类对抗微生物感染的有力武器,具有效果明确,毒副作用可控,价格易被接受等许多优点。然而,全球广泛出现的碳青霉烯类耐药菌使得这一武器的效果大大被限制,也使得许多临床感染的患者陷入了用药困难甚至无药可用的困境,由于耐药菌感染引起的肺炎也成为了导致包括需手术治疗的患者在内的住院患者预后不良的主要因素之一。时至今日,能够有效抑制碳青霉烯类耐药病原体的安全治疗方法仍然缺乏,或由于各种限制因素无法应用于临床。当缺乏对抗微生物有效的特效药物和治疗方法时,疫苗便成为了人类通过激活自身免疫系统抵抗病原微生物的最有力武器。事实上,COVID-19（Corona Virus Disease 2019）的全球大流行及其疫苗的应用更加验证并强调了人类自身免疫系统仍具有的巨大潜力,以及疫苗在消灭和控制致命病原微生物方面的作用。与特效药的研发相比,疫苗的研发周期大大缩短,效果较为确切,不良反应及副作用明确,更容易控制及掌握,所以仍然被寄予厚望。碳青霉烯类耐药菌通常可分为丝氨酸β内酰胺酶类和金属β内酰胺酶类两大类,而金属β内酰胺酶基因极易在短时间内于不同细菌间通过质粒等传播方式互相污染。目前临床上较为常见的是含有NDM（New Delhi Metallo-β-lactamases）-1基因—bla NDM-1的耐药菌,该基因表达的NDM蛋白可以水解β内酰胺环从而使得碳青霉烯类抗生素无效化。目前临床常见的bla NDM-1致病菌包括肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae,KP）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）和鲍曼不动杆菌等。在我们前期的实验当中发现,使用高温灭活的HIKP（heat inactivated Klebsiella pneumoniae,HIKP）或HIPA（heat inactivated Pseudomonas aeruginosa,HIPA）对小鼠进行免疫,可以使小鼠获得针对于KP或PA的获得性免疫,当面对KP或PA的活细菌感染时,免疫组小鼠肺部菌落计数明显减少,血清及脾脏细胞培养液中的白介素17（interleukin-17,IL-17）及干扰素（?）（interferon（?）,IFN-g）滴度显着升高,提示高温灭活的细菌可以使机体产生强烈特异性的免疫反应,当再次感染同种抗原时获得较好的免疫保护作用。由于HIKP及HIPA中含有多种可能被生物体识别为抗原的物质,我们无法确定究竟是哪一种抗原物质使生物体产生了获得性免疫,而bla NDM-1基因所表达的NDM蛋白也是抗原物质中的一种。据此我们提出如下科学假设:使用重组NDM蛋白（recombinant New Delhi Metallo-β-lactamase,r NDM-1）作为抗原对小鼠进行免疫接种,可使小鼠对其产生特异性免疫记忆,当再次使用转染bla NDM-1的活肺炎克雷伯杆菌（KPndm）对其进行感染时,获得性免疫反应可以将KPndm识别为特异性抗原并进行清除,而未转染bla NDM-1的KP感染生物体时则可以使用抗生素对其进行杀伤。本研究分为两部分,首先,研究重组NDM-1激活小鼠呼吸道免疫反应的作用和机制;其次,研究耐药菌感染机体的靶细胞及其免疫作用机制。方法:1.研究使用r NDM-1诱导小鼠获得性免疫反应后予以活KPndm细菌感染。通过菌落形成单位（colony forming unit,CFU）计数、ELISA、流式细胞技术、RT-PCR等方法观察活细菌感染后不同组小鼠的感染情况,分析体液免疫及细胞免疫在控制肺部KPndm感染当中的作用。并通过分选r NDM-1免疫接种后野生型小鼠的脾脏细胞,通过尾静脉注射的方式建立Rag2/II2rg双基因敲除（Rag2/II2rg double knockout）小鼠细胞移植模型,通过对移植后Rag2/II2rg小鼠进行活KPndm细菌感染来探究免疫细胞移植是否可以为免疫缺陷鼠提供免疫保护,以及进一步探究r NDM-1免疫接种后细胞免疫的作用。2.在免疫接种活KPndm细菌感染模型中,通过流式分选得到CD4+/CD8+细胞,并通过sc RNA-Seq测序技术检测不同抗原免疫接种及活细菌感染后,小鼠免疫细胞关键基因的差异性表达,通过t-SNE分析找出效应细胞及免疫反应机制。结果:1.使用rNDM-1对小鼠进行免疫接种可以使小鼠产生针对于活KPndm细菌的特异性免疫反应。使用rNDM-1进行免疫接种可降低小鼠肺部感染KPndm时的肺部的细菌浓度,起到抗炎保护作用,且该保护作用可被IL-17A抑制剂阻断。收集使用rNDM-1免疫接种+KPndm感染后的野生型小鼠的肺部细胞,通过荧光抗体筛选发现分泌IL-17A（P<0.05）、IFN-g（P<0.05）、IL-22（P<0.05）的T细胞均显着增多,证明该免疫保护作用主要通过T细胞免疫介导。r NDM-1免疫、KPndm感染的小鼠脾脏细胞在r NDM-1或HIKPndm的刺激下会分泌更多的IL-17A（P<0.005）及IFN-g（P<0.01）,同时这种条件下的小鼠Th17/IL17通路其他基因表达量也存在显着上调。2.单细胞基因测序技术证明,当使用OVA或HIKPndm对不同小鼠进行免疫接种,并使用KPndm进行感染的条件下,使用HIKPndm感染的小鼠在感染时会有更多活化状态或增殖状态的T细胞在小鼠肺部聚集,且HIKPndm免疫小鼠的肺脏样本中拥有显着升高的Il17a、Rorc、Rora基因表达量(PIl17a<0.01,PRora<0.001,PRorc<0.05)。另外,免疫活化的T细胞主要分布于增殖T细胞亚群和部分活化T细胞亚群。结论:研究结果表明:rNDM-1免疫接种减少KPndm攻毒小鼠肺部细菌定植量;rNDM-1免疫接种小鼠可在抗原再刺激时上调IL-17A的表达水平;抑制IL-17A减弱rNDM-1免疫接种对小鼠肺部感染的保护作用;rNDM-1免疫接种刺激小鼠体内产生特异性抗体Ig G;T细胞介导的免疫反应在rNDM-1免疫接种过程中发挥重要作用;KPndm感染激活r NDM-1免疫小鼠体内Th17/IL17通路;HIKPndm可以促进小鼠T细胞活化增殖并诱导继发性免疫反应;Th17/IL17通路在小鼠对HIKPndm的免疫应答中发挥重要作用。
高明春[3]（2021）在《IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制》文中提出牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza 3 virus,BPIV3）是引起犊牛呼吸道感染的重要病原体之一,世界各国的牛群感染BPIV3的抗体阳性率通常在50%到90%之间。BPIV3可感染肺上皮细胞与肺泡巨噬细胞,发生组织损伤和免疫抑制,随后继发细菌感染导致严重的支气管肺炎。IL10（Interleukin10,IL10）是极少数具有强大的负调节功能的抗炎性细胞因子,上皮细胞、单核巨噬细胞等都是IL10发挥抑制性作用的靶细胞。许多病毒感染后依靠多种途径诱导宿主IL10表达来负调控宿主免疫应答,IL10负调控免疫应答的相关机制在HIV（Human immunodeficiency virus）、FMDV（Foot-and-Mouth disease virus）、LCMV（Lymphocytic choroid meningitis virus）、PCV2（Porcine circovirus type 2）、PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）等病毒的致病机制中发挥重要作用,BPIV3感染中IL10是否及如何调控免疫应答尚未清楚。本研究分离BPIV3流行毒株并分析其致病特征,证实BPIV3流行株能够感染牛与鼠的上皮细胞与单核巨噬细胞。建立小鼠呼吸道感染模型与鼠原代巨噬细胞感染模型。以小鼠与原代巨噬细胞的高通量转录组数据证实BPIV3可能利用IL10及其重要的下游产物SOCS3（Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3）下调宿主的抗感染免疫应答。随后开展了牛IL10、IL10R1、SOCS3的生物学活性与作用机制研究,证实牛IL10与IL10受体结合转导信号,激活JAK-STAT3通路来迅速高表达SOCS3,在小鼠与牛细胞上都具有类似的生物学活性。最终探索了BPIV3主要依赖My D88、p38 MAPK以及NF-κB信号通路来表达IL10,负调控宿主抗病毒应答并提高BPIV3复制能力的相关机制。本研究为阐明IL10/STAT3/SOCS3信号轴在BPIV3感染中的致病作用和抑制IL10通路防制牛呼吸道传染病奠定了理论基础。首先对2017年黑龙江省、河北省等地的群发犊牛肺炎1793份血清进行了BPIV3的抗体调查,结果表明近70%的犊牛呼吸道疾病可部分归因于BPIV3所参与的感染。随后自病牛鼻拭子中分离到了一株BPIV3,其具有感染MDBK、BHK21、BBEC、BL、BTB、BT、ML、PBMC、BMDM等牛与小鼠多种上皮细胞与单核巨噬细胞的能力。分离株经呼吸道感染小鼠肺脏并对其进行了致病性的分析,感染鼠肺脏发生病理变化,并且肺内病毒在12 d内不能够被完全清除,感染肺脏发生了多种炎性因子的表达,检测到重要的调节性抑炎性因子IL10在感染后的12 d之内,大多数检测时间点的转录均显着高于对照。通过高通量转录组测序、差异表达分析与基因富集及蛋白质相互作用网络分析,在小鼠与原代巨噬细胞感染BPIV3前后重要宿主免疫与调控分子的变化模式。BPIV3感染小鼠与感染巨噬细胞后,在感染早期显着上调了IL10与SOCS3表达,SOCS3几乎在所有分组中都得到了显着的转录激活。大多数组别中Tyk2、STAT1、STAT2、IRF7、ISG15、Mx1、RSAD2、PML等关键抗感染免疫基因被显着下调,IL10与SOCS3参与了BPIV3感染后抑制宿主抗病毒应答。为进一步研究牛IL10的信号转导以及其是否能发挥免疫负调控作用,克隆了牛IL10、牛IL10R1与SOCS3基因并分析其生物信息与进化保守性。对IL10、IL10R1胞外区与SOCS3进行了蛋白表达与纯化,并制备了相应的高效价抗体。采用腺病毒系统表达了牛IL10、IL10R1胞外区,然后在牛与鼠细胞上证实重组IL10可快速并强烈诱导SOCS3的表达,这种作用可以被IL10R1胞外区所抑制。IL10与SOCS3都具有抑制Ⅰ型干扰素及其下游分子表达的功能,即牛IL10与SOCS3可用于牛与鼠细胞的负免疫调控研究,而IL10R1胞外区可作为IL10通路的阻断剂。进一步探讨BPIV3感染中IL10参与负调控的相关机制,研究表明BPIV3以时间与剂量依赖性的方式诱导原代巨噬细胞与肺上皮细胞在感染极早期迅速上调IL10的m RNA并大量分泌IL10蛋白,同时TNF-α与Ⅰ型干扰素及其下游蛋白Mx1的表达受到了显着的抑制。IL10在原代巨噬细胞中的产量远高于上皮细胞,外源与内源性的IL10都可提高BPIV3的滴度。IL10R1胞外区作为游离的受体竞争掉IL10或抑制剂阻断IL10产生的通路都能降低病毒的复制能力。在My D88（Myeloid differentiation factor,MYD88）缺失与My D88抑制剂处理的BMDM细胞上,IL10/SOCS3的表达大幅降低,表明依赖My D88分子转导信号的通路在BPIV3感染过程中诱导IL10的表达起到了重要作用。此外,应用通路抑制剂证实NF-κB和p38 MAPK在BPIV3诱导IL10表达中为关键通路。JAK-STAT通路中的多种JAK与STAT分子均参与IL10与BPIV3之间复杂的调控作用。综上所述,BPIV3是我国犊牛传染性肺炎的主要病原之一,感染后可显着上调IL10与SOCS3的表达并引起宿主免疫抑制,主要下调以Ⅰ型干扰素及其下游分子介导的抗病毒应答,这种由IL10介导的负调控依赖于My D88、NF-κB和p38 MAPK信号通路。本研究可为进一步阐明BPIV3的分子致病机制与开发以调控IL10为靶标的免疫防控提供理论基础。
苏雅婷,吕杰,牛雯娟,魏芳[4]（2021）在《PD-L1、B7-H3及B7-H4在宫颈癌免疫治疗中的研究进展》文中进行了进一步梳理宫颈癌是我国常见的妇科恶性肿瘤,其发生和发展常与免疫逃逸有关,免疫治疗已经成为目前宫颈癌治疗的研究热点。随着免疫检查点程序性死亡配体1（PD-L1）及程序性死亡受体1（PD-1）的抑制剂在多种恶性肿瘤中的成功应用,以PD-L1为代表的共刺激因子与宫颈癌的研究愈发受到关注,其中负性共刺激因子与宫颈癌免疫抑制密切相关。PD-L1即B7-H1,与B7-H3和B7-H4都属于常见的负性共刺激因子,其通过抑制免疫反应,使癌细胞发生免疫逃逸。许多研究显示PD-L1、B7-H3和B7-H4在宫颈癌中异常高表达,抑制了对宫颈癌细胞的免疫应答,在宫颈癌的发生发展、侵袭转移和预后等方面具有相应的临床意义。对负性共刺激因子PD-L1、B7-H3和B7-H4的生物学功能以及在宫颈癌中的表达和应用进展进行综述,以期为宫颈癌的免疫靶向治疗提供新思路。
古丽玲[5]（2021）在《间充质干细胞旁分泌蛋白在软骨修复中的作用及机制研究》文中认为关节软骨缺损是骨关节临床最常见疾病之一,由于软骨组织内没有血管供应、神经支配和淋巴回流,组织内的软骨细胞的迁移及增殖能力较低,导致软骨自我修复能力很差,各种损伤、炎症和退行性病变均可引起不可逆性软骨损伤。目前临床上多采用以药物缓解疼痛为主的保守治疗,无法实现软骨的再生修复。研究人员在积极尝试通过用外科手术的方式来探寻更好的治疗方式,虽然目前采取的微骨折、自体软骨/软骨细胞移植等技术有一定的效果,但是仍难以实现完美的软骨组织及功能的再生修复。目前,基于干细胞来源广泛,免疫原性低,具备多向分化功能等优势开展的干细胞组织工程已成为软骨再生修复的一种新治疗策略。干细胞在组织修复中所发挥的作用及其机制迅速成为研究热点。随着对干细胞旁分泌因子在组织修复中发挥重要作用的认识,利用间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）旁分泌体进行无细胞治疗来替代传统细胞疗法受到越来越多研究者的关注。为了探究MSCs的旁分泌体在治疗骨性关节炎所致软骨缺损中发挥的作用及机制,本文首先比较了体外培养MSCs所获条件培养基（Conditioned medium,CM）中所含MSCs旁分泌体不同组成成分:可溶性蛋白（Soluble Proteins,SPs）、外泌体（Exosomes,Exos）和微泡（Micro-vehicles,MVs）对保护炎症刺激下软骨细胞表型及促进软骨修复的作用差异。接着研究了脂肪间充质干细胞（Adipose Tissue-derived Stem Cells,ADSCs）及骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Derived Stem Cells,BMSCs）在2D/3D培养条件下所得CM维持软骨细胞表型能力的差异,通过蛋白质组学技术及生物信息学分析找到了ADSCs来源SPs中发挥软骨保护作用的可能蛋白为网钙结合蛋白-2（Reticulocalbin-2,RCN2）。最后通过构建RCN2低表达和过表达细胞系初步阐明了RCN2在调控软骨细胞表型中发挥作用的可能机制。主要研究结果如下:1.体外培养大鼠软骨细胞在促炎因子IL-1β存在的情况下,培养基中添加大鼠BMSCs来源的CM成分SPs能更好的恢复软骨细胞表型,而添加CM中另两种主要成分Exos和MVs效果不明显。提示BMSCs的旁分泌体中,可能发挥保护软骨细胞免受炎症环境影响维持其正常形态及表型作用的,不是Exos和MVs而是SPs。在大鼠OA模型中关节腔注射Exos、MVs和SPs,通过对样本的组织学评价也证实了SPs能够促进大鼠软骨基质形成。2.将ADSCs和BMSCs培养于不同2D/3D条件以制备CM,经PCR和Western blot实验检测发现ADSCs来源的CM更有利于维持软骨表型;ADSCs组间比较发现,3D培养所得的CM维持软骨表型效果优于2D培养所得CM,而3D支架孔径的改变对所得CM维持软骨表型能力的影响不大;通过蛋白组学对各CM中SPs进行差异蛋白比对分析,发现ADSCs各组SPs间3D培养组与2D培养组对比所得差异蛋白数量多于不同孔径3D支架之间对比,说明3D支架孔径的改变对CM中SPs表达差异影响不大;通过蛋白组学对及生物信息学分析,我们从ADSCs来源的SPs中优选了四个最可能影响软骨细胞表型的分子:CAPNS1、LAL、MAT2A和RCN2,对上述四个分子进行sh RNA转染实验检测其对软骨细胞软骨表型的影响,结果显示RCN2基因下调后,MMP-13的表达明显降低,SOX-9的表达增加,但对Col-X和Col-I表达影响较少,提示RCN2相对其他蛋白对软骨细胞软骨表型的影响更大,可能是SPs中的主要功能蛋白。3.通过构建稳定的人/大鼠的软骨细胞低表达和过表达RCN2细胞系,研究RCN2调控软骨细胞软骨表型的机制。结果显示:敲低RCN2后软骨基质降解酶MMP-13和ADAMTS-5的表达量降低,软骨基质标志蛋白Col-II、SOX-9、ACAN升高,过表达RCN2后软骨基质降解酶MMP-13和ADAMTS-5的表达量升高,软骨基质标志蛋白Col-II、SOX-9、ACAN降低,进一步实验发现敲低RCN2后NFAT1、NFAT2的表达水平升高,过表达后相反。提示:RCN2可能通过NFAT信号通路调控软骨基质的形成。综上所述,本文明确了骨髓间充质干细胞分泌体中的SPs相比Exos和MVs能更好的恢复促炎因子IL-1β存在下的软骨细胞形态及软骨表型。脂肪间充质干细胞来源的CM在维持软骨细胞软骨表型方面优于骨髓间充质干细胞,3D支架培养所得CM优于2D培养,3D支架孔径的改变对CM功能影响不大。通过蛋白质组学数据筛选出ADSCs来源SPs中RCN2可能对软骨基质有影响,进一步实验证实RCN2可能是通过NFAT信号通路调控软骨细胞表型。
耿陈露[6]（2021）在《来那度胺增强T细胞抗肿瘤活性的功能与机制研究》文中研究说明T细胞是抗肿瘤免疫反应的重要组成部分,是肿瘤免疫治疗的主要作用对象。充分激活T细胞需要TCR（T cell receptor）识别MHC（Major histocompatibility complex）呈递的抗原多肽产生抗原信号,还需要一系列共刺激信号。T细胞表面的CD28共刺激受体与B7配体相互作用,激活下游共刺激信号,促进T细胞的激活和效应细胞功能,这对充分激活T细胞抗肿瘤免疫反应至关重要。但在人体衰老过程和部分实体瘤中,CD8+T细胞表面的CD28蛋白表达会逐渐缺失,CD28的缺失会导致T细胞免疫反应不足以及PD-1/PD-L1（Programmed death-1/programmed death-ligand 1）免疫检查点抑制剂失效。来那度胺（lenalidomide）是一种免疫调节药物（Immunomodulatory drugs,IMi Ds）,可以在缺少CD28和B7相互作用的情况下共刺激T细胞,但来那度胺能否在实体瘤中通过共刺激CD28-T细胞弥补CD28缺失导致的T细胞免疫反应不足以及PD-1/PD-L1抗体治疗失效并没有得到阐述。我们构建了CrbnI391V基因敲入小鼠模型,在小鼠中模拟来那度胺对人源T细胞的共刺激作用,用于探讨来那度胺的共刺激作用对实体瘤免疫治疗的意义。我们的研究结果表明,在CD28缺失的CrbnI391V小鼠中,来那度胺共刺激CD28-CD8+T细胞,增强T细胞免疫反应,可以抑制肿瘤生长并弥补CD28缺失导致的PD-1抗体治疗失效。在结直肠癌病人的肿瘤样本中,来那度胺可以共刺激CD28-CD8+T细胞,并增强这群T细胞对PD-1抗体的响应。在分子机制层面,已知来那度胺可以在T细胞中靶向CRL4CRBN E3泛素连接酶导致转录因子IKZF1（Ikaros）和IKZF3（Aiolos）泛素化降解,上调白细胞介素-2（Interleukin-2,IL-2）。我们进一步揭示来那度胺可以在CD8+T细胞中上调一些Notch靶基因的表达,而来那度胺在Cd28-/-CrbnI391V小鼠中恢复PD-1抗体的肿瘤抑制效果需要IL-2和Notch信号的参与。这些结果提示,来那度胺有望在肿瘤中浸润有大量CD28-CD8+T细胞的实体瘤病人中增强PD-1抗体的疗效,这一发现对实体瘤的免疫治疗具有一定的临床指导意义。我们尝试进一步挖掘来那度胺的共刺激作用在实体瘤中的治疗潜力。为此,我们通过体内CRISPR文库筛选系统性地寻找能够增强结肠癌细胞对来那度胺治疗敏感性的基因突变,并发现Ptpn2、Jak1和Eef2等基因突变使得小鼠结肠癌细胞对来那度胺的治疗更加敏感。这为充分发挥来那度胺在结肠癌中的免疫治疗潜力提供了潜在的生物标志物和联合治疗靶点。最后,我们利用Cd28-/-CrbnI391V小鼠CD8+T细胞筛选了一些来那度胺类似物,并发现了两个全新的化合物可以高效地共刺激CD8+T细胞,将来可用于进一步肿瘤免疫治疗的研究。创新点:1.明确来那度胺可以在体内和体外共刺激CD28-CD8+T细胞,有望弥补CD28缺失导致的T细胞免疫反应不足。2.发现来那度胺有可能弥补CD28缺失导致的PD-1抗体治疗失效。3.发现来那度胺可以在CD8+T细胞中上调一些Notch靶基因的表达,并确定了这是来那度胺共刺激CD8+T细胞的分子机制之一。4.通过CRISPR文库筛选发现Ptpn2、Jak1和Eef2等基因突变使得小鼠结肠癌细胞对来那度胺治疗更加敏感。
窦莉[7]（2021）在《“加味益神启窍方”治疗脓毒症相关脑病的临床及实验研究》文中研究表明研究目的:（1）评估“加味益神启窍方”对脓毒症相关脑病脑功能及免疫功能的影响,并探讨其作用机制。（2）构建脓毒症相关脑病动物实验模型,通过观察“加味益神启窍方”对炎症介质和胆碱能系统的影响,探究其分子机制。研究方法:（1）纳入2020年1月至2021年2月入住江苏省中医院EICU符合脓毒症脑病诊断的患者共计40例。分为中药组和对照组,每组各20例。两组均采用标准治疗,在此基础上,中药组给予“加味益神启窍方”:生石膏30g、黄芪30g、黄芩10g、当归10g、石菖蒲10g、桃仁10g、白芷10g、大黄5g。浓煎至100ml,每日两次;对照组给予等量温开水鼻饲。两组治疗疗程均为5天。入院后第1个24h记作day1,比较两组全身炎症指标[白细胞计数（WBC）、中性粒细胞计数（NEUT）、超敏C反应蛋白（hs-CRP）、降钙素原（PCT）]),神经损伤生化标志物（NSE、5100β）、血清细胞因子（IL-6、IL-1B、IL-2、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ）、胆碱能相关指标（血清 AchE、ChAT）、T细胞亚群计数、GCS评分、APACHEⅡ评分和SOFA评分;治疗期间进行安全性评价,记录患者肝肾功能、血常规、凝血功能;随访至28天,记录两组患者血管活性药物使用时间、机械通气时间以及病死率。（2）将36只雌性SD大鼠随机分为正常组、模型组、中药组,每组12只。按照分组及给药方案给药一次,除正常组外,剩余动物采用盲肠结扎穿孔法（CLP）建立脓毒症模型。观察24小时,脓毒症大鼠出现神经行为异常,神经行为学评估:神经反射评分≤6分判定模型成功。①造模成功后三组大鼠继续给予生理盐水灌胃,按30ml/kg/24小时,每2小时一次。中药组按0.5ml/100g分三次灌胃给药（1h、3h、5h）,空白组与模型组在每个时间节点给予等量生理盐水。②给药6h后:检测3组大鼠腹静脉血NSE、S100β、TNF-α、IL-6、AchE、ChAT和神经反射评分,并随机处死各组大鼠各6只,取一半脑组织匀浆上清液用于行NSE、S100β、TNF-α、IL-6、AchE、ChAT检测;另一半脑组织切片、染色,观察致密神经元的比例及脑细胞凋亡情况。③给药12h后:检测3组剩余大鼠血清NSE、S100β、TNF-α、IL-6、AchE、ChAT及神经反射评分,处死所有大鼠后用取一半脑组织匀浆上清液检测NSE、S100β、TNF-α、IL-6、AchE、ChAT;另一半脑组织切片、染色,观察致密神经元的比例及脑细胞凋亡情况。研究结果:（1）临床研究表明:①与day1比较,中药组day5的WBC、NEUT及PCT均显着下降（P<0.05）,且经中药治疗,day5中药组PCT较对照组明显下降（P<0.05）。与day1相比,中药组IL-5、IL-6及IL-17均显着下降（P<0.05）,TNF-α非常显着下降（P<0.01）,IL-4和IL-10均显着上升（P<0.05）;对照组IL-6、IL-17及TNF-α均显着下降（P<0.05）;且中药干预后IL-6及TNF-α水平明显低于对照组（P<0.05）。②两组患者day5与day1比较,NSE及S100β水平均显着下降（P<0.05）,其中中药组NSE水平呈非常显着下降（P<0.01）;中药干预后,NSE水平较对照组显着下降（P<0.05）,但两组S100β水平无统计学差异（P>0.05）。③与day1比较,治疗后中药组及对照组AchE含量均有非常显着下降（P<0.05）,且中药干预后,与对照组相比,AchE含量有显着下降（P<0.05）。两组治疗前后及两组间ChAT水平均无统计学差异（P>0.05）。④治疗后与day1相比,两组组患者GCS评分均有显着的提高（P<0.01,P<0.05）,且中药干预后GCS评分较对照组有非常显着改善（P<0.01）。⑤两组患者day1、day5,GCS评分对SAE患者预后评价的ROC曲线下面积（AUC）分别为:0.624、0.784,根据约登指数取GCS评分的最佳截断值点为day5中≦8分,敏感度77.78%,特异度68.18%,95%置信区间（0.626,0.898）。两组患者day1、day5,S100β水平对SAE患者预后评价的ROC曲线下面积（AUC）分别为:0.600.681,根据约登指数取5100β水平的最佳截断值点为day5中>0.37ug/l,敏感度为94.44%,特异度为36.36%,95%置信区间（0.514,0.819）。⑥GCS评分和NSE水平呈负相关（P<0.001）;GCS评分和S100β水平呈负相关（P<0.001）。⑦与day1相比,两组患者CD4+水平均显着升高（P<0.05）;经中药干预后,患者CD8+水平显着下降（P<0.05）,且较对照组下降更加明显（P<0.05）。两组患者经治疗后,day5与day1相比,CD4+/CD8+均显着升高（P<0.05）,且中药组较对照组治疗后有非常显着差异（P<0.01）。⑧中药组及对照组经治疗后,APACHEⅡ评分和SOFA评分均有非常显着下降（P<0.01）,但两组组间相比无统计学差异（P>0.05）。对照组相比,中药组患者血管活性药物使用时间明显降低（P<0.05）。（2）动物实验表明:①病理学观察,模型组6h和12h的节细胞数明显高于正常组(P<0.01;中药干预后6h和12h,中药组核固缩数明显低于模型组（P<0.01）;同时,中药干预6h与12h之间也有显着性差异（P<0.05）。②TUNEL结果显示,模型组6h和12h脑细胞凋亡率明显高于正常组（P<0.01）;中药治疗后6h和12h,中药组脑细胞凋亡率明显低于模型组（P<0.05）;中药治疗6h和12h的细胞凋亡率也有显着性差异（P<0.05）。③ELISA法结果显示,与正常组相比,模型组血清和脑匀浆中IL-6、TNF-α、NSE和S100β水平在6h和12h均明显高于正常组（P<0.01）;中药干预后6小时和12小时,中药组血清和脑匀浆中IL-6、TNF-α、NSE和S100β的水平均明显低于模型组（P<0.05）;同时,中药干预6h和12h的测量水平之间的差异也非常显着（P<0.05）。④IHC染色结果显示,模型组6h和12h脑组织中IL-6和TNF-α蛋白表达明显高于正常组（P<0.01）;与模型组相比,中药组治疗后6h和12h脑组织IL-6和TNF-α蛋白表达明显抑制（P<0.05）。模型脑组织在6小时和12小时的AchE和ChAT蛋白表达显着增加（P<0.01）;中药干预后,中药组6h和12h脑组织中AchE和ChAT的蛋白表达水平均显着低于模型组（P<0.05）;同时,中药干预6h和12h时AchE和ChAT蛋白的表达也存在显着差异（P<0.05）。结论:（1）脓毒症脑病是脓毒症的最常见并发症之一,神经—免疫—炎症反应是导致SAE损伤的主要原因。（2）“加味益神启窍方”可以改善SAE患者全身炎症反应,减少促炎因子的释放,提高抑炎因子水平,减轻失控炎症反应介导的脑损伤。（3）“加味益神启窍方”可以通过调节胆碱能系统发挥抗炎作用。（4）SAE患者存在一定程度免疫抑制,“加味益神启窍方”可以改善患者免疫抑制状态,通过降低抑制性T淋巴细胞及增加辅助性T淋巴细胞发挥作用。（5）“加味益神启窍方”可以改善SAE患者脑功能,缩短血管活性药物使用时间,但对病死率及28天生存率无改善。（6）SAE患者血清S100β与脑功能严重程度呈负相关,通过检测血清S100β水平诊断及评估SAE具有可行性。（7）脓毒症可诱导大鼠神经炎症反应,“加味益神启窍方”可通过改善脓毒症神经炎症反应达到脑保护作用。胆碱能系统的损伤可导致脓毒症大鼠脑损伤,“加味益神启窍方”对脓毒症所致胆碱能系统损伤有一定的改善作用。
杨韧[8]（2021）在《MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究》文中指出冠状病毒（Coronavirus）是一类含包膜结构的单股正链非节段的RNA病毒,广泛分布于多种哺乳动物宿主中,具有跨种传播能力。目前已知感染人类的冠状病毒有7种,其中严重急性呼吸综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）与 201 9 新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）是三种高致病人感染冠状病毒,在不同地区国家都曾造成严重的疫情危害。MERS-CoV自2012年首次于中东地区发现,2015年曾在韩国引发严重疫情,而至今依旧在部分地区发现偶发病例。2019年12月底由SARS-CoV-2引起的COVID-19（Corona Virus Disease 2019）疫情快速在全球蔓延,至今依旧没有得到有效的控制。然而,针对几种高危冠状病毒,目前尚无特效治疗性药物。因此,开发安全且有效的疫苗是控制病毒感染的最有效手段。亚单位疫苗及核酸疫苗,具有安全性高,易于生产制备研发等良好特点。本文基于前期的研究结果,使用哺乳动物细胞表达系统制备了基于MERS-CoV S蛋白RBD结构域的亚单位疫苗蛋白,使用肌肉或滴鼻免疫的方式在小鼠体内评价了抗原蛋白免疫原性。另外,研究基于重组RBD蛋白设计制备了信使RNA（Messenger RNA,mRNA）疫苗与自扩增RNA（Self-amplify mRNA,saRNA）疫苗,并在小鼠体内对两种RNA疫苗的免疫原性进行初步的评价。COVID-19疫情早期,我们设计了密码子优化序列的SARS-CoV-2 S蛋白的DNA疫苗与mRNA疫苗,其中mRNA疫苗与上海斯微公司合作研制。两种核酸疫苗在不同品系小鼠内进行免疫应答研究,并进行攻毒保护实验,探究疫苗的保护性。具体研究内容如下:1.MERS-CoV RBD重组亚单位疫苗和mRNA疫苗的设计与免疫原性研究MERS-CoVRBD偶联不同三聚体基序在CHO细胞表达制备的蛋白具有不同的聚集倾向,偶联T4f基序的RBD蛋白可以形成以三聚体为主二聚体为辅的高聚集态。重组蛋白RBD-T4f配合铝佐剂或铝佐剂联合CpG ODN均可以有效在BALB/c小鼠内诱导高滴度中和活性的抗体,不同佐剂的使用在细胞免疫水平表现有所差异。重组蛋白RBD-T4f配合CTA1-DD或CpG ODN佐剂滴鼻免疫可以有效诱导系统性及呼吸道局部免疫应答,在血液及呼吸道黏膜均可检测到高滴度的中和活性抗体,并可在肺组织局部检测到的高水平特异性细胞免疫应答。重组抗原RBD-T4f序列插入体外转录载体,通过酶促反应制备了重组抗原的mRNA与saRNA疫苗。研究同时对SFV4骨架saRNA的体外转录反应进行优化,成功制备了完整专一的长链saRNA分子,优化后的saRNA进入小鼠体内后可以持续表达目的蛋白至少11天。使用LPP技术包裹的重组抗原RBD-T4fmRNA疫苗初免后可以诱导抗原特异性IgM应答,两次免疫可以诱导特异性IFN-γ分泌细胞,高剂量三次免疫可以诱导一定水平的中和活性抗体产生。使用in vivo jet-PEI包裹的saRNA疫苗在免疫两次后可诱导高水平的细胞免疫应答,但难以诱导产生体液免疫应答。2.SARS-CoV-2 DNA与mRNA核酸疫苗免疫原性与保护效果研究研究对SARS-CoV-2 S蛋白序列进行人源细胞密码子优化,基于该序列设计制备了 DNA疫苗与化学修饰的mRNA疫苗。DNA疫苗使用肌肉免疫附电穿孔免疫部署后,可以有效诱导具有中和活性的特异性体液免疫应答,并诱导高水平Th1偏向的特异性细胞免疫。高剂量两次免疫后可产生攻毒保护效果。mRNA使用LPP技术包裹后物理稳定性良好,该方法生产的mRNA-LPP疫苗具有良好的免疫原性。免疫后可诱导产生高滴度的中和抗体,且具有一定的广谱中和性,可中和多种突变株病毒。高剂量两次免疫后,高水平的中和抗体与Th1偏向的细胞免疫记忆可保持13周。SARS-CoV-2攻击后,高剂量单次与两次免疫的C57BL/6小鼠肺组织病毒滴度显着降低,并有效缓解炎症病变;高或低剂量两次免疫的BALB/c小鼠也表现出相似良好的攻毒保护效果。另外,mRNA-LPP疫苗在恒河猴中也表现出良好的免疫原性,诱导高滴度广谱中和抗体,并产生攻毒保护效果。综上所述,本研究使用CHO制备的MERS-CoVRBD-T4f重组抗原蛋白具有良好的免疫原性,可以诱导高滴度的中和抗体,配合合适的佐剂可以用于传统疫苗及黏膜疫苗的制备。基于重组抗原RBD-T4f设计的mRNA与saRNA疫苗诱导体液免疫能力相对有限,但可以诱导高水平的特异性细胞免疫应答。基于SARS-CoV-2 S蛋白优化序列的DNA疫苗与含化学修饰的mRNA-LPP疫苗均具有良好的免疫原性,可诱导高滴度的中和抗体及高水平的Th1型细胞免疫应答。合适的免疫剂量与方案可以诱导足够强的免疫应答,产生攻毒保护效果。这些研究为冠状病毒的疫苗研发及应用奠定了理论基础。
周凌浩[9]（2021）在《血和支气管肺泡灌洗液中共刺激分子sB7-H1在儿童肺炎支原体肺炎发病机制中的相关性研究》文中研究表明
高文双[10]（2021）在《DOK3通过与GPR84相互作用参与小胶质细胞介导的神经病理性疼痛》文中认为研究背景神经病理性疼痛（Neuropathic Pain,NP）为一难治的临床问题,也是世界性的公共健康问题。它是由于躯体感觉系统的疾病或异常导致的疼痛,它反映了神经系统的异常兴奋性,并存在多种解剖和功能的改变。不同于只伴随伤害性刺激存在而存在的生理性疼痛,神经病理性疼痛可对正常无害刺激表现为自发性疼痛和痛觉过敏。既往研究表明神经病理性疼痛的机制非常复杂,涉及到整个躯体疼痛感受通路:从周围神经损伤到背根神经节神经元兴奋性增加,再到脊髓和大脑神经通路的改变,可贯穿整个神经系统。神经病理性疼痛的发病机制不仅是神经元结构和功能的改变,还是卫星细胞、雪旺细胞、外周的免疫系统、星形胶质细胞、脊髓小胶质细胞和多种细胞组成部分共同参与形成的结果。在中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）中,小胶质细胞作为脊髓的常驻巨噬细胞,起源于卵黄囊原始巨噬细胞。这些细胞广泛分布于整个中枢神经系统中,时刻监测局部环境的变化,以便对各种有害刺激做出快速的免疫应答,介导炎症反应。既往研究表明在神经病理性疼痛的发展过程中,小胶质细胞中的各种炎症因子受IFN-y/IFN-γ受体系统、Toll 2/ToIl 3/Toll 4样受体、嘌呤P2X4受体以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的调节。此外,在机械痛觉过敏的发展过程中,小胶质细胞在与邻近神经元的信息传递中发挥了关键作用。因此,脊髓小胶质细胞是逆转神经系统功能紊乱的一个潜在的治疗靶点,因此,探究小胶质细胞中分子的功能对揭示神经病理性疼痛及痛觉过敏的潜在机制和寻找治疗神经病理性疼痛的新方法、新思路是至关重要的。适配器分子作为分子支架精确地组织效应器蛋白相互结合形成信号复合体。已知的DOK3（Downstream of Kinase-3）是一个典型的适配器分子,为DOK家族的成员之一,主要表达于免疫细胞中,如巨噬细胞、B细胞以及浆细胞。越来越多的研究表明DOK3主要涉及免疫信号通路的负反馈调控,并参与促进或维持免疫细胞中抑制性因子的激活。既往研究表明,抑制DOK3的表达可增加巨噬细胞中维生素B6的抗炎作用,并且在TLR9信号通路中,DOK3的降解增加了巨噬细胞中炎症因子IL-6和TNF-α的产生。然而,有趣的是,对于适配器蛋白在细胞内信号通路中扮演的促进或抑制角色仍然存在争议。一个典型的例子为突触相关蛋白（Synapse-Associated Proteins,SAP）,其在不同的信号通路中主要发挥促进或抑制作用主要取决于激活的不同的信号通路及细胞类型。据文献报道,适配器蛋白DOK3在B细胞的演变进化过程中起着重要作用,在DOK3-/-小鼠中,浆细胞的产生明显减弱;流感病毒感染DOK3缺陷的巨噬细胞,IFN-β的合成明显受限;此外,DOK3在巨噬细胞TLR3信号的转导中也起着关键作用。总的来说,尽管这些结果是非常可信的,但其在理论上存在一定的矛盾,因此,需要进一步的研究来阐释适配器蛋白分子DOK3的双向作用机制。既往研究表明G蛋白偶联受体（G-Protein Coupled Receptors,GPCRs）为一种七次跨膜、与G蛋白偶联参与细胞内信号转导的膜受体,研究表明人体中存在近一千余种不同的G蛋白偶联受体,可被炎症介质、神经递质、肽类、细胞因子等配体激活,参与各种信息传递过程,如细胞代谢、神经传递、免疫炎症反应的调控等,其异常激活或抑制与多种疾病的发生密切相关,并且还参与神经病理性疼痛及痛敏的形成。研究表明GPR84作为G蛋白偶联受体,病理条件下,在巨噬细胞和小胶质细胞中的表达显着上调,介导神经病理性疼痛和炎症介质的产生和维持,并且,在内毒素血症或多发性硬化症小鼠模型中,小胶质细胞以强烈、持续的方式表达GPR84。因此,GPR84是介导炎症相关疾病的有效靶点。了解抑制炎症反应及信号传递的机制对治疗神经病理性疼痛及炎症反应非常重要,因为神经损伤与炎症反应可导致严重的神经病理性疼痛及痛觉过敏等问题。尽管DOK3在巨噬细胞、B细胞等的作用已有广泛研究,但DOK3在小胶质细胞中扮演的角色及DOK3与GPR84蛋白之间的相互作用关系目前尚不清楚。基于以上研究背景,本研究对DOK3和GPR84在小胶质细胞介导的神经病理性疼痛和炎症反应及其相互作用机制进行探讨,可为神经性疼痛的临床治疗提供新的靶点及思路。第一部分DOK3通过与GPR84相互结合参与小胶质细胞介导的炎症反应研究目的1.明确DOK3在小胶质细胞介导的炎症反应中的表达变化及其作用。2.探究DOK3是否参与介导GPR84激活诱导的小胶质细胞的炎症反应。3.验证DOK3与GPR84在小胶质细胞中的相互作用关系。研究方法1.用干扰DOK3表达的慢病毒序列转染小胶质细胞,建立稳定的DOK3敲减细胞系。通过免疫印迹和实时荧光定量PCR分析确定转染成功率及敲除效率。2.实时荧光定量PCR检测DOK3下调组较正常对照组小胶质细胞DOK3,TNF-α,IL-1β,IL-6,iNOS,P38,CD68,CD11B,Argl 和 CD206 mRNA 水平的表达变化。3.不同浓度的GPR84激动剂（6-OAU）孵育小胶质细胞120分钟,实时荧光定量PCR检测不同刺激浓度下DOK3 mRNA水平的变化。应用Western Blot免疫印迹检测DOK3,p-p38和Iba-1蛋白水平的变化。4.6-OAU分别孵育DOK3下调组与正常对照组小胶质细胞,实时荧光定量PCR检测TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA水平的变化。5.脂多糖（LPS）刺激小胶质细胞4小时和8小时,荧光共聚焦分析检测GPR84和DOK3蛋白水平的变化。6-OAU刺激小胶质细胞1小时和2小时,荧光共聚焦分析检测GPR84和DOK3蛋白水平的变化。6.LPS孵育小胶质细胞4小时,通过免疫共沉淀分析DOK3与GPR84的蛋白免疫印迹,探究DOK3与GPR84蛋白相互作用关系。7.重组GST和GST-DOK3纯合蛋白分别与小胶质细胞裂解液孵育2小时。应用GST-pulldown实验检测GPR84,确定GPR84的蛋白水平,验证DOK3与GPR84是否存在物理性结合。研究结果1.干扰DOK3表达的慢病毒序列有效下调小胶质细胞内DOK3的水平设计靶向下调DOK3 mRNA的慢病毒序列#1、#2、#3,Western Blot与实时荧光定量PCR分析检测DOK3蛋白与RNA水平的变化。与对照组病毒序列相比较,转染慢病毒序列#3使DOK3蛋白与mRNA水平下调最明显,DOK3 mRNA水平下降约50%。因此,后续实验采用序列#3转染小胶质细胞下调DOK3水平的表达。2.DOK3敲减导致小胶质细胞炎症因子释放减少。干扰DOK3表达的慢病毒序列转染小胶质细胞,实时荧光定量PCR分析检测小胶质细胞内炎症及致痛因子的表达水平。研究表明,DOK3敲减组较对照组小胶质细胞内TNF-α,IL-1β,IL-6,P38,iNOS和CD68等炎症介质的水平明显下调;相反,小胶质细胞抗炎标记物Argl和CD206的水平则明显升高。3.DOK3参与GPR84激活诱导的炎症反应浓度为1μM的GPR84激动剂（6-OAU）孵育小胶质细胞,时间依赖性地增加DOK3 mRNA的表达水平,同时6-OAU以不同浓度孵育小胶质细胞60分钟,DOK3的表达水平呈浓度依赖性地增加。6-OAU孵育小胶质细胞,p-p38和Iba-1的蛋白水平随DOK3蛋白水平的增加而增加,这与炎症因子IL-1β,TNF-α及IL-6的水平增加相对应。6-OAU孵育小胶质细胞诱导GPR84的激活,DOK3敲减组较对照组合成炎症介质TNF-α IL-1β和IL-6的能力显着减弱,TNF-α（对照组,2.3倍;DOK3敲减组,1.25倍）;IL-1β（对照组,1.45倍;DOK3敲减组,1.4倍）;IL-6（对照组,1.65倍;DOK3敲减组,1.2倍）;而且,6-OAU增加了 DOK3 mRNA的水平,但两组GPR84蛋白自身表达无明显变化。4.用LPS或GPR84激动剂孵育小胶质细胞可诱导DOK3和GPR84相互结合LPS刺激小胶质细胞,使DOK3由细胞质转移到细胞膜上发挥作用。LPS刺激使小胶质细胞活力降低,并迅速升高TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA水平,降低 Arg1 的表达。用LPS刺激小胶质细胞0,4或8小时,LPS处理组较对照组GPR84和DOK3的荧光强度在小胶质细胞膜上显着增强。此外,GPR84和DOK3共定位于小胶质细胞膜,且合并荧光强度在LPS刺激下逐渐增强。此外,用6-OAU孵育小胶质细胞1或2小时,荧光共聚焦分析表明6-OAU处理组较对照组中DOK3和GPR84的合并荧光强度在细胞膜上亦明显增强。用LPS刺激小胶质细胞4小时,用抗DOK3的抗体进行免疫共沉淀,用抗GPR84的抗体进行免疫印迹分析。Western Blot分析表明,无论是生理还是LPS刺激条件下,GPR84都与DOK3存在相互结合。应用GST-DOK3融合蛋白进行GST pull-down实验分析,经LPS刺激后的小胶质细胞裂解液中,GST-DOK3组有明显的GPR84免疫印迹,而纯合GST蛋白对照组则未检测到GPR84免疫印迹的存在。研究结论GPR84激动剂和LPS可有效诱导小胶质细胞的炎症反应,导致DOK3水平的增加,并伴随炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6及小胶质细胞炎症标记物Iba-1的表达上调。在DOK3敲减的情况下,小胶质细胞对炎性刺激的反应显着受损。炎症状态下,DOK3从细胞质转移到细胞膜上,通过与GPR84相互结合形成信号复合体,参与GPR84的信号通路传导,从而介导小胶质细胞的免疫反应。第二部分D0K3通过与GPR84相互作用参与脊髓小胶质细胞介导的神经病理性疼痛研究目的1.明确DOK3在CCI诱导的小鼠神经病理性疼痛中的作用。2.探究DOK3对GPR84激活诱导的小鼠脊髓炎症反应的影响。3.探究普瑞巴林是否通过抑制DOK3表达来缓解神经病理性疼痛及炎症反应的发展。研究方法1.慢性压迫野生型和DOK3-/-小鼠坐骨神经以建立CCI模型。通过测量机械缩爪阈值及热痛阈值,检测小鼠CCI术后0,3,7,14,21天的机械痛阈和热痛阈变化。2.通过实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓中DOK3,TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA的水平变化。3.应用免疫荧光染色检测小鼠脊髓组织中Iba-1,p-p38和GPR84蛋白水平的变化。通过Western Blot免疫印迹分析检测DOK3蛋白水平的变化。4.野生型和DOK3-/-小鼠鞘内注射6-OAU以诱导脊髓中GPR84的激活,分别于0,1,2,4小时测量机械缩爪阈值,并检测鞘注2小时后DOK3,TNF-α,IL-1β和IL-6的水平变化。5.野生型小鼠连续3天鞘内注射DOK3 cDNA质粒以增强脊髓中DOK3 水平的表达,与此同时,持续2周普瑞巴林胃内给药,分别于0,3,7,14天测量机械缩爪阈值及炎症因子变化。研究结果1.CCI模型诱导DOK3-/-小鼠产生的神经病理性疼痛及炎症反应较野生型小鼠明显减轻与假手术组相比,CCI术后3-21天,野生型小鼠机械痛阈值显着下降,这表明CCI模型的成功建立。虽然DOK3-/-小鼠表现出与野生型小鼠相同的正常机械疼痛阈值及热痛阈值,但CCI术后,与野生型小鼠相比,DOK3-/-小鼠的机械触摸痛及热痛觉敏感明显减轻。CCI术后野生型小鼠DOK3 mRNA的水平明显增加,DOK3-/-小鼠无DOK3 mRNA的表达。野生型和DOK3-/-小鼠较各自假手术组小鼠脊髓中TNF-α mRNA水平分别增加2.2和1.47倍,IL-1β mRNA水平分别增加1.81和1.37倍,IL-6 mRNA水平分别增加1.65和1.64倍。除IL-6,两基因型间差异均有统计学意义。此外,在DOK3-/-小鼠中,CCI诱导的GPR84和CD11B mRNA水平的上调被显着抑制,而Arg1水平则无明显变化。免疫荧光分析显示,CCI手术后,野生型和DOK3-/-小鼠脊髓中Iba-1、p-p38和GPR84的水平明显升高,但在DOK3-/-小鼠中,CCI术后,Iba-1、p-p38和GPR84水平的升高明显受到抑制。2.GPR84激活诱导的DOK3-/-小鼠的机械痛阈较野生型小鼠明显减轻,炎症反应能力明显受损鞘内注射6-OAU后,野生型与DOK3-/-小鼠机械痛阈值皆明显下降,然而,鞘注后2小时和4小时,两基因型间有明显差异。鞘内注射6-OAU 2小时后,DOK3 mRNA水平显着升高,小鼠脊髓的免疫印迹检测分析进一步证实了这一结果。此外,鞘内注射6-OAU后,野生型与DOK3-/-小鼠脊髓中IL-1β mRNA水平较各自对照组分别升高2.8倍和1.65倍;TNF-α mRNA水平分别升高4.0倍和1.79倍;IL-6 mRNA水平分别升高1.9倍和1.4倍。免疫荧光分析表明,GPR84激活后,野生型与DOK3-/-小鼠中CD11B水平升高,然而,在DOK3-/-小鼠中,GPR84激活前后,CD11B水平增加较野生型小鼠明显减弱,这与其mRNA水平变化相一致。而且,免疫荧光分析表明DOK3主要表达于小鼠脊髓小胶质细胞中,并且DOK3与GPR84在脊髓小胶质细胞中共定位存在。3.应用普瑞巴林可减轻DOK3表达增强诱导的神经病理性疼痛和炎症反应野生型小鼠鞘内注射DOK3 cDNA质粒,以上调DOK3水平的表达。在第3-7天机械痛阈明显下降,于第14天恢复至基础水平。与对照组小鼠相比,普瑞巴林能有效缓解DOK3高表达诱导的痛觉过敏,在第7天时有统计学意义。免疫组织化学和PCR分析显示DOK3在脊髓中表达明显增加,这表明了 DOK3 cDNA质粒的有效性。我们还发现,DOK3高表达可激活脊髓中小胶质细胞,小胶质细胞标记物Iba-1明显上调,但未观察到星形胶质细胞的激活,星形细胞标记物GFAP无明显变化。与升高的DOK3水平相一致,TNF-α（2.72倍）、IL-1β（3.46倍）和IL-6（7.69倍）的水平明显高于对照组小鼠,CD11B亦有同样的变化。与对照组相比,应用普瑞巴林显着降低了 DOK3 mRNA的表达,并伴随IL-1β降低了 41%,TNF-α降低了 33%,IL-6降低了 35%。进一步的实验表明,普瑞巴林能有效抑制脂多糖诱导小胶质细胞中DOK3水平的升高,进一步证实了在小胶质细胞中,普瑞巴林对DOK3表达的影响。然而,普瑞巴林对BV2小胶质细胞中DOK3的基础水平无明显作用。研究结论CCI诱导DOK3-/-小鼠产生的神经病理性疼痛及炎症反应较对照组小鼠明显减轻,GPR84激活诱导的DOK3-/-小鼠的机械触摸痛和炎症因子释放较对照组明显减弱;应用普瑞巴林通过降低DOK3的表达水平,缓解神经病理性疼痛。DOK3在参与GPR84通路介导的小胶质细胞激活诱导的神经病理性疼痛和炎症反应中发挥积极作用。普瑞巴林有效缓解神经病理性疼痛,其潜在机制可能是通过抑制DOK3的水平或GPR84信号通路实现的。
二、细胞免疫中共刺激分子研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞免疫中共刺激分子研究进展（论文提纲范文）
（1）猪血凝性脑脊髓炎病毒DNA疫苗的构建及其在小鼠体内的免疫原性评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 猪血凝性脑脊髓炎概述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 临床症状 |
| 1.4 病理变化 |
| 1.5 研究进展 |
| 第2章 DNA疫苗研究进展 |
| 2.1 DNA疫苗构建过程 |
| 2.2 DNA疫苗的作用原理 |
| 2.3 DNA疫苗的优缺点 |
| 2.4 DNA疫苗免疫原性的优化 |
| 2.5 DNA疫苗佐剂的选择 |
| 2.6 冠状病毒DNA疫苗研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 猪血凝性脑脊髓炎病毒DNA疫苗的构建及鉴定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 猪血凝性脑脊髓炎病毒DNA疫苗免疫小鼠效果评价 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）碳青霉烯酶耐药菌的围术期感染诱发肺炎的早期预防措施探索和NDM-1靶向治疗开发（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 碳青霉烯类抗生素概述 |
| 1.2 NDM-1 的研究进展 |
| 1.3 将NDM-1 作为靶标的抗耐药治疗研究 |
| 1.4 TH17/IL17 通路在肺部炎症反应中的作用 |
| 第2章 rNDM-1 免疫接种对小鼠获得性免疫激活的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 试剂与材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 rNDM-1 免疫接种减少KPndm攻毒小鼠肺部细菌定植量 |
| 2.3.2 rNDM-1 免疫接种刺激小鼠体内产生特异性抗体 IgG |
| 2.3.3 rNDM-1 免疫接种小鼠可在抗原再刺激时上调 IL-17A 的表达水平 |
| 2.3.4 抑制 IL17A 减弱 rNDM-1 免疫接种对小鼠肺部感染的保护作用 |
| 2.3.5 T细胞介导的免疫反应在r NDM-1免疫接种过程中发挥重要作用 |
| 2.3.6 KPndm感染激活rNDM-1 免疫小鼠体内Th17/IL17 通路 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 单细胞测序研究机体对HIKPndm的免疫应答机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 试剂与材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 HIKPndm可以促进小鼠T细胞活化增殖并诱导继发性免疫反应 |
| 3.3.2 scRNA-seq检测表明Th17/IL17 通路在小鼠对HIKPndm的免疫应答中发挥重要作用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 牛呼吸道疾病病原及其固有免疫应答 |
| 1.1 牛呼吸道病原识别病原的分子基础 |
| 1.2 气道和肺上皮细胞对牛呼吸系统疾病的抵抗能力 |
| 1.3 固有免疫系统的效应细胞 |
| 第二章 牛副流感病毒3 型感染及其逃避宿主免疫的研究进展 |
| 2.1 宿主范围与传播特点 |
| 2.2 流行病学与基因型 |
| 2.3 BPIV3 编码基因与蛋白特征 |
| 2.4 牛副流感的临床症状与病理变化 |
| 2.5 病原分离与鉴定 |
| 2.6 BPIV3 造成的经济损失 |
| 2.7 BPIV3 的治疗与预防 |
| 2.8 副黏病毒拮抗Ⅰ型干扰素的研究概况 |
| 第三章 IL10 的信号转导与其在病毒致病中的作用 |
| 3.1 白细胞介素-10 的来源细胞与基本作用 |
| 3.2 IL10 的受体与信号转导 |
| 3.3 IL10 的相关家族与病毒编码的IL10 |
| 3.4 IL10 在病毒致病中的作用 |
| 3.5 IL10 重要产物SOCS3 在病毒感染中的作用 |
| 3.6 病毒诱导IL10 产生的信号通路 |
| 3.7 阻断IL10 清除病毒感染的新策略 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 犊牛BPIV3 血清抗体调查与BPIV3 A的分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、菌株与质粒 |
| 1.2 血清与病料采集 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 呼吸道症状的犊牛BPIV3 抗体调查 |
| 2.2 鼻棉拭子中的BPIV3 鉴定与分离培养 |
| 2.3 病毒的鉴定与纯化 |
| 3 结果 |
| 3.1 呼吸道症状的犊牛BPIV3 抗体调查 |
| 3.2 BPIV3 分离培养 |
| 3.3 BPIV3 的特性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 BPIV3 感染C57BL/6 小鼠与巨噬细胞的转录组分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要动物、细胞与毒株 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3对C57BL/6 鼠的致病性 |
| 2.2 转录样本的制备 |
| 2.3 转录组测序 |
| 2.4 qPCR验证转录组测序结果 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3对C57BL/6 鼠的致病性 |
| 3.2 BPIV3 感染鼠巨噬细胞后细胞因子的变化 |
| 3.3 BPIV3 感染C57 小鼠后肺组织的转录组分析 |
| 3.4 BPIV3 感染原代巨噬细胞转录组测序与分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的重组表达及特性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、菌株与质粒 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的克隆与生物信息学分析 |
| 2.2 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的原核表达与多抗制备 |
| 2.3 牛IL10、SOCS3 的真核表达 |
| 2.4 牛IL10、IL10R1 腺病毒制备及蛋白表达 |
| 2.5 牛IL10 启动子双荧光素酶载体的构建 |
| 2.6 构建牛IL10、IL10R1、SOCS3 干扰载体 |
| 2.7 牛IL10 的生物学活性及信号通路研究 |
| 2.8 牛SOCS3 对I型干扰素表达的负调控 |
| 3 结果 |
| 3.1 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的克隆 |
| 3.2 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的原核表达与多抗制备 |
| 3.3 牛IL10、SOCS3 的真核表达 |
| 3.4 牛IL10、IL10R1 胞外区的腺病毒感染细胞与表达蛋白鉴定 |
| 3.5 牛IL10 启动子双荧光素酶载体的构建与活性分析 |
| 3.6 牛IL10、IL10R1、SOCS3 干扰载体的构建 |
| 3.7 牛IL10 和IL10R的生物学活性 |
| 3.8 牛IL10 的信号通路 |
| 3.9 牛SOCS3 对I型干扰素表达的负调控 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 IL10 在牛副流感病毒3 型感染中的作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与质粒 |
| 1.2 抗体和抑制剂 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3 感染细胞表达IL10 并发挥其活性 |
| 2.2 IL10/IL10R1对BPIV3 感染与细胞因子表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3 感染细胞诱导IL10 的转录与表达 |
| 3.2 BPIV3 感染对STAT3 表达的影响 |
| 3.3 BPIV3 感染对SOCS3 转录的影响 |
| 3.4 BPIV3 感染对其他细胞因子表达的影响 |
| 3.5 IL10对BPIV3 感染与细胞因子表达的影响 |
| 3.6 IL10 受体阻断对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 IL10 与牛副流感病毒3 型感染的相互调控 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与质粒 |
| 1.2 抗体和抑制剂 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3 感染诱导IL10 产生的信号通路 |
| 2.2 调控IL10 相关通路对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3 诱导IL10 产生所依赖的信号通路 |
| 3.2 调控IL10 相关通路对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）PD-L1、B7-H3及B7-H4在宫颈癌免疫治疗中的研究进展（论文提纲范文）
| 1 PD-L1、B7-H3及B7-H4的生物学特征 |
| 1.1 PD-L1 |
| 1.2 B7-H3 |
| 1.3 B7-H4 |
| 2 PD-L1、B7-H3及B7-H4在宫颈癌中的表达及在免疫治疗中的应用 |
| 2.1 PD-L1与宫颈癌 |
| 2.2 B7-H3与宫颈癌 |
| 2.3 B7-H4与宫颈癌 |
| 3 结语与展望 |
（5）间充质干细胞旁分泌蛋白在软骨修复中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 文献综述 |
| 1.前言 |
| 2.软骨组织的类型及结构 |
| 3.现有的软骨修复策略 |
| 4.MSC在软骨修复组织工程中的应用 |
| 5.MSC分泌体检测的研究进展 |
| 6.不同预处理得到CM中分泌体的差异 |
| 7.MSCs分泌体在软骨修复中的机制 |
| 8.总结 |
| 第一章 骨髓间充质干细胞来源的外泌体、微泡和可溶性蛋白在骨关节炎下的软骨保护作用和治疗效果 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料与仪器 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器耗材 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 SD大鼠骨髓间充质干细胞培养 |
| 3.2 条件培养基收集 |
| 3.3 条件培养基内微泡、外泌体、分泌蛋白的分离、收集 |
| 3.4 MVs及 Exos的表征鉴定 |
| 3.5 SD大鼠软骨细胞提取 |
| 3.6 微泡、外泌体、分泌蛋白处理软骨细胞 |
| 3.7 软骨细胞的免疫荧光检测 |
| 3.8 软骨细胞的Western Blot检测 |
| 3.9 软骨细胞的PCR检测 |
| 3.10 SPs细胞因子检测 |
| 3.11 动物实验 |
| 3.12 数据统计 |
| 4.结果 |
| 4.1 大鼠骨髓间充质干细胞来源CM中 Exos和 MVs的鉴定 |
| 4.2 Exos、MVs和 SPs对软骨细胞形态影响的镜下观察 |
| 4.3 Exos、MVs和 SPs对软骨细胞软骨标志物影响的免疫荧光检测 |
| 4.4 Exos、MVs和 SPs对软骨细胞软骨标志物影响的RT-PCR和 WB检测 |
| 4.5 SPs的细胞因子检测分析 |
| 4.6 Exos、MVs、SPs对大鼠ACLT模型膝关节软骨影响的大体观察 |
| 4.7 Exos、MVs、SPs对大鼠ACLT模型膝关节软骨影响的组织学染色 |
| 4.8 Exos、MVs、SPs对大鼠ACLT模型膝关节软骨影响的免疫组化染色 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第二章 2D及/不同孔径3D支架培养条件下脂肪间充质干细胞来源分泌蛋白的蛋白质组学研究 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料与仪器 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器耗材 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 CM对软骨细胞表型的影响 |
| 3.2 CM中SPs的蛋白组学研究 |
| 3.3 差异兴趣蛋白的功能验证 |
| 4.结果 |
| 4.1 BMSCs和 ADSCs在不同2D/3D条件下培养所得CM对软骨细胞表型的影响 |
| 4.2 CM中SPs的蛋白质组学结果 |
| 4.3 差异表达蛋白CAPNS1、LAL、MAT2A和 RCN2 与软骨细胞表型的相关性 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第三章 RCN2 通过NFAT信号通路抑制软骨基质降解 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料与仪器 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器及耗材 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 原代细胞提取 |
| 3.2 敲低和过表达RCN2 细胞系构建 |
| 3.3 数据统计 |
| 4.结果 |
| 4.1 构建稳定的敲低和过表达RCN2 细胞系 |
| 4.2 RCN2 对软骨基质合成代谢的影响 |
| 4.3 RCN2 对软骨细胞NFAT信号通路的影响 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第四章 全文总结 |
| 1.结论 |
| 2.创新点 |
| 3.展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 攻读博士学位期间发表的学术论文与研究成果奖励 |
（6）来那度胺增强T细胞抗肿瘤活性的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 Abbreviations |
| 1 引言 |
| 1.1 肿瘤免疫循环与免疫治疗 |
| 1.1.1 肿瘤免疫循环是肿瘤免疫治疗的基础 |
| 1.1.2 肿瘤免疫循环失调限制免疫治疗效果 |
| 1.2 CD28调控抗肿瘤免疫反应和PD-1/PD-L1抗体治疗效果 |
| 1.2.1 CD28共刺激信号促进CD8~+T细胞的激活和效应细胞功能 |
| 1.2.2 CD28共刺激受体的缺失削弱抗肿瘤免疫反应 |
| 1.2.3 CD28共刺激受体的缺失导致PD-1/PD-L1抗体治疗失效 |
| 1.3 来那度胺的发现与发展 |
| 1.3.1 来那度胺的发现过程 |
| 1.3.2 来那度胺具有广谱的抗肿瘤潜力 |
| 1.4 来那度胺对T细胞的共刺激作用 |
| 1.4.1 来那度胺直接杀伤MM和MDS细胞的分子机制 |
| 1.4.2 来那度胺的抗血管生成作用 |
| 1.4.3 来那度胺增强NK细胞免疫反应 |
| 1.4.4 来那度胺具有共刺激T细胞的作用 |
| 1.4.5 来那度胺共刺激T细胞具有免疫治疗潜力 |
| 1.5 CRBN的I391V突变使得小鼠细胞响应来那度胺 |
| 1.6 来那度胺通过降解IKZF1和IKZF3共刺激T细胞 |
| 1.6.1 来那度胺通过降解IKZF1和IKZF3上调IL-2表达 |
| 1.6.2 IKZF1和IKZF3调控T细胞激活 |
| 1.7 本课题拟解决的科学问题 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 质粒和感受态细胞 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.1.6 常用的溶液配制 |
| 2.1.7 小鼠基因型鉴定引物以及Q-PCR引物 |
| 2.1.8 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Crbn~(I391V)小鼠的构建 |
| 2.2.2 MC38-OVA和B16F10-OVA细胞的构建 |
| 2.2.3 细胞培养常用技术 |
| 2.2.4 小鼠T细胞分离和激活实验 |
| 2.2.5 小鼠T细胞杀伤实验 |
| 2.2.6 在小鼠CD8~+T细胞中敲除Ikzf1和Ikzf3 |
| 2.2.7 小鼠肿瘤模型构建与给药处理 |
| 2.2.8 通过流式细胞术分析脾脏细胞中以及肿瘤中浸润的淋巴细胞 |
| 2.2.9 蛋白质免疫印记(Western Blot) |
| 2.2.10 蛋白热位移实验 |
| 2.2.11 RNA测序以及数据分析 |
| 2.2.12 实时荧光定量PCR(Q-PCR) |
| 2.2.13 酶联免疫吸附测定法(ELISA) |
| 2.2.14 CRISPR文库筛选 |
| 2.2.15 统计分析方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 来那度胺在体外共刺激Crbn~(I391V)小鼠T细胞 |
| 3.1.1 Crbn~(I391V)小鼠的构建 |
| 3.1.2 来那度胺促进Crbn~(I391V)小鼠T细胞激活与增殖 |
| 3.1.3 来那度胺增强Crbn~(I391V)小鼠CD8~+T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力 |
| 3.2 来那度胺在Crbn~(I391V)小鼠体内增强抗肿瘤免疫反应 |
| 3.2.1 来那度胺在Crbn~(I391V)小鼠体内抑制MC38-OVA肿瘤生长 |
| 3.2.2 来那度胺抑制MC38-OVA肿瘤生长是由CD8~+T细胞介导的 |
| 3.2.3 来那度胺在Crbn~(I391V)小鼠体内促进T细胞激活、增殖和分化 |
| 3.3 来那度胺共刺激CD28~-CD8~+T细胞 |
| 3.3.1 来那度胺在CD8~+T细胞中引起的转录组变化与CD28 共刺激信号类似. |
| 3.3.2 来那度胺共刺激缺少CD28受体的Crbn~(I391V)小鼠T细胞 |
| 3.3.3 来那度胺共刺激结直肠癌病人来源的CD28~-CD8~+T细胞 |
| 3.4 来那度胺在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内增强抗肿瘤免疫反应 |
| 3.4.1 来那度胺在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内抑制MC38-OVA肿瘤生长 |
| 3.4.2 来那度胺部分弥补CD28 缺失造成的T细胞激活、增殖和分化的缺陷 |
| 3.5 来那度胺逆转CD28缺陷导致的PD-1抗体治疗失效 |
| 3.5.1 来那度胺在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内恢复PD-1抗体的疗效 |
| 3.5.2 来那度胺联合PD-1抗体促进结直肠癌病人来源的CD28~-CD8~+T细胞增殖 |
| 3.6 来那度胺通过上调IL-2分泌和调控细胞内在信号共刺激CD8~+T细胞 |
| 3.6.1 免疫调节药物共刺激CD8~+T细胞与其降解IKZF1和IKZF3的效率相关 |
| 3.6.2 敲除Ikzf1或Ikzf3促进小鼠CD8~+T细胞激活 |
| 3.6.3 来那度胺上调Crbn~(I391V)小鼠CD8~+T细胞中的IL-2信号 |
| 3.6.4 来那度胺部分通过上调IL-2 分泌共刺激CD8~+T细胞 |
| 3.7 来那度胺上调CD8~+T细胞中部分Notch靶基因的表达 |
| 3.7.1 来那度胺通过不依赖于IL-2的方式上调部分Notch靶基因的表达 |
| 3.7.2 在Jurkat T细胞中敲除IKZF1或IKZF3上调部分Notch靶基因的表达 |
| 3.8 上调Notch靶基因表达是来那度胺共刺激CD8~+T细胞的关键分子机制之一 |
| 3.9 阻断IL-2和Notch信号抑制来那度胺与PD-1抗体联合治疗效果 |
| 3.9.1 IL-2 抗体联合Notch抑制剂阻断来那度胺与PD-1抗体在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内的联合治疗效果 |
| 3.9.2 IL-2 抗体联合Notch抑制剂减弱来那度胺联合PD-1抗体促进T细胞激活和分化的能力 |
| 3.10 通过CRISPR文库筛选寻找增强MC38-OVA肿瘤对来那度胺敏感性的基因突变 |
| 3.10.1 CRISPR文库筛选的实验流程和筛选过程中的肿瘤生长变化 |
| 3.10.2 对CRISPR文库筛选的NGS数据进行MAGe CK分析 |
| 3.11 利用Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠CD8~+T细胞筛选具有共刺激T细胞潜力的化合物 |
| 4 结论与意义 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 答辩决议书 |
（7）“加味益神启窍方”治疗脓毒症相关脑病的临床及实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 绪论 |
| 1.1 脓毒症相关脑病的概念 |
| 1.2 脓毒症相关脑病的诊断 |
| 1.2.1 临床评估量表 |
| 1.2.2 影像及超声技术 |
| 1.2.3 神经电生理技术 |
| 1.2.4 生物标志物 |
| 1.3 脓毒症相关脑病的主要发病机制 |
| 1.3.1 炎症介质过度激活和细胞凋亡 |
| 1.3.2 氨基酸、神经递质的改变及大脑信号传递异常 |
| 1.3.3 脑灌注异常及脑微循环障碍 |
| 1.3.4 线粒体功能障碍 |
| 1.3.5 血脑屏障损伤 |
| 1.4 胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP) |
| 1.4.1 CAP概述 |
| 1.4.2 CAP在SAE中的作用机制 |
| 1.5 中医对脓毒症相关脑病的理论认知 |
| 1.5.1 脓毒症相关脑病与六经辨证 |
| 1.5.2 脓毒症相关脑病与卫气营血辨证 |
| 1.5.3 脓毒症相关脑病与三焦辨证 |
| 1.6 中西医结合治疗脓毒症相关脑病的进展 |
| 1.6.1 脓毒症的治疗进展 |
| 1.6.2 脓毒症相关脑病的治疗进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 “加味益神启窍方”对脓毒症脑病患者脑功能影响的临床研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 资料与方法 |
| 2.1 研究设计 |
| 2.2 病例选择 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.4 观察指标 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 一般情况 |
| 3.2 全身炎症指标 |
| 3.3 神经损伤生化标志物 |
| 3.4 细胞因子指标 |
| 3.5 胆碱能指标 |
| 3.6 T淋巴细胞亚群水平的比较 |
| 3.7 意识状况评价 |
| 3.8 临床疗效评价 |
| 3.9 预后相关指标 |
| 3.10 安全性相关指标 |
| 4 讨论 |
| 4.1 概述 |
| 4.2 “加味益神启窍方”对SAE患者炎症反应的影响 |
| 4.3 “加味益神启窍方”对SAE患者脑功能的影响 |
| 4.4 “加味益神启窍方”对SAE患者胆碱能系统的影响 |
| 4.5 “加味益神启窍方”对SAE患者T淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.6 “加味益神启窍方”对SAE患者预后的影响 |
| 第三部分 “加味益神启窍方”改善脓毒症脑病大鼠脑功能的机制研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要实验试剂 |
| 2.3 中药 |
| 2.4 主要实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 动物模型制作 |
| 3.2 实验步骤 |
| 3.3 观察指标及检测方法 |
| 3.4 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 “加味益神启窍方”对脓毒症脑损伤的影响 |
| 4.2 “加味益神启窍方”对脑组织细胞凋亡的影响 |
| 4.3 “加味益神启窍方”对IL-6、TNF-α、NSE和S100β的影响 |
| 4.4 “加味益神启窍方”对大鼠脑组织IL-6和TNF-α蛋白的影响 |
| 4.5 “加味益神启窍方”对大鼠脑组织AchE和ChAT蛋白的影响 |
| 5 讨论 |
| 结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 CAM-ICU谵妄评估 |
| 附录二 GSC评分 |
| 附录三 危重病人APACHE Ⅱ评分表 |
| 附录四 SOFA评分 |
| 附录五 中英文缩略语 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 1. 冠状病毒概述 |
| 1.1 冠状病毒结构 |
| 1.2 冠状病毒的感染与复制 |
| 1.3 人类冠状病毒 |
| 2. 冠状病毒动物模型研究进展 |
| 3. MERS-CoV与SARS-CoV-2疫苗研究进展 |
| 3.1 灭活病毒疫苗 |
| 3.2 亚单位疫苗与病毒样颗粒疫苗 |
| 3.3 重组病毒载体疫苗 |
| 3.4 核酸疫苗 |
| 4. 研究背景与目的 |
| 实验材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 生物学材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.2 疫苗制备 |
| 2.3 抗原检测及表达验证 |
| 2.4 动物免疫与分组 |
| 2.5 免疫学检测 |
| 2.6 攻毒保护实验 |
| 2.7 统计学分析 |
| 结果 |
| 第一部分 MERS-CoV重组亚单位疫苗与mRNA疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) MERS-CoV重组RBD抗原亚单位疫苗研究 |
| 1. MERS-CoV RBD重组蛋白设计与制备 |
| 1.1 MERS-CoV RBD重组抗原设计与构建 |
| 1.2 MERS-CoV RBD重组抗原蛋白的制备与鉴定 |
| 2. 重组抗原蛋白RBD-T4f的免疫原性初步研究 |
| 2.1 重组蛋白RBD-T4f诱导高水平的中和抗体 |
| 2.2 重组蛋白RBD-T4f可以诱导特异性细胞免疫应答 |
| 3. 重组抗原蛋白RBD-T4f的黏膜免疫应用研究 |
| 3.1 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导系统性体液免疫应答 |
| 3.2 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导呼吸道高水平中和IgA |
| 3.3 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导肺组织细胞免疫应答 |
| (二) MERS-CoV mRNA疫苗研究 |
| 1. 自扩增mRNA疫苗制备优化与体内表达研究 |
| 1.1 自扩增mRNA分子体外转录制备优化 |
| 1.2 自扩增mRNA疫苗分子可在小鼠体内持续表达目的蛋白 |
| 2. 基于重组三聚体靶抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的设计与构建 |
| 2.1 重组抗原mRNA与自扩增mRNA疫苗设计 |
| 2.2 重组抗原mRNA与自扩增mRNA的表达验证 |
| 3. 重组抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的免疫原性研究 |
| 3.1 重组抗原mRNA疫苗可诱导有限的体液免疫应答 |
| 3.2 重组抗原mRNA疫苗与自扩增mRNA疫苗诱导较强的细胞免疫应答 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 SARS-CoV-2核酸疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 DNA疫苗构建与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 SARS-CoV-2 DNA疫苗可以诱导中和活性抗体 |
| 2.2 SARS-CoV-2 DNA疫苗诱导Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫后可产生攻毒保护效果 |
| (二) SARS-CoV-2 mRNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗物理性状与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 mRNA-LPP疫苗诱导高中和活性且较为持久的体液免疫应答 |
| 2.2 mRNA-LPP疫苗诱导广谱中和活性抗体 |
| 2.3 mRNA-LPP疫苗可以诱导高水平Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗可产生持久的保护性 |
| 4. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗与DNA疫苗免疫效果比较 |
| 5. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗恒河猴攻毒保护效果评价 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）DOK3通过与GPR84相互作用参与小胶质细胞介导的神经病理性疼痛（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 DOK3通过与GPR84相互结合参与小胶质细胞介导的炎症反应 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 溶液配制 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 附图 |
| 第二部分 DOK3通过与GPR84相互作用参与脊髓小胶质细胞介导的神经病理性疼痛 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 溶液配制 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 脊髓小胶质细胞参与神经病理性疼痛的机制研究 |
| 神经病理性疼痛的研究现状 |
| 小胶质细胞的特征与活化的机制 |
| 与小胶质细胞激活相关的信号分子及受体 |
| 神经元与小胶质细胞相互作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| SCI论文Ⅰ |
| SCI论文Ⅱ |
四、细胞免疫中共刺激分子研究进展（论文参考文献）
- [1]猪血凝性脑脊髓炎病毒DNA疫苗的构建及其在小鼠体内的免疫原性评价[D]. 邸雪梅. 吉林大学, 2021(01)
- [2]碳青霉烯酶耐药菌的围术期感染诱发肺炎的早期预防措施探索和NDM-1靶向治疗开发[D]. 王馥婧. 吉林大学, 2021(01)
- [3]IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制[D]. 高明春. 吉林大学, 2021
- [4]PD-L1、B7-H3及B7-H4在宫颈癌免疫治疗中的研究进展[J]. 苏雅婷,吕杰,牛雯娟,魏芳. 国际妇产科学杂志, 2021(04)
- [5]间充质干细胞旁分泌蛋白在软骨修复中的作用及机制研究[D]. 古丽玲. 贵州大学, 2021(11)
- [6]来那度胺增强T细胞抗肿瘤活性的功能与机制研究[D]. 耿陈露. 浙江大学, 2021(01)
- [7]“加味益神启窍方”治疗脓毒症相关脑病的临床及实验研究[D]. 窦莉. 南京中医药大学, 2021(01)
- [8]MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究[D]. 杨韧. 中国疾病预防控制中心, 2021
- [9]血和支气管肺泡灌洗液中共刺激分子sB7-H1在儿童肺炎支原体肺炎发病机制中的相关性研究[D]. 周凌浩. 内蒙古医科大学, 2021
- [10]DOK3通过与GPR84相互作用参与小胶质细胞介导的神经病理性疼痛[D]. 高文双. 山东大学, 2021(10)