一、乙型肝炎病毒(HBV)宫内传播碱基突变的研究（论文文献综述）
王松姣[1]（2021）在《PCR产物直接测序检测HBV逆转录酶区耐药突变方法的建立及临床应用》文中指出慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染影响全世界约2.57亿人,并且是引起乙型肝炎肝硬化、肝细胞癌等肝脏疾病的主要原因。临床上常使用核苷（酸）类似物（NAs）)来抑制病毒复制,但是耐药性病毒株的选择常常会导致治疗失败和疾病的进展。而且,耐药性的发展始于HBV聚合酶基因的突变,随后数周至数月后病毒载量和血清丙氨酸氨基转移酶水平升高。因此,抗HBV耐药性突变的检测对于迅速制定新的治疗方案至关重要。第一部分乙型肝炎病毒逆转录酶区耐药突变检测方法的建立与评价目的本研究探讨建立一种检测HBV逆转录酶区10个经典耐药位点的PCR产物直接测序方法。方法1建立检测HBV逆转录酶区耐药突变的PCR产物直接测序方法根据HBV逆转录酶区常见的突变位点,采用Primer Premier 6.0软件设计了覆盖HBV基因型B和基因型C的逆转录酶区rt169至rt250位点的通用引物。以慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA作为模板进行PCR扩增,然后通过琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序分析PCR产物,以验证目的基因是否被扩增成功。2包含HBV逆转录酶区rt169至rt250位点的标准质粒的构建通过掺入Eco RI和Hind III限制性酶切位点的引物扩增HBV DNA模板,然后分别用限制性内切酶Eco RI和Hind III消化纯化的PCR产物和p UC19克隆载体。在使用T4 DNA连接酶将这两个酶切后的DNA片段的磷酸二酯键连接在一起之后,下一步是将重组质粒DNA转化至大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中。然后进行菌落PCR筛选和质粒DNA测序分析,以确定重组质粒标准模板是否构建成功。3 PCR产物直接测序法的评价将得到的重组菌株扩大培养,并对提取的质粒DNA进行定量和倍比稀释。以各浓度梯度的标准质粒作为DNA模板,重复PCR扩增3次。然后通过1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,以目的条带检出率为100%时的最高和最低模板浓度分别作为该方法的检测上限和下限。通过建立的PCR方法对经Sanger测序验证的rt M204I突变标本连续重复检测10天,分析该耐药位点的突变检出率,以评价该方法的重复性。依据分子克隆方法构建rt M204I突变型重组质粒,将突变型质粒DNA按一定比例混合到野生型质粒中;对混合DNA模板进行PCR扩增,然后应用Mutation Surveyor软件对测序结果进行比对分析,以评价该方法对耐药突变株的检测灵敏度。分别对感染了人巨细胞病毒、人乳头瘤病毒、梅毒螺旋体患者和正常受试者的血清DNA样品以及用作空白对照和阳性对照的蒸馏水和质粒标准品进行PCR扩增和目的条带的检测,以评价该方法的特异性。结果（1）通过优化PCR扩增体系和条件,建立了一个标准化的PCR方案以检测HBV逆转录酶区的耐药突变位点。50μL PCR扩增体系为:蒸馏水33μL,20 mmol/L 10×扩增缓冲液（Mg2+plus）5μL,4种d NTP混合物（每种浓度为2.5 mmol/L）4μL,Ex Taq聚合酶（5 U/μL）1μL,上游引物（10μmol/L）1μL,下游引物（10μmol/L）1μL,模板DNA 5μL（<500 ng）。PCR扩增条件为95℃预变性5 min;94℃变性10 s,55℃退火20 s,72℃延伸1 min;循环40次;最后72℃延伸5 min。（2）通过分子克隆技术成功构建了包含有HBV逆转录酶区rt169至rt250位点的野生型标准质粒。（3）该方法对血清HBV DNA的检测范围为0.36 copies/μL至2.88×1011 copies/μL,联合应用Mutation Surveyor软件可检测出含量低至5%的耐药突变株。同一样本重复10次PCR扩增和测序分析,rt M204I的突变检出率为100%。在空白对照和HBV DNA阴性标本中均未检出目的条带。结论本课题所建立的PCR产物直接测序法能够同时检测HBV逆转录酶区rt169至rt250间的耐药突变位点,具有检测下限低、重复性好、特异性高、简单快捷的特点,联合应用Mutation Surveyor软件可提高对低含量耐药变异株检测的灵敏度。第二部分PCR产物直接测序法检测HBV耐药变异的临床应用目的HBV耐药源于长期使用核苷（酸）类似物（NAs）抗病毒治疗过程中HBV逆转录酶（RT）发生突变。到目前为止,这些突变在治疗过程中如何分布和进化的特征还没有被阐明。因此,本研究旨在通过上述建立的PCR产物直接测序法对未接受过治疗和接受过NAs治疗的CHB患者中HBV耐药变异和基因型进行检测,以分析CHB患者RT区突变是否受不同基因型的影响。方法应用PCR产物直接测序法对450例慢性乙型肝炎患者的HBV逆转录酶区耐药性突变进行分析,并通过系统进化树鉴定相应的HBV基因型。结果408例患者的HBV逆转录酶基因序列扩增成功。系统发育分析显示,HBV基因型B占优势。408例患者的序列分析显示,仅在NAs治疗过的患者中检测到经典的耐药突变位点,且耐药率较高（46.90%,106/226）。HBV基因型B和C患者中仅rt A181T/V突变率存在显着差异,其它经典耐药位点突变率无明显差异。在HBV RT区其它位点的突变率方面,发现了9个基因型相关的氨基酸多态性位点（rt191、rt214、rt221、rt222、rt223、rt224、rt226、rt229和rt238）。其中,大多数位点在未接受治疗的患者中具有较高的突变率（P<0.05）。结论HBV基因型B和C之间存在一定程度的遗传变异,但HBV基因型在抗病毒药物使用过程中驱动耐药性变化的作用有限。
赵甜静,杨志清,李雁笛,扆琳珠,丰淑英,汪波,冯永亮,王素萍[2]（2021）在《C基因型HBV变异与宫内传播的关系》文中研究指明目的分析携带C基因型HBV的母亲病毒基因组变异情况,探讨其与HBV宫内传播的关系。方法选取2011-2013年在太原市第三人民医院产科住院的399对携带HBV的母亲及其新生儿,通过问卷调查和病历查阅获得母亲及其新生儿基本情况。采用荧光定量PCR和电化学发光法分别检测母亲及其新生儿血清HBV DNA及HBV血清学标志物。新生儿出生后24 h内且主/被动免疫前,股静脉血HBsAg和/或HBV DNA阳性者判定为HBV宫内传播。按克隆测序要求,母亲HBV DNA载量须≥106 IU/ml,在54例发生HBV宫内传播者中,以满足克隆测序要求的22对母亲及其新生儿作为宫内传播组;以随机种子方法选择同等数量未发生宫内传播的母亲及其新生儿为对照组,经PCR扩增HBV DNA、基因克隆、测序,对携带C基因型HBV的母亲进行病毒基因组变异分析。结果 44例样本中39例（88.63%,39/44）为C基因型,其余2例为B基因型,3例为B与C混合型。将42例携带C基因型HBV的母亲的406条克隆株进行基因变异分析,其中宫内传播组204条,对照组202条。HBV宫内传播组PreS1、S、C、P区碱基置换突变率均明显低于对照组（χ2值介于8.67～40.73之间,P<0.05）;HBV宫内传播组PreC和X区碱基缺失突变率低于对照组（χ2值分别为17.82和34.78,P<0.001）。X区nt1644～1645和nt1649～1650分别存在31 bp和27 bp的插入突变,且均发生于对照组。结论携带C基因型HBV的母亲病毒基因组PreS1、S、C、P区碱基置换突变与HBV宫内传播有关;PreC区的缺失突变、X区的插入和缺失突变可能降低了宫内传播的发生风险。
王素华[3]（2020）在《HBsAg阳性孕妇绒毛组织中HBV标记物和载脂蛋白H关系探讨》文中指出目的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）宫内感染机制较为复杂,有研究表明,载脂蛋白H（apolipoprotein H,Apoh）参与并介导了HBV感染肝细胞,在病毒复制期与乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen,HBsAg）的结合力更强。本研究通过检测HBsAg阳性孕妇血液和早期流产绒毛组织的乙肝标志物水平,明确HBsAg阳性孕妇早期胎儿的乙肝感染情况,调查HBV宫内感染的风险因素,并探讨Apoh的表达与宫内感染的关系。方法选取2017年1月至2018年5月在深圳市第三人民行早期流产的41例HBsAg阳性孕妇为研究对象,留取孕妇绒毛组织和血液样本。应用荧光探针法检测绒毛组织和血浆中的HBV DNA水平及HBV血清学标记物,通过免疫组化方法检测绒毛组织中神经胶质细胞缺失蛋白1（glial cells missing 1,GCM1）、HBsAg、Apoh的表达,所得数据采用统计软件进行比较分析。结果绒毛组织HBV DNA的阳性率为29.27%（12/41）,显着低于血液中HBV DNA的阳性率（53.66%,22/41）,差异具有统计学意义（X2=5.025,P=0.043）;绒毛组织HBV DNA阳性孕妇血液中的HBsAg、HBe Ag和HBV DNA含量均显着高于绒毛组织HBV DNA阴性组的孕妇,差异均具有统计学意义（P值分别为0.002、0.001、0.000）;绒毛组织中,HBsAg和Apoh阳性率分别为17.07%（7/41）和19.51%（8/41）;Apoh在绒毛组织HBsAg阳性组的表达率显着高于HBsAg阴性组,差异具有统计学意义（X2=14.487,P=0.000）,但Apoh在绒毛组织HBV DNA阳性组的表达率与HBV DNA阴性组差异不显着（X2=0.325,P=0.568）;Apoh在血浆HBV DNA阳性孕妇中的表达率显着高于血浆HBV DNA阴性组,差异具有统计学意义（X2=4.578,P=0.032）,但Apoh在血浆HBe Ag阳性和血浆HBe Ag阴性孕妇中的表达率差异不显着（X2=0.577,P=0.448）。结论HBsAg阳性孕妇早期流产的绒毛组织可检测出HBV DNA、HBsAg和Apoh的表达;Apoh的表达与绒毛组织HBsAg阳性和血浆HBV DNA阳性密切相关;绒毛组织HBV DNA阳性孕妇血液中的HBsAg、HBe Ag和HBV DNA含量显着升高。
刘贺[4]（2020）在《青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究》文中研究表明目的:分析乙型肝炎病毒（HBV）CD重组体的遗传变异情况;探寻藏族人群HBV感染者血清中表面抗原（HBsAg）和抗表面抗原抗体（HBsAb）双阳性发生率及原因;分析HBV/CD重组体的时空动态传播过程和进化遗传学特征（包括基因序列起源、核苷酸替换率和居群动力学等）。方法:利用多阶段随机抽样的方法,在西藏自治区和青海省海南州进行社区藏族人群血清样本采集,西藏七个地市中共收集HBsAg阳性血清样本852例,青海省收集HBsAg 阳性血清样本411例。按照采样地区藏族人群人口分布情况,选取具有代表性的血清样本进行DNA提取,分别对HBV全长和BCP区采用巢式PCR方法进行扩增、测序和拼接,以获得HBV全序列。对获得的全序列进行重组分析,对不同重组型的基线情况、遗传变异、血清型进行比较;对重组体内不同基因型片段进行系统发育分析。以青藏高原藏族人群HBsAg和HBsAb双阳性血清样本做为观察组,并以1:4配比选择年龄、性别、病毒DNA水平和HBeAg状态同质的HBsAg 阳性/HBsAb阴性血清样本作为对照组,对两组间基因序列S区、PreS区氨基酸突变率、缺失和全基因组核苷酸突变位点分布情况进行比较。使用自NCBI中检索、收集的HBV C2亚基因型、D基因型和CD重组体全长序列,合并本研究中获得的185株全长序列,构建数据库。使用BEAST软件包对CD重组体中的D基因型片段和D1-5亚基因型;CD重组体中的C基因型片段和C2亚基因型分别进行系统发生生物地理学分析。同时,对CD1和CD2全长序列单独进行溯祖分析,并使用贝叶斯skyline重建方法推断种群数量的历史变化。结果:共获得185条HBV全长序列,其基因分型主要为CD重组基因型（181/185,97.84%）,包括:132株CD1型,其nt10-799为D基因型,其余部分为C基因型;49株CD2型,其nt10-1499为D基因型,其余部分为C基因型;除CD重组型,还获得了 4株C2亚基因型序列。185株测序样本中,HBeAg阳性组的病毒DNA水平高于HBeAg阴性组（P=0.001）;HBeAg阴性组年龄高于HBeAg阳性组（P=0.006）。CD1和CD2的C基因型区域均与C2亚基因型最为接近;CD重组体的D基因型段（nt10-799）与D4亚基因型最为接近,而CD2型nt800-1499序列在系统发育树中与D1-D3更为接近。CD2型重组体主要分布于与印度接壤的山南地区和日喀则市（P=0）。CD重组体在S区氨基酸aa76、aa120和aa129与D基因型存在差异。HBV/CD重组体的主要血清学型为ayw2型（175/181,96.7%）。与CD1型相比,CD2型存在较多的S207N突变。HBV/CD重组体的T1762/A1764双突变发生率低于C基因型,与D基因型接近。HBV/CD病毒株的 G1896A（11.1%vs 25.6%）和A2189C（11.1%vs 50.0%）突变频率低于 C2基因型,G1613A（8.9%vs 10.3%）突变水平与C2基因型相近。青藏高原1263份HBsAg阳性样本的双阳性率为2.14%（27/1263）。在S蛋白全长、N端,MHR（aa100-169）,“a”决定簇（aa124-147）,茎环结构第一环（aa124-137）,第二环（aa139-147）和C端的氨基酸突变率,双阳性组均显着高于对照组;双阳性组中PreS区缺失显着高于对照组（以上结果中,均为P<0.001）。PreSI和PreS2氨基酸突变率在两组间无显着性差异（P=0.19;P=0.89）。PreC/C区C2002T、A2159G、A2189C、C2198A在两组间的分布均存在显着差异。双阳性组和对照组的核苷酸点突变比较,PreS/S区C3189A和T825C、P区C930A在两组间分布存在显着性差异。其中,PreS区C129T（S155L）仅存在于对照组;PreS区C3189A（D103E）和S区T825C（V224A）突变仅存在于双阳性组。HBVD基因型和CD重组体中的D型区域（nt10-799）可溯祖至271年前（95%HPD 138-477）的亚洲南部,其平均进化速率约为1.26×104（95%HPD 5.92×10-5-1.93×10-4）/位点/年。D4亚基因型是CD1和CD2中最为接近的分支,于1850年左右（95%HPD 1743-1934）进入青藏高原;1911年左右（95%HPD 1845-1971）分化为CD1和CD2内相应片段。CD1型较CD2型出现更早,表明先形成D基因型区段为nt10-799的CD1,后续形成D基因型区段为10-1499的CD2。HBV/CD1和HBV/CD2重组体分别形成三个独立的进化群。HBV/CD1重组体自1980年代开始至2000年,其种群大小保持稳定;HBV/CD2重组体自1997年首次报道以来,其种群大小经过短暂上升之后,随即出现了明显的下降趋势。全球C2亚型片段的传播最先起源于亚洲东部,首先传播到中国西北和亚洲北部,随后东亚分离株又进一步播散到美洲。结论:HBV/CD重组体是高原地区流行的主要基因型。HBeAg阴性组患者体内重组体DNA水平更高,病毒复制速度较快,病情处于进展期。年龄增长是导致HBeAg在感染HBV/CD的藏族人群血清中发生转阴的主要原因。HBV/CD1重组来源为D4和C2亚基因型;HBV/CD2可能经过重组来源为D1-3、D4和C2亚基因型的多次重组。基于各基因型的地理分布,形成CD重组体的主要重组来源可能为中国（C2亚基因型）和印度（D4亚基因型）。与D基因型相比,HBV/CD重组体的主要血清型无明显变化。HBV/CD重组体感染者均在高海拔地区生活,造成这种现象的可能原因是高原居民具有相近的遗传背景特征或长期的高海拔生活导致其具有相同或相似的生活习惯。青藏高原HBV表面抗原阳性人群中HBsAg和HBsAb双阳性的发生率接近大多数不同基因型的既往研究结果。与对照组相比,双阳性组的氨基酸突变率在S区全长及其内的各个区段均显着增加。S区高突并不是血清双阳性病的充分必要条件,并不能完全解释HBsAg/HBsAb共存现象,PreS区的改变可能是导致HBsAg/HBsAb双阳性的因素之一。S区T825C（V224A）、PreS区C3189A（D103E）仅存在于双阳性组中,这些氨基酸变异导致蛋白结构发生变化,可能是双阳性发生的重要条件。HBVD基因型最可能的起源地是南亚地区。D基因型原型株在18世纪中叶逐步从印度传播到中亚进而传播到欧洲、地中海地区和非洲。在此过程中,19世纪中叶先后分化出D1、D3和D2亚基因型。同时19世纪中叶自印度向东北方向传播,逐步形成D4亚基因型并在1910年左右进入青藏高原及周边地区与C2型发生重组,这与英军两次入侵西藏时间相吻合。欧洲主要HBV D亚型的传播可追溯到二十世纪早期,包括第一次世界大战特别是第二次世界大战在内的一段时期。此过程可能与战争中产生的创伤、输血和疫苗注射,以及有组织的大规模人口迁移导致HBV的快速传播和演化有关。C2基因型向美洲等地的播散则与亚洲在二十世纪八九十年代的欧美移民潮有关,随着大量东亚地区亚裔人口向欧美等发达国家移民导致C2亚基因型的世界范围传播。
刘莹[5]（2020）在《云南地区少数民族中HBV的流行和HBV pgRNA检测方法的建立与评价》文中研究表明乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）属嗜肝DNA病毒科,是一种带有包膜的小型环状部分双链（ds）DNA病毒。HBV感染是导致慢性乙型肝炎（CHB）、肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌（HCC）的主要致病因素,对人类的健康造成很大威胁。由于不同基因型和亚型对乙肝患者存在致病性和治疗效果的差异,云南具有独特的地理位置和多民族聚集的地域特征,针对云南少数民族人群开展HBV的分子流行病学研究为乙型肝炎的治疗和控制具有重要意义。此外,近期研究发现HBV Pg RNA是HBV ccc DNA的直接转录产物,能够通过反映HBV ccc DNA的转录活动状态进而反映慢性乙型肝炎病情进展,从而指导临床治疗和判断预后。然而,目前针对HBV pg RNA的检测方法研究较少且该方法还未推广应用到临床。基于此本论文针对云南地区八个少数民族的普通人群进行了HBV流行病学调查并建立了HBV pg RNA的检测方法以及该方法的评价。首先,针对普通人群我们采集了云南地区五个少数民族（佤族、布朗族、哈尼族、纳西族、普米族）共计2696例血浆样本,利用Elisa方法检测发现,HBs Ag总体阳性率为7.6%（204/2696）,其中普米族感染率最高为15.4%（58/376）、哈尼族7.6%（37/487）、佤族7.4%（66/896）、布朗族5.4%（25/464）、纳西族4.9%（23/473）。针对204例HBs Ag阳性样本,我们利用HBV S基因进行基因型和亚型分析,结果显示该人群中HBV亚型分布为B2（48.6%）、C1（34.2%）、B4（13.9%）、C2（0.7%）、C5（0.7%）、和4.9%（10例）未确定基因亚型。为了进一步比较不同少数民族中HBV亚型分布差异,我们还收集了206例包括三个民族（傣族、彝族和汉族）乙肝肝病血液样本,经基因亚型分析显示,该人群中HBV亚型分布为B2（29.6%）、C1（29.1%）、C2（23.3%）、B1（0.5%）、B4（0.5%）以及35个未分型样本。经统计分析发现,哈尼族以B2（75%）为主,普米族以B2（38.6%）和C1（43.9%）亚型为主,纳西族以C1（47.1%）亚型为主,彝族以基因型B2（32.69%）和基因型C1占（38.46%）亚型为主,傣族以基因型C1（67.35%）为主,汉族以基因型B2（30.48%）和C2（36.19%）为主。其次,为了进一步分析上述45例未分型样本的基因特征,我们进行了HBV全基因组序列的扩增,其中我们成功获得了39例HBV全基因序列,经序列分析发现8例属于B/C重组,1例B/I重组。7例属于潜在B新亚型,6例属于C型新亚型,其余16例属于不同亚型。为了进一步命名这些新的HBV亚型,基于HBV全基因组序列我们分别进行了HBV遗传距离分析、同源关系进化树分析、基因重组分析、以及特异性氨基酸突变分析,分析发现这些样本符合HBV基因亚型的命名规则,因此我们将它们命名为B10和C17亚型。最后,我们针对HBV Pg RNA5’和3’端序列的特征,分别建立了两种HBV Pg RNA荧光定量PCR检测方法,经特异性、灵敏性、重复性分析发现针对HBV5’端序列建立的Pg RNA的检测方法特异性更好、灵敏度更高。此外,我们选择了40例临床HBV样本就我们建立的HBV Pg RNA检测方法进行评价,结果显示,慢乙肝样本中HBV Pg RNA含量明显高于乙肝肝癌样本,该结果与临床表现相符与相关文献报道一致,该结果表明我们建立的HBV Pg RNA的方法具有潜在的临床应用价值。综上所述,本研究阐明了HBV在云南地区八个民族中基因型和亚型的分布情况并比较了不同民族之间基因型的差异,揭示了云南地区不同民族HBV基因型的复杂性和多样性。同时我们还建立和评价了两种HBV pg RNA荧光定量的检测方法,为今后HBV的研究提供了重要的理论依据,同时也为临床样本的诊断提供了一种更加方便、灵敏的检测方法。
马宁[6]（2020）在《候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究》文中认为第一部分候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析目的:本部分的研究目的:1.应用3种遗传模型分析干扰素及其受体系列基因（IFNA1、IFNA2、IFNA5、IFNL4、IFNLR1、IFNAR2）、氧化应激系列基因（CYBA、NCF4、NOX4、SOD2、GCLM）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）及lnc-RP11-150O12.3外显子区的rs2275959位点和HBV慢性肝病发生发展的关联。2.分析同一染色体上物理位置接近的SNPs构成的单倍体型和HBV慢性肝病发生发展的关联。3.应用3种统计方法分析各个系列SNPs的交互作用和HBV慢性肝病发生发展的关联。方法:1. 候选基因SNPs的选择。Pubmed数据库检索功能SNPs或者区域,这些SNPs或者区域可能会影响和HBV感染有关基因的m RNA的转录、蛋白质的表达,继而影响HBV慢性肝病的发生发展。然后通过UCSC数据库和Ensemble数据库检索其具体物理位置和在中国北方汉族人群中的罕见等位基因频率（MAF）,Hapmap数据库查询单倍体型信息,SNPinfo Web Server预测SNPs的功能。共21个SNPs（IFNA1-rs1332190、rs1831583,IFNA2-rs649053,IFNA5-rs7031048、rs3758236,IFNAR2-rs1051393、rs12233338,IFNLR1-rs10903035、rs11249006、rs7525481、rs4649203,IFNL4-rs12971396、rs8113007、rs7248668,CYBA-rs4673,NCF4-rs1883112,NOX4-rs1836882、rs3017887,SOD2-rs4880,GCLM-rs41303970,RP11-150O12.3-rs2275959）纳入本研究。2.样本收集。从石家庄市第五医院以及河北医科大学第一、二、四附属医院中选择符合纳入标准的研究对象3128例,包括:阴性对照者（Negative Control,Ne C）840例,HBV自然清除者（Natural Clearance,NC）496例、慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）691例、HBV相关肝硬化（Liver Cirrhosis,LC）680例、HBV相关性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者421例,其中CHB组、LC组和HCC组统称为HBV相关肝病组（HBV-induced liver diseases,HLD）。抽取研究对象空腹静脉抗凝血备用,同时以问卷形式收集研究对象的基线资料、检查结果、患病情况。3.基因分型。从抗凝全血中提取DNA,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）检测方法对21个候选基因的SNPs进行分型检测。4.统计学分析。多组计量资料的比较采用单因素方差分析（正态分布且方差齐）或K-W H秩和检验（正态分布方差不齐/非正态分布）,两个或多个样本率或构成比的比较采用χ2检验。用非条件Logistic回归分析SNPs和疾病发生发展的关联性,并计算比值比（odds ratio,OR）和95%置信区间（95%confidence intervals,95%CI）。分析研究对象的基线资料与HBV慢性肝病发生发展的关系。应用共显性、显性和隐性模型分析21个SNPs与HBV慢性肝病易感性（HBV相关肝病组vs.阴性对照组）、HBV自然清除（HBV相关肝病组vs.HBV自然清除组）、HCC易感性（HCC组vs.LC+CHB组,HCC组vs.阴性对照组）的关联。以P≤0.05为差别有统计学意义,检验水准均为双侧,采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理和分析。Haplo View软件进行单倍体型和疾病的关联分析。SNPStats软件对阴性对照个体21个位点的基因型频率行Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验。广义多因子降维法（Generalized Multifactor Dimensionality Reduction,GMDR）、Logistic回归分析（相乘模型）、叉生分析法（相加模型）进行基因-基因交互作用分析。结果:1 21个SNPs的等位基因频率符合H-W遗传平衡定律（P>0.05）,证明研究对象具有群体代表性。2 干扰素及其受体系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系2.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示共显性模型下有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393GT/TT vs.GG（P=0.001,OR=1.430;P=0.006,OR=1.471）、IFNLR1-rs4649203GG vs.AA（P=0.002,OR=1.676）、IFNLR1-rs7525481TT vs.CC（P=0.002,OR=5.907）,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006AG/GG vs.AA（P=0.000,OR=0.228;P=0.00234,OR=0.130）、IFNAR2-rs122333338CC vs.TT（P=0.003,OR=0.115）。显性模型中,有4个位点进入方程,其中危险因素有3个:rs1051393（GT+TT）、rs4649203（AG+GG）、rs7525481（CT+TT）,其OR值分别为1.372、1.222、3.975;保护性因素有1个:rs11249006（AG+GG）,OR=0.239。隐性模型中有2个位点进入方程:rs4649203GG和AA+AG比较属于危险因素:OR=1.478;rs122333338CC和TT+TC比较属于保护性因素:OR=0.185。以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组,IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单体域,单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素（P=0.0038,OR=1.208）,CAG是疾病的保护性因素(P=3.428×10-32,OR=0.116)。GMDR结果提示rs7525481、rs11249006、rs10903035构成的3因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照3因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.186（1.672,2.858）倍。相乘交互作用结果提示rs7525481＿T和rs11249006＿A的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=2.258、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.240,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.240倍。和rs649053＿G的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=1.513、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.364,二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.364倍。rs7525481＿T和rs10903035＿G存在负相加交互作用,归因于两个位点的交互作用导致疾病发生的超额相对危险度是-2.67[RERI=-2.670（-4.670,-0.670）],两因素同时存在时（CT+TT、AG+GG）发病的危险性是它们各自单独存在时危险性之和的0.389倍[S=0.389（0.267,0.568）]。2.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:显性模型中IFNLR1-rs4649203AG+GG和野生型纯合体AA相比,属于危险因素（P=0.008,OR=1.344）,携带AG及GG基因型的群体不易清除HBV。未发现与HBV清除能力相关的单倍体型。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV持续感染的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.658,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.658倍。10对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。2.3 与HBV相关性肝细胞癌（HBV-HCC）进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有2个位点进入方程:携带rs1051393TT的个体比携带GG基因型的个体更容易由HBV慢性肝病发展为HCC（P=0.021,OR=1.497）;rs7248668GA和GG相比,属于危险基因型（P=0.002,OR=1.876）。显性模型中,仅1个位点进入方程:rs7248668GA+AA和GG相比属于危险因素,有更大的可能发展为HCC（P=0.006,OR=1.720）。隐性模型中有2个位点进入方程:rs1051393TT和GG+TG比较属于危险因素:（P=0.006,OR=1.512）;rs649053GG和AA+AG比较属于危险因素:（P=0.019,OR=1.421）。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668＿A构成单体域,单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素（P=0.0362,OR=1.440）,CAG是保护性因素（P=0.0423,OR=0.721）。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV-HCC发生的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=2.325,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了1.325倍。rs4649203＿A和rs7248668＿A的主效应导致HBV-HCC发生的危险度分别为OR=1、OR=1.774,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.995,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了0.995倍。14对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。3 氧化应激系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系3.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,阴性对照组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有3个位点进入程:突变型杂合体rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.01,OR=1.412）;携带rs1883112AG/GG的个体与携带AA基因型的个体相比更不易患病（P=0.011,OR=0.783;P=0.007,OR=0.672）;突变型纯合体rs41303970AA和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.027,OR=1.951）。显性模型中,有3个位点进入方程,其中保护性因素有2个:rs1883112（AG+GG）、rs1836882（TC+CC）,其OR值分别为0.755、0.831;危险因素有1个:rs4673（AG+AA）,其OR值为1.358。隐性模型中有3个位点进入方程:rs1883112GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.755;rs4880GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.507;携带rs41303970AA的个体比携带AG+GG的个体容易患病:OR=1.991。未发现与HBV慢性肝病易感性相关的单倍体型。GMDR结果提示rs1883112、rs1836882、rs4880、rs3017887构成的4因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照4因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.029（1.479,2.782）倍。rs1836882＿A和rs1883112＿T在导致HBV慢性肝病发生中存在正相乘交互作用趋势（P=0.061,OR=1.200）。15对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作3.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:共显性模型中突变型杂合体CYBA-rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.045,OR=1.398）。该系列另5个位点均和HBV自发清除能力无关。3.3 与HBV-HCC进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,结果未发现与HBV-HCC有关的SNPs位点。4 RP11-150O12.3-rs2275959T与HBV慢性肝病发生发展的关系以CHB与LC为对照组,HCC为病例组,分析rs2275959T与HBV-HCC之间的相关性,结果表明共显性模型下CT、TT与CC相比均为HCC易感性的危险因素（P=0.016,OR=1.427;P=0.006,OR=1.561）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.005,OR=1.477）。以阴性对照组为对照组,HCC为病例组,共显性模型下该位点的TT与CC相比为HCC易感性的危险因素（P=0.003,OR=1.748）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.016,OR=1.463）;隐性模型下TT和CC+CT相比是危险因素（P=0.014,OR=1.459）。结论:1.干扰素及其受体系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393T、IFNLR1-rs4649203G、IFNLR1-rs7525481T,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006G、IFNAR2-rs122333338C。rs4649203G同时和HBV自然清除有关。IFNAR2-rs1051393T、IFNL4-rs7248668A、IFNA2-rs649053G是HBV-HCC的危险因素。2.IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668A构成的单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素。3.干扰素及其受体基因的SNPs存在交互作用,可能对HBV慢性肝病的发生发展起重要作用。4. 氧化应激系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有2个:CYBA-rs4673A、GCLM-rs41303970A,保护性SNPs有3个:NCF4-rs1883112G、NOX4-rs1836882C、SOD2-rs4880G。rs4673A同时和HBV自然清除有关。5. Rs2275959T与HBV-HCC的发生有关。第二部分lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与mi R-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响目的:探索RP11-150O12.3多态性位点rs2275959T对HCC发生发展作用的分子机制。方法:1.生信分析。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构;Lnc RNASNP2数据库检索通过rs2275959位点和RP11-150O12.3结合的mi RNA及RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织的表达情况;UCSC数据库下载RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织中的表达量数据。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测4株肝癌细胞株及LO2肝细胞中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量,细胞爬片荧光探针原位杂交（Fish）实验在4株细胞株中对RP11-150O12.3进行定位;q RT-PCR检测RP11-150O12.3和mi R-6739-3p在30对肝癌及其癌旁组织中的表达量;数量性状分析肝癌组织中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量是否会因为rs2275959基因型的不同而改变,相关性分析不同rs2275959基因型个体肿瘤组织中RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的表达量是否具有相关性;荧光素酶报告基因检测技术验证RP11-150O12.3及mi R-6739-3p的海绵吸附作用;最后利用q RT-PCR方法检测RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的结合是否影响RP11-150O12.3的表达量。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。利用慢病毒包装及感染技术构建RP11-150O12.3稳定过表达及敲减的QGY7703肝癌细胞系;在体外利用MTT及克隆形成实验,在体内利用裸鼠皮下成瘤实验检测RP11-150O12.3对肝癌细胞QGY7703增殖能力的影响;利用Transwell小室法检测过表达及敲减RP11-150O12.3后QGY7703细胞迁移和侵袭能力的变化;最后利用流式细胞术分析RP11-150O12.3是否影响细胞周期与细胞凋亡。结果:1.生信分析结果。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构显示,rs2275959野生型碱基C附近的序列（ACAGAACAAA）较易和其它核酸互补结合,而突变碱基U位于茎-环交界处,其下游序列（AAAUGCAUG）存在6对A-U对及3对C-G对会形成稳定的氢键,增加分子间作用力,使分子更稳定。Lnc RNASNP2数据库显示当rs2275959为野生型C时RP11-150O12.3和mi R-6739-3p有海绵吸附作用,当rs2275959突变为U时,该吸附作用会消失。Lnc RNASNP2数据库显示RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于癌旁组织,从UCSC数据库下载的原始数据支持这一结论。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测发现RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞系中的表达量显着高于LO2正常肝细胞(P=1.7×10-4,P=2.6×10-5,P=0.002)。Fish实验检测RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep3B 3株肝癌细胞及LO2正常肝细胞中的表达,均主要定位于细胞浆中。mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均显着低于LO2正常肝细胞（P=0.000）。在30对新鲜肝癌组织及其癌旁组织中检测RP11-150O12.3的表达量,结果表明其在肝癌组织中的表达量显着高于癌旁组织(Z=-3.898,P=9.7×10-5)。Rs2275959基因型不同,肝癌组织中RP11-150O12.3的表达量亦不同,从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=1.765）到携带CT基因型的个体（Median=4.496）再到携带TT基因型的个体（Median=5.836）其表达量有逐渐升高的趋势(PCC-CT=0.348,PCC-TT=0.040)。而mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于癌旁组织（Z=-3.363,P=0.001）。从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=2.848）到携带CT基因型的个体（Median=1.459）再到携带TT基因型的个体（Median=1.106）其表达量有逐渐降低的趋势(PCC-CT=0.203,PCC-TT=0.045)。携带rs2275959CC及CT基因型个体的癌组织中两种RNA的表达量呈负相关关系(rs=-0.734,P=3.5×10-4),携带TT基因型个体的癌组织中二者表达量没有相关性（rs=0.009,P=0.979）。双萤光素酶报告基因技术结果提示rs2275959-C能介导RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR实验结果进一步说明这种吸附作用能够导致RP11-150O12.3表达量下降。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。本研究成功构建了过表达及敲减RP11-150O12.3的稳定细胞系。MTT实验结果显示:过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞与空载质粒对照细胞（Control）相比,培养48h后增殖能力增强（P=0.04）;将QGY7703细胞的RP11-150O12.3敲减后,与无关序列对照组（sh Control）相比,48h后细胞增殖能力下降（P=0.042）。过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的相对克隆形成率显着高于Control组（P=0.005）,而将RP11-150O12.3敲减后,QGY7703细胞的相对克隆形成能力明显下降(P=4.26×10-4)。裸鼠成瘤实验结果显示,皮下注射过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着高于皮下注射Control组细胞的小鼠(Pweight=0.004),皮下注射敲减RP11-150O12.3的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着低于皮下注射sh Control组细胞的小鼠(Pweight=0.011)。Transwell小室法检测RP11-150O12.3过表达或敲减后QGY7703细胞迁移与侵袭能力的变化,结果显示,RP11-150O12.3T过表达组细胞的迁移和侵袭能力均显着高于Control组（P=0.028,P=0.010）,RP11-150O12.3敲减组细胞的迁移和侵袭能力均显着低于sh Control组（P=0.002,P=0.024）。流式细胞术检测细胞周期结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703细胞过表达RP11-150O12.3T后G0/G1期的比例明显下降（P=0.001）,S期的比例明显升高(P=1.9×10-4),说明RP11-150O12.3T能促进细胞周期从G0/G1期向S期转变。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3表达量下调的QGY7703细胞G0/G1期的比例升高(P=1.13×10-4),S期比例明显下降（P=0.049）,使细胞阻滞于G0/G1期。细胞凋亡实验结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703过表达RP11-150O12.3T后细胞凋亡比例明显降低（P=0.0011）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异更加明显(P=1.12×10-4)。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3下调的QGY7703细胞凋亡比例明显增高（P=0.003）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异也有所提高（P=0.001）。结论:1.RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞中的表达量高于LO2正常肝细胞,其表达位置在细胞浆。而mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均低于LO2正常肝细胞。2.RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于其对应的癌旁组织,从携带rs2275959CC基因型的个体到携带CT基因型的个体再到携带TT基因型的个体肝癌组织中RP11-150O12.3表达量有逐渐升高的趋势,mi R-6739-3p表达量有逐渐降低的趋势,并且mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于其癌旁组织。携带CC及CT基因型个体的癌组织中RP11-150O12.3和mi R-6739-3p表达量呈负相关关系。3.RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的相互作用依赖于rs2275959C碱基且导致RP11-150O12.3的表达量下调。4.RP11-150O12.3作为一个促癌基因,在体外能促进HCC细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞周期的进展,并抑制细胞凋亡;在体内能促使裸鼠成瘤。
范晶华[7]（2019）在《慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究》文中研究指明[目 的]前期研究聚焦早期准种变化对短期（一般3年或以下）抗病毒治疗疗效的影响。本研究前瞻性观察慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者（慢性乙型肝炎及乙肝病毒相关肝硬化患者）核苷（酸）类似物（NAs）长期（近10年）抗病毒治疗过程中的疗效及对临床结局的影响,研究抗病毒治疗关键时间节点的乙型肝炎病毒准种异质性及其进化机制,进一步明确抗病毒治疗效果差异的病毒学机制。[方法]本研究的第一部分纳入107例接受核苷（酸）类似物治疗的慢性HBV感染者开展为期111.83月的前瞻性、开放性、观察性的真实世界研究。入组患者随机分为恩替卡韦组（治疗药物为恩替卡韦）和非恩替卡韦组（治疗药物为拉米夫定、阿德福韦酯或替比夫定）。每24～48周进行一次随访,收集患者临床资料,分析长期抗病毒治疗后病毒学、生化及血清学应答情况及对临床结局的影响。本研究第二部分采用第一部分的24例慢乙肝患者进行HBV准种研究。首先,我们将研究对象分为三组（三组间无配对关系）,即未治疗组、治疗1年组和治疗10年组（病毒学突破组）,分别取不同时期的患者血清进行HBV准种研究。对于治疗1年组,我们根据患者治疗1年以后病毒应答的时间情况,分为A组（1年<HBV应答时间<3年）和B组（3年<HBV应答时间<6年）。采用PCR产物克隆测序的方法对逆转录酶（reverse transcriptase,RT）区准种进行分析,比较不同治疗时间点的HBV准种差异,探讨核苷（酸）类似物治疗1年时HBV准种的特征与之后病毒学应答的关系及RT基因的准种进化规律。本研究第三部分对一例乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B surface Antigen,HBsAg）和抗-HBs共存的HBV准种基因组进行克隆、测序、生物信息学比较及荟萃分析。[结 果]第一部分:经过长期NAs抗病毒治疗,HBVDNA的对数值（log10 IU/mL）治疗后降为 1.28（1.28,1.40）IU/mL 低于治疗前的 6.92（5.06,7.89）IU/mL（P<0.05）,恩替卡韦组较非恩替卡韦治疗组下降幅度更大（P<0.05）。随访结束时,病毒学突破人数为28人,突破率为26.17%,恩替卡韦组与非恩替卡韦组无差异（P>0.05）。治疗1年时HBV DNA不可测为病毒学突破的保护因素（HR=0.235（0.103,0.538）,P<0.05）。67.9%患者 HBsAg 定量低于 1500 IU/ml,6.54%（7例）患者HBsAg消失并于治疗24～48周时获得早期病毒学应答。乙肝病毒e抗原（Hepatitis B e Antigen,HBeAg）消失率为 71.21%,血清转换率为 40.91%。患者HBeAg消失与基线HBV DNA、ALT水平、HBV DNA转阴时间无关（P>0.05）。6 例患者（5.61%,6/107）发生恶性肿瘤,其中 3 例（2.80%,3/107）发生肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）、均为恩替卡韦治疗患者。APRI指数治疗后为 0.44（0.31,0.56）,低于治疗前 1.05（0.53,1.75）（P<0.01）,随访结束后患者肝硬度值为4.9（4.0,6.2）KPa。第二部分:我们采用24例慢乙肝患者451条HBV RT克隆序列用于下游分析,研究不同抗病毒效果患者的病毒学机制,结果如下:1.A组40%（2例）患者检测到耐药突变,B组75%（6例）患者检测到耐药突变,治疗10年组50%（3例）患者检测到耐药突变。B组和治疗10年组均有50%的患者积累了插入、缺失或终止密码子突变。2.在RT基因的核苷酸和氨基酸水平,治疗1年组的复杂度均显着高于未治疗组（P<0.05）,而且治疗1年或10年组的平均遗传距离均显着高于未治疗组（P<0.05）。在RT基因的核苷酸水平,A组复杂度（Sn=0.9734）均显着高于 B 组（Sn=0.8875,P=0.0393）和治疗 10 年组（Sn=0.8524,P=0.0141）。A组和B组的平均遗传距离、平均同义替换数目及平均非同义替换数目水平相当,均低于治疗10年组,但无统计学意义（P>0.05）。在RT基因的氨基酸水平,A组复杂度（Sn=0.8874）显着高于治疗10年组（Sn=0.7098,P=0.0473）,但三组间的平均遗传距离无显着差异（P>0.05）。3.与治疗1年组（A组和B组）相比,未治疗组和治疗10年组的系统进化树具有较为简单的拓扑结构。治疗1年组（A和B组）平均枝长（0.0029±0.00029）显着大于未治疗组（0.0012±0.0003,P=0.0137）。A 组平均枝长（0.0028±0.0005）和 B 组的平均枝长（0.003±0.0004）均显着大于治疗10年组（0.002±0.0004）（P<0.001）,但A组和B组的平均枝长差异不显着（P=0.6368）。4.我们对三组患者HBVRT的选择压力（ω=dN/dS）进行分析。结果表明,三组患者HBV均经历了正选择,治疗10年组积累了更多的正选择信号。在基因型B、C及B/C中,三组患者具有相似的ω值分布趋势。在B/C基因型中,A组的选择压力（ω=0.296±0.0332）和B组的选择压力（ω=0.291±0.0469）没有差异,均低于治疗10年组（ω=0.5679±0.1722）。5.治疗1年时RT准种复杂度（核苷酸水平）与相应的HBV DNA载量呈负相关（P=0.0163,R=-0.6493）。RT的准种复杂度（核苷酸和氨基酸水平）与相应的ALT 水平呈负相关（P=0.0437,R=-0.5661;和 P=0.0117,R=-0.673）。平均遗传距离、平均同义替换数和平均非同义替换数与相应的HBV DNA载量、ALT水平无统计学相关性。第三部分:本研究分析1例HBsAg和抗-HBs共存的基因型为Ⅰ型的慢性乙型肝炎患者HBV准种基因组特征,该病毒准种基因组具有高度复杂的准种异质性和高频的HBsAg突变,其中69%的克隆发生PreS缺失和HBsAg氨基酸变异。Meta分析结果表明,PreS缺失与HBsAg和抗-HBs共存具有相关性,总体风险估值为 4.09（95%CI（2.18,7.68））。[结 论]NAs长期抗病毒治疗可以使患者不同程度获益,与HBV准种异质性密切相关。在抗病毒药物压力下,HBVRT准种的异质性与核苷（酸）类似物抗病毒治疗应答早晚有关,该基因的准种的高复杂度可能提示治疗应答佳。在治疗1年时,高复杂度的HBV准种,有利于HBV DNA和ALT水平下降,但低水平的ALT反而不利于HBVDNA清除。抗病毒治疗效果差的患者积累了较多的耐药突变、缺失、或终止密码子突变,提示这些突变不利于病毒学应答,可能与免疫逃逸有关。治疗10年组具有较为简单的进化模式与更多的正选择信号,提示这些变化可能与病毒学突破有关。个案HBV基因组准种分析与Meta分析表明,高频的preS1缺失,与HBsAg与抗-HBs共存相关。
彭松绪[8]（2019）在《乙肝病毒宫内传播遗传易感性和环境影响因素及其交互作用研究》文中研究说明在乙肝病毒（HBV）宫内传播人群调查的基础上,采用候选基因策略来探索乙肝病毒宫内传播的遗传易感基因,并从遗传、环境及其交互作用方面来探讨HBV宫内传播的发生机制,为有效干预或阻断乙肝的母婴传播提供科学依据。第一部分乙肝病毒宫内传播发生率与影响因素研究目的:了解武汉市HBsAg阳性孕产妇HBV宫内传播的流行现状,探索HBV宫内传播发生的影响因素,明确其关键危险因素及危险程度。方法:以2012年5月至2017年8月期间进入乙肝母婴传播队列的HBsAg阳性孕妇及其婴幼儿为研究对象,探索HBV宫内传播的相关影响因素。采用多因素非条件Logistic回归进行数据分析。结果:（1）最终纳入分析的孕妇为1506人,新生儿1532名,武汉市HBsAg阳性孕妇分娩的新生儿中乙肝病毒宫内传播发生率为8.35%（128/1532）。（2）多因素回归分析结果显示,调整其他因素后,母亲孕期HBeAg阳性（OR=4.26,95%CI:2.60-6.98,P<0.001）、孕晚期HBV DNA阳性（OR=1.67,95%CI:1.02-2.74,P=0.041）、剖宫产（OR=0.29,95%CI:0.19-0.44,P<0.001）与乙肝病毒宫内传播的发生风险密切相关。结论:母亲孕期HBeAg阳性和孕晚期HBV DNA阳性是新生儿HBV宫内传播的危险因素,而剖宫产则有可能是新生儿HBV宫内传播的保护因素。第二部分RLR-MAVS和c GAS-STING信号通路基因及其他基因遗传变异与HBV宫内传播关联性研究目的:探讨RLR-MAVS和c GAS-STING信号通路基因及其他基因遗传变异与HBV宫内传播的关系。方法:采用病例对照研究设计,自2013年1月-2017年8月在武汉市妇幼保健院收集HBs Ag阳性孕妇及其新生儿作为研究对象,共纳入1356名HBs Ag阳性孕妇分娩的新生儿,包括乙肝病毒宫内传播新生儿107名,同期收集的未发生宫内传播的新生儿1249名。通过文献查阅选择RLR-MAVS和c GAS-STING信号通路相关基因及IL10、IL12A、IL12B、TLR3、TLR9、TNFSF14作为候选基因,利用Mass ARRAY基因检测系统进行基因分型。采用多因素非条件Logistic回归、累积效应分析、多因子降维法进行统计分析。结果:在RIG-I/MAVS信号通路中,与INTS10 rs28413168 GG基因型携带新生儿相比,此位点携带CC/CG基因型的新生儿HBV宫内传播的发生风险增加了100%（OR=2.00,95%CI:1.26-3.19;P=0.004）。在c GAS-STING通路,新生儿携带MB21D1 rs311678 GG/AG基因型HBV宫内传播风险显着低于携带AA基因型新生儿（OR=0.48,95%CI:0.30-0.78;P=0.003）。与携带IL10 rs1800872 CC基因型的新生儿相比,此位点携带AA基因型的新生儿HBV宫内传播的发生风险显着增加（OR=3.01,95%CI:1.02-9.84;P=0.047）。新生儿TLR3 rs3775291位点多态性与HBV宫内传播密切相关,该位点携带TT基因型的新生儿相较于CT/CC基因型的新生儿,其发生HBV宫内传播的风险显着增加（OR=2.09,95%CI:1.07-4.12;P=0.032）。此外,未发现新生儿其它SNP与HBV宫内传播的发生风险间存在显着的关联。多因素非条件Logistic回归模型中校正产妇分娩年龄、产次、孕期HBe Ag、孕晚期HBV DNA和分娩方式后,发现新生儿携带58个风险等位基因发生HBV宫内传播的风险是携带02风险等位基因的新生儿发生风险的4.34倍（95%CI:1.44-13.09;P=0.009）。结论:新生儿INTS10 rs28413168、MB21D1 rs311678、IL10 rs1800872、TLR3rs3775291位点基因多态性与HBV宫内传播遗传易感性密切相关。新生儿携带危险等位基因越多,发生HBV宫内传播的风险越高。第三部分基因遗传变异与环境因素的交互作用对HBV宫内传播的影响目的:探讨INTS10 rs28413168、MB21D1 rs311678、IL10 rs1800872、TLR3rs3775291位点基因多态性是否与环境因素（孕期HBe Ag、HBV DNA和分娩方式）之间存在交互作用进而影响HBV宫内传播的发生。方法:研究对象同第二部分。采用多因素非条件Logistic回归分析中乘积相互作用和Andersson Tomas等提供的相加交互效应模型来评估INTS10 rs28413168、MB21D1 rs311678、IL10 rs1800872、TLR3 rs3775291与孕期HBe Ag、HBV DNA和分娩方式之间的交互作用。结果:（1）INTS10 rs28413168多态性与HBe Ag之间存在相加交互作用（AP=0.54,95%CI:0.21-0.86;SI=2.57,95%CI:1.06-6.25）;IL10 rs1800872基因多态性与HBe Ag之间存在相加交互作用（AP=0.57,95%CI:0.10-1.04）。（2）MB21D1rs311678基因多态性与HBV DNA之间存在相加交互作用（AP=0.41,95%CI:0.07-0.75）。（3）MB21D1 rs311678多态性与分娩方式之间存在相加交互作用（RERI=4.14,95%CI:0.43-7.84;AP=0.56,95%CI:0.28-0.84;SI=2.84,95%CI:1.14-7.04）;IL10 rs1800872基因多态性与分娩方式之间存在相加交互作用（AP=0.58,95%CI:0.24-0.92）;TLR3 rs3775291位点多态性与分娩方式之间存在相乘交互作用（P=0.020）。结论:基因-环境交互作用研究提示环境因素如产妇孕期HBe Ag和HBV DNA状态、分娩方式可能对新生儿HBV宫内传播的遗传易感性具有叠加和促进作用。
张宝芳[9]（2019）在《贵州地区高风险乙型肝炎孕妇母婴垂直传播阻断的真实世界回顾性研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是一个影响全人类健康的主要公共卫生问题,乙型病毒肝炎是感染乙型肝炎病毒后引起的以肝功能损伤为主的全身性传染病,全球有20亿人血清学显示其曾感染过HBV,其中有3.5亿多人发展成为慢性HBV携带者,部分慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）患者会死于乙型肝炎所致的肝硬化和肝癌,给病人、家庭、社会带来了沉重的经济负担。目前,我国育龄期妇女HBsAg流行率约为6.6%,估算每年仍有100万名新生儿出生后面临感染HBV的高风险。2016年发布的《全球卫生部门病毒性肝炎战略》首次提出到2030年消除病毒性肝炎对公共卫生威胁的全球性目标,而“HBV母婴零传播”是实现该目标的重要一环,因此,中国肝炎防治基金会建立“乙肝母婴零传播工程项目”,贵州医科大学附属医院为全国第6家签订完成该项目单位。本课题将回顾性分析研究贵州高风险乙型肝炎孕妇（HBsAg、HBeAg双阳性,H3V DNA≥106 IU/ml,或第一胎已被感染HBV或孕妇本人就为乙肝母婴传播感染者）,分为孕期药物干预组及门诊非干预组与对照组（非乙型肝炎孕妇）及其出生的新生儿/婴幼儿,研究干预组孕期HBV病毒基因型及免疫功能变化与对抗病毒药物作用影响,其所生新生儿/婴幼儿在乙型肝炎疫苗及乙型肝炎免疫球蛋白联合标准规范免疫接种后,HBV母婴传播感染率及产生抗-HBs滴度。针对母婴传播患者,通过二代测序分析,判断母婴病毒全基因序列同源性及发现有宫内传播优势的特异突变位点。为HBV母婴传播感染发生机制及防控提供临床真实研究数据。所有研究人群均通过贵州医科大学附属医院伦理委员会审核同意通过。研究内容分为三部分报告。目的:1.观察孕期使用抗病毒药物阻断对贵州地区不同基因型高风险乙型肝炎孕妇HBVDNA 及 HBVRNA 的影响。2.对贵州地区高风险乙型肝炎孕妇母婴传播阻断后母婴结局观察。3.探索乙肝病毒宫内感染的无创性产前诊断。方法:第一部分,回顾性收集2016年05月-2018年05月在贵州医科大学附属医院感染科及产科门诊,入选患者诊断符合2015年修订的《慢性乙型肝炎防治指南》[2]的诊断标准,在孕12周前就诊查确诊慢性乙型肝炎CHB患者孕妇,均为HBsAg（Hepatitis B surface antigen,HB sAg）阳性持续超过6个月,并在孕24周前B超检查提示胎儿发育正常,血清丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）、人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）、梅毒螺旋体抗体（Treponema pallidum antibody,RPR）标志物阴性,无先兆流产史。排除标准:①丈夫有HBV感染;②孕前半年内有使用干扰素治疗CHB患者;③孕期伴有其他类型的肝病,糖尿病,甲状腺疾病,高血压、慢性肾病,肿瘤,精神类等慢性疾病史;④肝硬化失代偿期患者;⑤产前B超提示胎儿发育异常或畸形。根据孕24周-28周是否抗病毒阻断分为两组:干预组（T）91例,未干预组（NT）259例,同期我院产科门诊体检健康非乙型肝炎孕妇（Health control,HC,定义为HBsAg阴性,肝功正常,既往无肝炎病史）作为对照组（C）100例。按照乙肝孕妇抗病毒指南,干预组均以阻断为目的,自愿在24-28周开始接受服用替诺福韦或者替比夫定抗病毒治疗直至分娩。开展人口统计学和临床特征调查并分别于孕12-24周,孕28-32周,孕36-40周采集血液样本,检测基因型,HBsAg、HBeAg、HBVDNA、HBVRNA,肝功能[丙氨酸转氨酶（ALT）天门冬氨酸氨基转移酶（AST）总胆红素（TBIL）总胆汁酸（TBA）胆碱酯酶（CHE）碱性磷酸酶（ALP）及对照组,未干预组,干预组在用药前（孕12-24W）及干预组分娩前（36-40周）检测T淋巴细胞（CD3+,CD4+CD8+）,NK 细胞（CD16+CD56）及 B 淋巴细胞（CD19）的变化。干预组均以阻断为目的,在孕24-28周开始口服富马酸替诺福韦二吡呋酯片（TDF）300 mg/d,购自葛兰素史克（天津）有限公司（国药准字H20153090）;或替比夫定（LDT）600 mg/d,购自北京诺华制药有限公司（国药准字H20070028）,抗病毒治疗直至分娩。数据采用连续变量以均数±标准差;分类变量以率进行统计分析。第二部分,研究人群为第一部分孕妇[非干预组（NT）259例,干预组（1）91例,对照组100例（C）)]及其所生婴幼儿（450例）,干预组及未干预组孕妇所生新生儿/婴幼儿均采取国家标准乙型肝炎计划免疫主被动联合接种（出生6 h内肌肉注射乙型肝炎免疫球蛋白100U,及0、1、6个月每次肌肉注射基因工程乙型肝炎疫苗10 μg）,对照组只注射乙型肝炎疫苗（0、1、6个月每次肌肉注射基因工程乙型肝炎疫苗10μg）。观察孕周及孕期不良反应,新生儿Apgar评分,及其幼儿7个月龄时定量检测血清乙型肝炎标志物（hepatitis B virus marker,HBVM）及 HBV DNA。HBV 母婴传播感染定义为乙型肝炎孕妇所生小孩出生后在7月龄后检测HBsAg阳性,或伴有HBV DNA阳性。数据统计:两两比较用LSD方法,组间比较,采用t检验,疗效分析采用协方差分析,组内比较采用符号秩和检验。第三部分,研究人群为第一部分孕妇（干预组91例及非干预组259例）及其所生婴幼儿（350例）,HBV孕妇于孕16-24周采血10ml进行二代测序,预测胎儿是否发生宫内感染（由贵州省产前诊断中心完成）,并已收集临床信息与血液样本。在充分考虑感染组与非感染组之间孕妇年龄和怀孕周数等特征分布平衡的基础上,从中挑选出一个包括128对母婴的样本测试集,其中经产后随访证实其中29例（均为第一部分未干预者）发生宫内感染,未发生宫内感染的母婴99对。通过孕妇血样中病毒DNA及胎儿游离DNA的提取和采取Illumina HiSeq 2000平台的测序分析,判断母婴病毒全基因序列同源性及发现有宫内传播优势的特异突变位点。统计学方法:组间比较,采用t检验,组内比较采用符号秩和检验。采用R软件3.2.3版本提供的“randomForest”工具包构建随机森林模型。结果:第一部分,对干预组91例e抗原阳性或和高载量病毒复制乙肝孕妇进行HBV基因分型:B型57例（57/91,62.63.18%）,C型34例（34/91,37.36%）,未发现其他基因类型。干预组用替诺福韦（TDF）和替比夫定（LDT）在人口统计学和临床特征方面没有差异,包括肝功能检查[TDF 治疗前:ALT21.30（9.01-362.49）,AST 25.19（13.62-345.53）,TBIL8.16（3.79-57.55）,ALP78.44（31.00-232.52）,TBA3.70（0.83-45.23）,治疗结束时:ALT 21.30（8.66-98.10）,AST 24.65（14.91-101.92）,TBIL 8.78（3.16-17.11）),ALP 148.05（53.98-470.61）,TBA 3.07（0.92-74.83）];LDT 组治疗前:ALT22.56（6.65-117.00）)AST23.02（16.37-62.00）,TBIL7.81（5.48-18.27）,ALP67.35（46.05-388.21）,TBA3.24（1.06-42.58）,治疗结束时:ALT 21.40（8.14-62.05）,AST 24.10（11.79-160.64）,TBIL 7.28（3.50-18.40）,ALP 162.40（47.30-423.96）,TBA 3.76（0.69-28.41）]。Log10（HBV DNA）和 Log10（HBV RNA）[TDF 组(治疗前:HBVDNA 4.84±2.01,HBVRNA6.35±1.10;治疗 4 周时:HBVDNA3.99±0.79,HBVRNA 6.05±0.94;治疗结束时:HBVDNA 3.06±0.66,HBVRNA 5.52±0.85;LDT 组（治疗前:HBVDNA5.08±1.99,HBVRNA6.47 ± 0.88;治疗 4 周时:HBVDNA4.45±1.18,HBVRNA6.51±0.82;治疗结束时:HBVDNA3.51±1.20,HBVRNA6.13±0.66）],与治疗前（孕12-24周）相比,替诺福韦与替比夫定在治疗结束时,Log10（HBVDNA）和Log10（HBV RNA）显着降低（P<0.05）。在排除其他变量的影响下,HBV基因型对HBVRNA载量有一定的影响,表现在C基因组的患者HBVRNA在治疗结束时比B基因组的患者少下降了 0.54个单位（logl0）,P值（0.01）<0.05。孕期CD3+及CD19细胞在各组中变化不大,而未干预组及干预组在用药前CD4+T细胞及CD8+T细胞较正常孕妇比较,其表达减低统计学有差异（P<0.05）,干预组用药后较用药前CD4+T细胞及CD8+T细胞表达增加,但CD4+T细胞增加更为明显,表达有统计学差异（F=9.38,P<0.01）,干预组用药后较正常对照组有差异,但无统计学意义,NK细胞（CD16+CD56）在未干预组及干预组用药前较对照组下降,有统计学差异（F=8.72 P=0.014）。第二部分HBV母婴结局观察到未干预组婴幼儿有乙型肝炎感染,表现为HBsAg 阳性（29/259,11.19%）,HBeAg 阳性（24/259,9.26%）及 HBV DNA 阳性（27/259,10.24%）。HBV母婴传播感染率为11.19%（29/259）,进一步分析非干预组婴幼儿HBV感染与母亲HBV DNA载量的关系,当母亲HBV DNA ≥ 106 IU/ml,其母婴传播感染高达38.67%（29/75）,本研究中母婴传播感染组其母亲HBV DNA均大于106 IU/ml,其中,HBeAg阳性15例,HBeAg阴性14例,针对二胎HBV孕妇（第一胎被感染HBV）中,未干预组有1例感染HBV。未干预原因主要由于孕妇就诊时间较晚,就诊时为孕38周,孕妇HBV DNA>106 IU/ml,HBeAg阳性。其余未干预组二胎孕妇病毒量均较低,其婴幼儿均未被感染。干预组其婴幼儿检测HBsAg,HBeAg及HBV DNA均阴性,HBV母婴传播感染率为零,HBV母婴阻断率为100%。而且有不同程度的乙型肝炎保护性抗体出现,其抗体滴度高于非干预组及对照组孕妇所生婴幼儿,差异有统计学意义（F=5.95,P<0.001）,与其孕妇既往感染HBV时间,孕周及分娩方式,新生儿出生Apgar评分,出生体重,喂养方式,性别等无统计学差别,但与孕期抗病毒治疗有明显的统计学差异。第三部分,针对29对发生HBV母婴垂直感染母婴患者,通过二代测序技术,成功从孕妇血标本提取胎儿游离DNA和乙肝病毒DNA及其测序,分析乙肝病毒全基因序列显示,各母子对病毒全基因序列同源性在99.4%至100%,19对母子（占比65.5%）病毒序列完全一致。按不同基因型分别与B2和C2野生型乙肝病毒株序列进行比较,母亲感染的B和C基因型突变株与野生株乙肝病毒均可通过宫内传播,未发现有宫内传播优势的特异突变位点。结论:1.贵州地区乙肝孕妇以B,C基因型为主,以阻断治疗为目的,在不同的基因型孕妇使用替诺福韦（TDF）或替比夫定（LDT）阻断治疗时,均能取得较好的疗效,但在持续抗病毒治疗基础上,B基因型病毒更容易得到控制。孕中晚期使用TDF或LDT治疗除可以控制HBV病毒外,未见明显不良反应,还可调节孕妇机体的T淋巴细胞免疫功能,其机制可能与改善CD4+T细胞亚群重建,继而引起CD8+T细胞增多有关。2.本课题非干预组发生了 HBV母婴传播,发生率为11.19%,母婴传播感染者其母亲分娩前HBV DNA均大于≥ 106 IU/ml,其中,HBeAg阳性15例,HBeAg阴性14例。进一步分析非干预组婴幼儿HBV感染与母亲HBV DNA载量的关系,当母亲HBV DNA≥106IU/ml其母婴传播感染高达38.67%（29/75）,提示高载量HBVDNA复制是发生乙型肝炎母婴传播的独立危险因素。3.二代测序技术用于监测HBV基因及其突变,产前无创性诊断HBV宫内传播,为设计精准的及个体化乙肝抗病毒抗病毒方案提供可靠的依据,可能是乙肝母婴传播的产前诊断重要评估技术。因此,针对乙型肝炎高风险孕妇,需产前HBV动态监测及药物干预与产后标准联合免疫阻断,才能从真正临床上实现乙型肝炎母婴零传播。
戴海梅[10]（2019）在《HBV基因ntA1762T/G1764A及S蛋白I126T联合变异的临床与实验研究》文中认为[目 的]探究BCP区及S区变异和HBsAg、HBsAb双阳的相关性及ntA1762T/G1764A和I126T联合变异对HBV生物学特性的影响。[方 法]本研究第一部分收集共250例慢性乙型肝炎患者的血清样本进行测序,以HBsAg和HBsAb双阳性的123例患者为实验组,仅HBsAg阳性的127例患者作为对照组,比较两组在B基因型和C基因型之间分布的差异、BCP区nt519-853片段和S区nt1655-2014片段的突变情况及联合突变与HBsAg、HBsAb双阳的相关性。第二部分根据第一部分和前期的研究结果,以碱基位点ntA1762T/G1764A双突变和氨基酸位点aaI126T（对应ntT531C突变）突变的联合变异组为实验组,野生型、ntA1762T/G1764A双突变或aaI126T（ntT531C）突变为实验对照组,体外构建含1.2倍HBV基因组的重组质粒,将目的质粒转染进肝癌细胞内表达,检测转染成功后的表达产物水平并分析结果。[结 果]1.在250例HBV感染患者中,单阳组（127例）和双阳组（123例）在年龄、病毒载量HBV-DNA上的差异无统计学意义（t=-0.252,-1.759;P=0.801,0.08）。HBeAg阳性的比例在两组之间的差异也没有统计学意义（χ2=3.029,P=0.082）。但两组在性别上的差异有统计学意义（χ2=6.412,P=0.011）,单阳组的女性多于男性,而双阳组的比例相反。两组之间的ALT、AST检测值的差异也有统计学意义（z=-2.921,-2.890;P=0.003,0.004）。2.单阳组和双阳组在B和C基因型之间的差异无统计学意义（χ2=2.728,P=0.099）。3.在所测的基因片段中,C基因型中在单阳组和双阳组之间的差异具有统计学意义的碱基突变位点为 T531C/A/G、T813G、A1762T 和 G1764A（χ2=7.23,4.81,7.57,9.70;P=0.007,0.028,0.006,0.002）,其中 T531C/A/G 和 T813G 对应氨基酸变异为I126T/N/S和F220C。并且A1762T/G1764A双突变在单阳组及双阳组之间的差异是有统计学意义的（χ2=8.25,P=0.004）。4.在所测的基因片段中,B基因型中在单阳组和双阳组之间的差异具有统计学意义的碱基突变位点为A519G和A1762T（P=0.033,0.03）,A519G对应氨基酸变异为K122R。G1764A和A1762T/G1764A双突变在B基因型的单阳组和双阳组间的差异无统计学意义（χ2=3.62,P=0.057）。5.在本实验测序的C基因型样本中,T531C/A/G、T813C/G、A1762T、G1764A四个位点的突变及A1762T/G1764A双突变的突变率在HBeAg阳性组和HBeAg阴性组之间的差异没有统计学意义（P=0.601,0.718,0.536,0.601,0.359）。6.分析联合变异时,C基因型中,与野生型相比,531位点的突变、1762/1764双突变和联合突变组都有更高的双阳发生率,差异有统计学意义（用FDR校正的P值分别为0.036、0.036、0.036）,而各个变异组之间的双阳率差异不明显。7.设A组为T531C突变组,B组为A1762T/G1764A突变组,C组为野生型,Y组为联合突变组。两次转染实验中,联合突变的Y组在转染24小时的上清和转染48小时后的上清中HBsAg或HBeAg的检测值均比A、B、C组的检测值要高于2倍以上;而A、B、C组三组之间比较差异均不明显。联合突变的Y组细胞内HBsAg的检测值虽然也比A、B、C组的检测值高。而细胞内HBeAg在四个组中的检测值均很低（0.06～0.07 PEIU/mL）。8.两次转染实验中,Y组在转染24小时的上清和细胞内的HBV-DNA检测值比A、B、C组的检测值高,但差异不明显。A、B、C组之间的差异也不明显。Y组在转染24小时的上清的HBV-DNA检测值比A、B、C组的检测值高,在转染48小时的上清中却比B、C组的低,比A组的高。[结 论]1.ALT和AST在单阳组（127例）和双阳组（123例）之间的差异有统计学意义,说明双阳组中的肝脏炎症表现的更为严重。2.在本实验样本中,单阳和双阳的发生概率在B和C基因型患者之间没有明显不同。3.T531C/A/G、T813G、A1762T、G1764A 突变和 A1762T/G1764A 双突变在C基因型的单阳组和双阳组之间的差异具有统计学意义,说明这些突变与HBsAg、HBsAb的双阳性有关。4.双阳的发生率在T531C突变、A1762T/G1764A双突变和联合变异组之间的差异不明显。5.在体外转染细胞试验中,T531C联合A1762T/G1764A突变组比野生型和单一突变组有更高的HBsAg和HBeAg检测值,说明联合变异可使HBV蛋白表达和分泌能力增强。该联合变异使HBV复制能力增强的结果不明显。
二、乙型肝炎病毒(HBV)宫内传播碱基突变的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乙型肝炎病毒(HBV)宫内传播碱基突变的研究（论文提纲范文）
（1）PCR产物直接测序检测HBV逆转录酶区耐药突变方法的建立及临床应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分:乙型肝炎病毒逆转录酶区耐药突变检测方法的建立与评价 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要试剂配制 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PCR检测HBV耐药突变方法的建立 |
| 2.1.1 引物的合成 |
| 2.1.2 HBV DNA阳性患者血清中模板的提取 |
| 2.1.3 PCR扩增HBV RT基因 |
| 2.1.4 PCR产物检测 |
| 2.1.5 PCR产物测序分析和基因型鉴定 |
| 2.2 重组质粒标准模板的构建 |
| 2.2.1 引物合成 |
| 2.2.2 基因片段的PCR扩增 |
| 2.2.3 PCR产物纯化 |
| 2.2.4 PCR产物和质粒载体的限制性内切酶消化 |
| 2.2.5 酶切消化物的连接 |
| 2.2.6 感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 连接产物的转化 |
| 2.2.8 菌落PCR鉴定 |
| 2.2.9 阳性转化子质粒DNA的提取和检测 |
| 2.2.10 重组质粒DNA的测序鉴定 |
| 2.3 PCR产物直接测序检测HBV耐药突变方法的评价 |
| 2.3.1 重组质粒的大量提取及浓度检测 |
| 2.3.2 PCR产物直接测序法的检测限分析 |
| 2.3.3 PCR产物直接测序法对耐药突变株检测的重复性 |
| 2.3.4 PCR产物直接测序法的对耐药突变株检测的灵敏度 |
| 2.3.5 PCR产物直接测序法的特异性分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 PCR检测HBV耐药突变方法的建立 |
| 3.1.1 PCR扩增目的基因 |
| 3.1.2 PCR产物测序分析和基因型鉴定 |
| 3.2 重组质粒标准模板的构建 |
| 3.2.1 PCR扩增目的基因 |
| 3.2.2 目的基因和质粒DNA酶切产物鉴定 |
| 3.2.3 连接产物的转化分析 |
| 3.2.4 菌落PCR鉴定 |
| 3.2.5 阳性转化子质粒DNA的鉴定 |
| 3.2.6 阳性克隆测序分析 |
| 3.3 PCR产物直接测序检测HBV耐药突变方法的评价 |
| 3.3.1 PCR产物直接测序法的检测限分析 |
| 3.3.2 PCR产物直接测序法对耐药突变株检测的重复性 |
| 3.3.3 PCR产物直接测序法对耐药突变株检测的灵敏度 |
| 3.3.4 PCR产物直接测序法的特异性分析 |
| 4 小结 |
| 第二部分:PCR产物直接测序法检测HBV耐药变异的临床应用 |
| 引言 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 仪器与材料 |
| 1.2.1 实验主要试剂 |
| 1.2.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 患者血清免疫标志物和肝功能指标的检测 |
| 1.3.2 HBV DNA定量检测 |
| 1.3.3 HBV DNA的提取 |
| 1.3.4 HBV逆转录酶区基因扩增 |
| 1.3.5 测序分析 |
| 1.3.6 HBV基因型分析 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增目的基因 |
| 2.2 PCR产物测序分析 |
| 2.3 HBV基因型分析 |
| 2.4 临床资料比较 |
| 2.5 HBV逆转录酶区基因耐药突变分析 |
| 2.6 HBV耐药突变模式分析 |
| 2.7 HBV RT区非经典耐药位点突变分析 |
| 3 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录1 综述:慢性HBV感染者逆转录酶基因突变检测的临床意义 |
| 参考文献 |
| 附录2 攻读硕士学位期间的科研论文及学术交流获奖情况 |
| 致谢 |
（3）HBsAg阳性孕妇绒毛组织中HBV标记物和载脂蛋白H关系探讨（论文提纲范文）
| 中英文缩写对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 第2章 资料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.3 研究方法 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 HBV DNA定量检测标准曲线图的建立 |
| 3.2 绒毛组织和血液中HBV DNA的比较分析 |
| 3.3 绒毛组织HBV DNA与血液HBV标志物的关系分析 |
| 3.4 绒毛组织中抗原表达的检测 |
| 3.5 Apoh与孕妇血液HBV标志物的相关性分析 |
| 3.6 Apoh与绒毛组织中HBV标志物的相关性分析 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 国内外文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录二 攻读研究生期间发表的学术论文 |
| 附录三 绒毛中HBsAg阳性表达免疫组化图 |
| 附录四 个人简介 |
| 致谢 |
（4）青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 青藏高原藏族人群HBV基因序列分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.引物及扩增条件 |
| 3.主要试剂、耗材及生产厂家 |
| 4.主要仪器设备及生产厂家 |
| 5.HBV生物信息学分析主要软件 |
| 6.实验方法 |
| 7.HBV荧光定量PCR检测 |
| 8.生物信息学分析方法 |
| 9.统计分析 |
| 10.质量控制 |
| 二、结果 |
| 1.青藏高原藏族人群血清HBV全序列扩增结果 |
| 2.HBV DNA全长序列分型分析 |
| 3.青藏地区HBV/CD重组体不同区段系统发育分析结果 |
| 4.青藏高原藏族人群全长序列基本信息及地理分布 |
| 5.HBV/CD重组体全序列基因变异分析结果 |
| 6.HBV血清型分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 HBV/CD重组型表面抗原抗体双阳性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.DNA序列拼接与分析 |
| 3.HBV荧光定量PCR检测 |
| 4.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBsAg和HBsAb双阳性的发生率 |
| 2.双阳性组和对照组的基本信息 |
| 3.PreS/S区氨基酸突变率分析结果 |
| 4.全序列核苷酸和氨基酸突变位点分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 HBV/CD重组体时空动力学分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建 |
| 2.数据库内序列的基因型和重组分析 |
| 3.用于时空动态分析的主要工具和软件 |
| 4.时空动态分析方法 |
| 5.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建情况 |
| 2.HBV D基因片段tMRCA分析结果 |
| 3.HBVC基因片段tMRCA分析结果 |
| 4.HBV/CD1重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 5.HBV/CD2重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 6.HBVC基因型和D基因型时空动态分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 乙肝病毒感染者血清表面抗原表面HBsAg/HBsAb双阳性研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（5）云南地区少数民族中HBV的流行和HBV pgRNA检测方法的建立与评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乙型肝炎 |
| 1.2 HBV传播方式 |
| 1.3 HBV的基因组和生命周期 |
| 1.3.1 HBV的复制与转录 |
| 1.4 HBV基因分型与重组变异 |
| 1.5 HBV基因型地理分布情况 |
| 1.5.1 HBV基因型在世界的流行 |
| 1.5.2 HBV基因型在中国的流行 |
| 1.5.3 HBV基因型在云南的流行 |
| 1.6 国内外不同种族/民族基因型流行现状 |
| 1.6.1 全球不同种族乙型肝炎流行现状 |
| 1.6.2 中国不同民族乙型肝炎流行现状 |
| 1.6.3 HBV在云南各少数民族的流行 |
| 1.7 乙型病毒性肝炎的治疗 |
| 1.7.1 乙型肝炎的治疗现状 |
| 1.7.2 乙肝治疗的新型血清标志物HBV PgRNA |
| 1.8 研究的目的和意义 |
| 1.9 研究的技术路线 |
| 第二章 云南地区HBV在少数民族中的流行 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要的仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 乙肝表面抗原(HBs Ag)ELISA检测 |
| 2.3.2 病毒DNA核酸提取 |
| 2.3.3 引物设计与样本巢式PCR扩增 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.3.5 琼脂糖凝胶DNA回收 |
| 2.3.6 送测序 |
| 2.3.7 双峰样品TA克隆 |
| 2.3.8 菌落PCR |
| 2.3.9 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 云南省HBV的流行病学 |
| 2.4.2 部分受试样本乙型肝炎表面抗原检测阳性结果 |
| 2.4.3 受试者临床生化分析 |
| 2.4.4 HBV部分基因组序列扩增结果及测序分析 |
| 2.4.5 HBV部分基因组序列的系统发育分析 |
| 2.4.6 云南省HBV基因型在少数民族中的流行分布情况 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 HBV基因分型 |
| 2.5.2 HBV在云南地区少数民族中的分布 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 HBV基因组全长扩增 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验对象 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 引物设计 |
| 3.3.2 巢式PCR扩增 |
| 3.3.3 测序 |
| 3.3.4 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 HBV基因组序列全长扩增结果及测序分析 |
| 3.4.2 基于全长HBV基因组序列的重组分析 |
| 3.4.3 毒株YNKM91 的全长HBV基因组序列的系统发育和重组分析 |
| 3.4.4 HBV B/I重组毒株(YNKM91)的子区域进化树 |
| 3.4.5 HBV基因型重组序列的重组片段和断点位置分析 |
| 3.4.6 新型HBV亚型C17的全长基因组序列分析 |
| 3.4.7 新型HBV亚型C17的全长基因组耐药突变分析 |
| 3.4.8 HBV新亚型B10全长基因组序列分析 |
| 3.4.9 新型HBV亚型B10的全长基因组耐药突变分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 HBV新亚型的鉴定与命名 |
| 3.5.2 HBV重组分析 |
| 3.5.3 HBV耐药突变分析 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 HBV PgRNA定量检测方法的建立及应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验对象 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 主要实验仪器 |
| 4.2.4 主要的数据分析方法 |
| 4.3 引物设计 |
| 4.3.1 普通PCR引物设计 |
| 4.3.2 荧光定量PCR引物和探针的设计 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 样品准备 |
| 4.4.2 样品RNA提取 |
| 4.4.3 PCR扩增HBV PgRNA目的片段 |
| 4.4.4 PCR电泳检测 |
| 4.4.5 目的片段和质粒载体片段双酶切 |
| 4.4.6 PCR产物及质粒载体的纯化 |
| 4.4.7 送测序 |
| 4.4.8 PET32a-PgRNA质粒的构建 |
| 4.5 阳性重组质粒的提取 |
| 4.6 质粒酶切验证和测序验证 |
| 4.6.1 重组阳性质粒双酶切验证 |
| 4.7 HBV PGRNA产物体外转录及纯化 |
| 4.7.1 HBV PgRNA产物体外转录 |
| 4.7.2 HBV PgRNA体外转录产物的纯化 |
| 4.8 荧光定量PCR反应条件的建立 |
| 4.9 荧光定量PCR的反应体系和反应条件 |
| 4.10 结果 |
| 4.10.1 阳性质控品的构建 |
| 4.10.2 Taq_Man的灵敏性实验 |
| 4.10.3 Taq_Man的重复性实验 |
| 4.10.4 Taq_Man的特异性实验 |
| 4.10.5 两种HBV pgRNA检测方法的评价 |
| 4.10.6 临床样本的检测 |
| 4.11 讨论 |
| 4.11.1 Taq Man探针法的灵敏性、特异性和重复性的评价 |
| 4.11.2 临床样本的检测结果评价 |
| 4.12 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（6）候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与 miR-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 宿主基因多态性对乙型肝炎病毒慢性感染易感性及疾病进展的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 核苷(酸)类似物长期抗病毒治疗疗效分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 HBV RT区准种进化模式与核苷类药物抗病毒治疗应答关系的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HBsAg和抗-HBs共存乙肝病毒基因型Ⅰ感染者HBV准种特征及相关文献回顾Meta分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 综述 慢性乙型肝炎患者病毒准种的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）乙肝病毒宫内传播遗传易感性和环境影响因素及其交互作用研究（论文提纲范文）
| 全文缩写词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 乙肝病毒宫内传播发生率与影响因素研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 RLR-MAVS和 cGAS-STING信号通路基因及其他基因遗传变异与HBV宫内传播关联性研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 基因遗传变异与环境因素的交互作用对HBV宫内传播的影响 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 创新点与局限性 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ 博士期间研究工作总结 |
| 致谢 |
（9）贵州地区高风险乙型肝炎孕妇母婴垂直传播阻断的真实世界回顾性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 替诺福韦及替比夫定对贵州地区高风险乙肝孕妇孕期HBV病毒及免疫功能影响 |
| 前言 |
| 1. 对象与方法 |
| 1.1 研究人群 |
| 1.2 治疗方案 |
| 1.3 资料收集 |
| 1.4 检测方法 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 孕妇基本资料 |
| 2.2 干预组用TDF或LDT前肝功能及乙肝标志物及HBVDNA及HBVRNA,基因型对比 |
| 2.3 自孕24-28周用替诺福韦或者替比夫定抗病毒治疗效果判断 |
| 2.4 不同基因型的HBVDNA在不同治疗时间点的变化趋势 |
| 2.5 不同基因型的HBVRNA在不同治疗时间点的变化趋势 |
| 2.6 孕期免疫功能变化 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 对贵州地区高风险乙型肝炎孕妇母婴传播的临床结局观察 |
| 前言 |
| 1 对象及方法 |
| 1.1 研究人群 |
| 1.2 阻断措施 |
| 1.3 资料收集 |
| 1.4 诊断标准 |
| 1.5 检测方法 |
| 1.6 统计学方法 |
| 结果 |
| 2.1 分娩前干预组及非干预组HBV孕妇基本资料产后新生儿情况 |
| 2.2 未干预组与干预组所分娩的婴幼儿HBV母婴传播感染比较 |
| 2.3 未干预组与干预组,对照组所分娩的婴幼儿畸形率及产生乙肝保护性抗体(HBsAb)比较 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 探索乙肝病毒宫内感染的无创性产前诊断 |
| 前言 |
| 1. 对象及方法 |
| 1.1 研究人群 |
| 1.2 检测方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 胎儿游离DNA和乙肝病毒DNA的提取 |
| 2.2 胎儿游离DNA和乙肝病毒DNA测序 |
| 2.3 乙肝母婴传播产前预测模型 |
| 2.4 母婴垂直传播的HBV基因型及基因序列测定及其同源性判断 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 总结及展望 |
| 1. 本研究取得的成果 |
| 2. 本研究的创新之处 |
| 3. 本研究存在的不足 |
| 4. 展望 |
| 参考文献 |
| 综述乙肝病毒基因型及宿主基因多态性 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论着、论文 |
| 博士在读期间主持课题 |
| 博士在读期间所获科研奖励 |
| 英文缩略语 |
| 致谢 |
（10）HBV基因ntA1762T/G1764A及S蛋白I126T联合变异的临床与实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 慢性HBV感染患者HBV基因慢性HBV感染者S/BCP编码区基因突变位点分析 |
| 实验对象 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第二部分 HBV ntA1762T/G1764A与I126T联合变异重组质粒的构建及体外实验 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获奖及发表文章情况 |
| 致谢 |
四、乙型肝炎病毒(HBV)宫内传播碱基突变的研究（论文参考文献）
- [1]PCR产物直接测序检测HBV逆转录酶区耐药突变方法的建立及临床应用[D]. 王松姣. 湖北中医药大学, 2021(10)
- [2]C基因型HBV变异与宫内传播的关系[J]. 赵甜静,杨志清,李雁笛,扆琳珠,丰淑英,汪波,冯永亮,王素萍. 中华流行病学杂志, 2021(04)
- [3]HBsAg阳性孕妇绒毛组织中HBV标记物和载脂蛋白H关系探讨[D]. 王素华. 汕头大学, 2020
- [4]青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究[D]. 刘贺. 中国疾病预防控制中心, 2020(02)
- [5]云南地区少数民族中HBV的流行和HBV pgRNA检测方法的建立与评价[D]. 刘莹. 昆明理工大学, 2020(05)
- [6]候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究[D]. 马宁. 河北医科大学, 2020(01)
- [7]慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究[D]. 范晶华. 昆明医科大学, 2019(02)
- [8]乙肝病毒宫内传播遗传易感性和环境影响因素及其交互作用研究[D]. 彭松绪. 华中科技大学, 2019(04)
- [9]贵州地区高风险乙型肝炎孕妇母婴垂直传播阻断的真实世界回顾性研究[D]. 张宝芳. 苏州大学, 2019(04)
- [10]HBV基因ntA1762T/G1764A及S蛋白I126T联合变异的临床与实验研究[D]. 戴海梅. 昆明医科大学, 2019(06)