一、Existence of homologous sequences corresponding to cDNA of the ver gene in diverse higher plant species（论文文献综述）
马红悦[1]（2021）在《沙葱萤叶甲成虫夏滞育调控的分子机理》文中认为沙葱萤叶甲Galeruca daurica是一种近年来在内蒙古草原上猖獗成灾的新害虫,主要危害沙葱Allium mongolium、多根葱A.polyrhizum、野韭A.ramosum等葱属植物,不仅给草原畜牧业造成了严重的经济损失,而且造成草原退化,严重威胁我国北方生态安全。滞育是昆虫为了躲避不利的环境条件并确保种群延续的适应性策略,目前关于昆虫滞育调控的生理生化及生态学机理已有深入的了解,而对其分子机制、特别是专性夏滞育调控的分子机理却较少了解。沙葱萤叶甲一年发生1代,为专性滞育昆虫,以成虫滞育越夏,以卵滞育越冬。本研究采用蛋白组学、转录组学及RNAi技术相结合的方法,对沙葱萤叶甲成虫夏滞育的分子机理进行了深入的研究。研究结果不仅有助于揭示专性夏滞育及生殖滞育的分子调控机理,而且为发展基于滞育调控的害虫防控技术提供了理论依据。主要结果如下:1.采用同位素标记的相对和绝对定量（iTRAQ）技术构建了沙葱萤叶甲成虫滞育前期（PD）、滞育期（D）及滞育后期（TD）的蛋白质组学数据库,共获得2383个蛋白,其中进入滞育（D/PD）和滞育结束后（TD/D）分别有139和118个蛋白差异表达。生物信息学分析表明,差异表达蛋白主要与吞噬体通路、代谢过程、胁迫反应、细胞骨架重组、昆虫保幼激素、钙离子信号通路、核糖体通路及化学感受等有关。2.应用RNA-Seq测序技术构建了外源JH类似物烯虫酯（JHA,methoprene）处理沙葱萤叶甲成虫后的转录组数据库,在JHA施用后24 h和48 h分别得到310和598个差异表达基因。KEGG分析表明,大量的差异表达基因显着富集于各种代谢通路,主要与能量代谢、生物合成、胁迫反应以及信号传导通路密切相关。RNA-Seq和qPCR分析表明,JHA促进了Gd Vg、Gd FOXO和Gd Kr-h1的表达,而抑制了Gd JHBP、Gd JHE、Gd JHAMT、Gd JHEH和Gd FAS的表达,其作用强度随JHA浓度的增加而增强。在滞育前期注射JHA可抑制脂质蓄积并延缓成虫进入滞育,在滞育期间施用JHA则对滞育和脂质积累没有显着影响。3.采用RT-PCR技术克隆获得沙葱萤叶甲保幼激素酯酶、保幼激素耐受蛋白、保幼激素甲基转移酶、保幼激素环氧化水解酶、叉状头转录因子、卵黄原蛋白、锌指转录因子和脂肪酸合酶的开放阅读框（ORF）全长序列,分别命名为Gd JHE、GdMet、Gd JHAMT、Gd JHEH、Gd FOXO、Gd Vg、Gd Kr-h1和Gd FAS,ORF全长为222～6162bp,编码74～2053个氨基酸。qPCR分析表明,GdMet、Gd JHE、Gd JHAMT及Gd Kr-h1在沙葱萤叶甲滞育前期高表达,滞育期间表达量显着下调,且低水平表达模式持续到滞育后期;Gd Vg在滞育前期和滞育后期的表达量水平显着高于滞育期;Gd JHEH和Gd FAS在滞育前期均下调表达,滞育期均呈先上调后下调的表达趋势,Gd JHEH在滞育后期上调表达,Gd FAS在滞育后期下调表达;Gd FOXO仅在25日龄的滞育期高表达,其余发育阶段表达量均维持较低水平。4.利用RNAi技术沉默GdMet,在第48 h沉默效率最佳为84.11%。qPCR分析表明,沉默GdMet抑制了Gd JHBP、Gd JHE、Gd Vg及Gd Kr-h1的表达,促进了Gd FAS的表达,而对Gd JHAMT、Gd JHEH和Gd FOXO的表达没有显着影响。与对照组（ds GFP）相比,注射ds Met试虫的总脂含量显着增加,促进脂肪体发育,导致成虫提前3.1 d进入滞育。5.通过RACE技术克隆获得沙葱萤叶甲己糖激酶和核糖体蛋白S3a基因的全长cDNA序列,分别命名为Gd HK和Gd RpS3a。Gd HK的cDNA全长为1699 bp,开放阅读框长为1479 bp,编码492个氨基酸。qPCR分析表明,Gd HK在沙葱萤叶甲不同发育阶段均有表达,成虫滞育期间表达量维持在低水平,而滞育结束后表达量急剧上升达最高值。在0～40℃范围内,随着温度增加,Gd HK在沙葱萤叶甲成虫体内表达量呈先上升后下降的趋势。Gd RpS3a的cDNA全长为800 bp,开放阅读框长为687 bp,编码228个氨基酸。Gd RpS3a在不同发育阶段的沙葱萤叶甲体内均有表达,在成虫滞育结束后表达量最高,在卵期和成虫滞育期间低表达。温度对Gd RpS3a的表达有显着的影响,30℃下最高,0℃下最低。
庞宏光[2]（2020）在《梨棕榈酰基转移酶基因家族鉴定及PbPAT14功能研究》文中进行了进一步梳理棕榈酰基转移酶（Palmitoyl Transferases,PATs）是植物中一类重要的蛋白质翻译后修饰酶,在蛋白质棕榈酰化修饰过程中发挥着关键的作用。研究表明,PATs在真核生物中具有广泛的细胞功能,对植物的生长发育、器官形成、生殖发育及胁迫响应等生命活动具有重要的调控作用。因此,PATs功能的发掘为植物株型构建、增产增收以及品质改良等分子设计育种工作提供了新的研究思路和基因资源。目前,我国梨栽培生产中还没有有效的梨矮化砧木,探索分析梨中具有矮化潜力的PATs功能,有助于揭示砧木矮化机理,对加快我国梨产业现代化转型升级,实现矮化栽培模式具有重要的意义。本研究利用生物信息学方法对编码PATs蛋白的梨PbDHHC基因家族进行了分析鉴定,以杜梨（Pyrus betulifolia）为研究试材,利用CRISPR/Cas9基因编辑对PbPAT14基因进行敲除获得杜梨矮生突变体,从生长指标、微观结构、内源激素含量、基因表达模式以及互作蛋白筛选等角度对杜梨突变体进行深入剖析,旨在阐释杜梨矮生突变体的矮生机理,为进一步揭示砧木矮化机理提供理论依据。主要研究结果如下:1、全基因组水平从梨（Pyrus bretschneideri ’Dangshansuli’）测序数据中鉴定到36个完整的PbDHHCs基因,命名为PbDHHC1～PbDHHC36。该基因家族氨基酸序列平均长度为456 aa,蛋白分子量从27659.82 Da到79207.72 Da,等电点从5.22到9.78,80%的PbDHHCs编码蛋白中包含4个跨膜结构域。基因定位显示,26个PbDHHCs基因定位到14条染色体上,并呈现出不均匀的分布形式。根据同源进化关系,可将PbDHHC基因家族分为A～G共7个亚组,其中每个亚组的PbDHHCs在基因结构和结构域相位分布上表现出较高的一致性,进一步支持了同源分组关系的准确性。基因启动子分析发现,PbDHHCs基因上游存在着大量与生长发育和激素应答相关的顺式作用元件,说明梨PbDHHCs基因在转录过程中可能具有十分复杂的调控模式。基因表达模式分析表明,89%的PbDHCs基因在不同组织器官中均有表达值,并且表现为组成型表达模式,说明PbPATs在梨中具有十分广泛的生物功能。2、利用Trizol方法、CTAB方法和试剂盒方法常见的三种植物总RNA提取方法,系统性分析对比各个方法提取的杜梨不同组织（根、茎、叶、花和果实）总RNA的质量。结果表明,三种方法均可以从杜梨各个组织中提取出总RNA,但是不同方法提取的总RNA浓度和质量相差较大。三种方法提取的果实总RNA浓度相较于其他组织较低,CTAB方法提取的杜梨各个组织总RNA浓度高于其他方法,试剂盒方法提取的杜梨各个组织总RNA纯度最好。电泳检测结果表明,三种方法提取的总RNA均不同程度的遗漏了小分子5S RNA,其中Trizol方法和CTAB方法最为明显,并且均存在不同程度的拖尾现象。3、梨中假定的PbPAT14-1和PbPAT14-2基因编码序列长度分别为921 bp和906 bp,两者的基因结构十分相似均有7个外显子和6个内含子构成,但两者的基因全长差异较大,分别为5822 bp和3324 bp,说明这两个基因可能来自不同的祖先或者在进化过程中丢失片段差异较大。另外,PbPAT14-1和PbPAT14-2与拟南芥AtPAT14的氨基酸序列同源相似度分别为83%和70%。体内互补试验表明,PbPAT14-2可以挽救酵母AKR1 PAT功能缺失突变体akr1的生长缺陷,同时还可以恢复拟南芥突变体atpat14的矮生表型,说明PbPAT14-2蛋白具有PATs酶活性,而PbPAT14-1蛋白并没有表现出PATs酶活性。氨基酸点突变试验结果显示,将PbPAT14蛋白中DHHC保守结构域上的半光氨酸突变为丝氨酸后,PbPAT14-DHHC148S并不能恢复酵母突变体akr1的生长缺陷,说明PbPAT14蛋白的酶活性位点为DHHC保守结构域中的半光氨酸残基。Acyl-RAC试验结果表明,PbPAT14蛋白具有自身棕榈酰化的功能。4、根据PbPAT14基因序列,筛选到三个特异性较强打靶位点PbPAT14-T1、PbPAT14-T2和PbPAT14-T3,并构建植物CRISPR/Cas9融合表达载体。以杜梨种子子叶为试材,利用农杆菌转化方法,共获得22株转基因杜梨苗,其中6株具有矮生黄化表型。测序结果显示,矮生黄化植株中T2和T3靶点序列发生了基因编辑事件。单克隆测序分析表明,靶点区域产生的突变类型为单碱基或小片段的缺失和插入,并且不同的sgRNA表达盒在各个靶点表现出不同的编辑效率,分别为0%、86.3%和68.1%。脱靶位点测序结果表明,潜在的三个脱靶位点区域均没有发生基因编辑。5、生长指标测定结果表明,野生型杜梨的平均株高大约为杜梨突变体的3倍,分别为3.01 cm和1.09 cm;野生型叶片数量大约为突变体的2倍,分别为19和11;野生型杜梨和突变体在叶片面积上没有表现出显着性差异。另外,野生型杜梨叶片的叶绿素含量大约是突变体的2.5倍,分别为1.63 mg/g和0.67mg/g。微观结构观察发现,杜梨突变体的茎直径显着小于野生型,但是茎组织细胞（包括皮层细胞和髓细胞）的长度和宽度均没有表现出显着性差异,说明杜梨突变体的矮生性状与细胞数量有关,与细胞大小并无直接关系;杜梨突变体叶片厚度（包括栅栏组织和海绵组织）明显小于野生型。内源激素测定结果表明,杜梨突变体中ABA含量明显高于野生型,并且ABA代谢通路中相关基因的表达量同样存在显着性差异,说明梨中PbPAT14蛋白所修饰的底物可与ABA代谢通路相关。6、根据杨树（Populus trichocarpa）细胞中鉴定的棕榈酰化蛋白,筛选得到与ABA代谢通路相关的棕榈酰化蛋白CPKs。通过同源比对,从梨基因组中找到5个同源的 PbCPKs 基因,分别为 PbCPK1、PbCPK6、PbCPK13、PbCPK21 和 PbCPK30。棕榈酰化修饰位点预测软件CSS-Plam分析结果表明,这些PbCPKs蛋白中包含1 1个棕榈酰化修饰位点,说明PbPAT14蛋白的修饰底物可能为PbCPKs,为进一步揭示PbPAT14棕榈酰化修饰分子机制提供了线索。
杨悦[3]（2020）在《黄瓜CsATG8c和CsATG8e基因的表达与功能分析》文中研究表明自噬是一种存在于真核生物当中进化保守的分解代谢过程,在这过程中,自噬对细胞内受损蛋白及细胞器进行降解并对细胞内物质进行循环再利用。当细胞发生程序性死亡时,自噬在降解死亡细胞组分时发挥积极作用。自噬既能促进病原菌所引起的防御相关过敏性细胞死亡,又能限制不必要的细胞死亡和疾病传播,这种精准调节对植物免疫反应有很重要作用及意义。自噬最早在酵母中研究,随之在动物中研究比较细致,但在植物中的研究还处于早期阶段,目前在拟南芥、大豆、水稻和玉米等植物中发现自噬基因。黄瓜自噬相关基因的研究尚无报道。本研究在全基因组水平上筛选并鉴定出黄瓜20个自噬基因家族成员,对该20个家族成员的结构特征及系统发育关系等信息进行分析,并对20个基因在2种激素诱导处理及3种胁迫处理下的表达进行分析。从中选取基因CsATG8c和CsATG8e构建过表达载体转化拟南芥,分析基因的功能,为揭示自噬在黄瓜生长发育抵抗逆境胁迫中的作用奠定基础。实验结果如下:1.采用生物信息学分析技术,在黄瓜基因组中共鉴定出20个ATG（自噬相关基因）基因。数量比水稻、烟草和玉米中少。与酵母中的自噬基因只具有单个拷贝不同,黄瓜自噬基因既有单拷贝也有多个拷贝,如ATG8基因,在烟草、拟南芥和大豆中分别有5、9和11个拷贝。在黄瓜中有6个拷贝。20个CsATG蛋白序列的长度为87-1940个氨基酸不等,分子量从9到215kDa不等,预测的等电点从4.81到9.77不等。20个自噬基因不均匀分布在黄瓜7条染色体上,并且在其中共找到20个预测的motif。除此之外,还系统的分析了该家族基因的结构、共线性、系统发育等生物学信息。2.用10 mmol/L SA和0.2%MeJA滴加叶片进行激素诱导处理、用200 mmol/L NaCl、20%PEG6000和黑暗对黄瓜根、茎和叶进行盐、干旱和碳饥饿胁迫处理。qRT-PCR表达结果显示,16个CsATG基因受激素SA处理诱导表达,16个CsATG基因受激素MeJA处理呈现下调表达。碳饥饿胁迫下,20个CsATG基因在叶中呈现诱导表达。高盐胁迫下,10个CsATG基因在根中呈现诱导表达。干旱胁迫下,16个CsATG基因在根中呈现诱导表达。还发现碳饥饿胁迫6h时,20个CsATG基因中的大部分基因在黄瓜根、茎和叶中的表达量最高,这说明其在营养饥饿耐受中具有潜在作用。3.从20个黄瓜自噬相关基因中选取CsATG8c和CsATG8e,运用克隆技术对这两个自噬基因进行编码区全长序列的克隆并进行生物信息学分析。结果显示,CsATG8c基因位于黄瓜的5号染色体上,cDNA全长为356bp,蛋白的氨基酸数目为118个,编码蛋白分子量为13689.82Da,理论pI值是8.71,总原子数为1954,不稳定系数为35.39,脂肪系数为85.93。CsATG8e基因位于黄瓜的6号染色体上,cDNA全长为371bp,蛋白的氨基酸数目为123个,编码蛋白分子量为13721.89Da,理论pI值是9.33,总原子数为1961,不稳定系数为40.39,脂肪系数为93.58。通过NCBI BlastX比对测序结果显示CsATG8c和CsATG8e都属于UBQ超家族。4.CsATG8c和CsATG8e基因转化拟南芥:构建了黄瓜ATG8c和ATG8e基因超表达载体,运用农杆菌介导的浸花法将质粒转入到野生型拟南芥植株当中,得到CsATG8e转基因拟南芥植株T1代种子。
朱弘[4]（2020）在《尾叶樱桃（Cerasus dielsiana）系统分类地位与种群生物地理学研究》文中认为尾叶樱桃（Cerasus dielsiana）隶属蔷薇科（Rosaceae）典型樱亚属（Subg.Cerasus）,是我国亚热带特有的一种代表性野生观赏落叶小乔木,天然种群分布较广且地理变异多样,具有十分广阔开发利用前景。但根据多年的野外调查,其种质资源大都处于野生状态,同时还面临人为干扰加剧、生境破碎化造成的种群衰退的风险,至今尚无针对该物种的系统研究报道。因此,本研究以尾叶樱桃主要分布区的天然种群为研究对象,在广泛的标本记录查阅和野外种群采样基础上,整合形态学标记、分子系统发育与亲缘地理学、景观遗传学的多个手段,深入开展了对该物种的研究,论文主要内容与获得的主要结果如下:（1）系统发育分析与分类学处理基于1个叶绿体DNA非编码区片段,初步开展了尾叶樱桃的系统发育重建,以期澄清该种与其近缘种间亲缘关系及分类地位,结果表明:1)在atpB-rbcL序列矩阵的774个有效位点中共发现15个多态性位点,占分析序列的1.94%,共检测出9个单倍型,物种间平均单倍型多样性（Hd=0.8805±0.026）,平均核苷酸多态性（π=0.00711±0.00054）,除尾叶樱桃外（Hap5～Hap7）,其余物种均拥有各自独特的1个单倍型,具有较丰富的遗传多样性。2)综合Network中介图、系统发育重建与生物信息学手段的RNA二级结构预测的定量分析结果,我们推测尾叶樱桃与长柱尾叶樱桃（C.dielsiana var.longistyla）互为姊妹群（Sister group）,并共同构成独立进化单元;虽然磐安樱桃（C.pananensi）的系统位置未能确认,但推测该种与浙闽樱桃（C.schneideriana）的亲缘关系较近,可能为古今多次杂交起源,且在近期最可能受到后者与山樱花（C.serrulata）的双重基因渐渗。3)基于上述分子证据结合形态学描述支持发表的尾叶樱桃的新变种——长柱尾叶樱桃。同时,综合模式标本考证与文献研究,依据《国际藻类、菌类、植物命名法规》精神,指定NO.5812（GH-00032047）作为尾叶樱桃的后选模式（lecotype）。（2）天然种群叶表型变异研究及生态响应规律通过多重比较、巢氏方差分析、相关性分析、主成分分析（PCA）、主坐标分析（PCoA）、非加权配对算术平均法（UPGMA）聚类分析等数理方法,初步对来自川、鄂、湘、赣、台5省8个尾叶樱桃天然种群的11个叶表型性状进行了比较分析,研究其不同地理单元间叶表型多样性和地理变异规律及对地理气候的响应。结果表明:1)尾叶樱桃主要叶表型性状变异在种群内和种群间均存在显着差异,平均变异系数为22.44%,其中变异系数最大和最小的分别为叶面积（50.83%）与一级侧脉数（7.96%）;平均叶表型性状的分化系数为30.78%,种群内的变异（51.55%）大于种群间的变异（22.55%）。2)PCA表明对尾叶樱桃叶表型性状变异起主要贡献作用的前3大主成分累计贡献率达到92.400%,可以综合概括和排序为“大小性状”（73.242%）与“形状性状”（19.158%）。3)叶宽（r=–0.641）、叶面积（r=–0.658）和一级侧脉数（r=0.659）性状均与经度呈显着负相关或正相关关系,气温季节变化和最湿季降水量对叶表型性状变异影响较大。4)基于PCoA和UPGMA聚类分析可将8个天然种群划分为4类。（3）分子亲缘地理学研究利用双亲遗传的核糖体DNA内转录间隔区nrITS标记对尾叶樱桃天然分布区所在的25个种群的203个个体开展了空间遗传结构与谱系历史的检测:1)共检测到18个核糖体分型（ribotypes）,在物种水平,尾叶樱桃具有较高的核糖体分型与核苷酸多样性（Hd=0.879±0.012,π=3.56±0.16）;基于核糖体分型的中介邻接网络（Median-joining network）和分子变异的空间分析（Spatial analysis of molecular variation,SAMOVA）均支持尾叶樱桃天然地理种群存在4个显着的谱系地理种内分组:西部组（West Group）+北部组（North Group）+中南部组（Central&South Group）+东部组（East Group）;基于邻接法（Neighbor-joining,N-J）的系统发育重建显示北部组为非单系类群,即其余3个地理组镶嵌在其中,表明种群存在不完全的谱系分选（Incomplete lineage sorting,ILS）现象;对上述4个地理分组进行的分子方差分析（Analysis of molecular variance,AMOVA）检测到了显着的遗传分化水平,其中有78.27%的遗传变异存在于种群间,而其余21.73%存在于种群内,表明其具有显着的谱系地理结构(Nst=0.837>Gst=0.585;P<0.05);2)利用BEAST软件结合7个外类群作二次校正点的分子钟分歧时间估算结果表明,尾叶樱桃的最近共祖时间（Time to the most recent common ancestor,TMRCA）大约出现在6.28Mya（95%HDP:3.64～8.83 Mya）,即中新世晚期至上新世早期,其中东部组的冠群（Crown group）时间分化于更新世（Pleistocene,大约1.97 Mya）前后,时间与末次盛冰期（Last Glacial Maximum,LGM）相吻合;3)结合SDM的最大熵模型（Maximun entropy,MaxEnt）模拟比较了LGM时期与现代两种气候情境下的潜在分布区,发现在亚热带南方很可能曾存在多个冰期避难所。4)利用统计学的扩散-隔离分析法（Statistical dispersal-vicariance analysis,S-DIVA）的祖先分布区重建（Reconstruct ancestral state in phylogenies,RASP）软件分析进一步推测尾叶樱桃时间-地理事件的扩张路线。结果显示其祖先种群最早可能起源自北部地理组的秦岭-巴山山脉,随后先后经历了两次向南扩散事件,在东部-北部地理组间以及东部-西部地理祖间或曾存在2个次生分化中心,后又分别向西、南,西、向东方向扩张,逐渐形成现代的分布格局。（4）景观遗传学分析基于多种算法定量分析了栖息地景观特征对尾叶樱桃种群遗传结构形成过程中的影响:1)基于单倍型多样性（Hd）和反距离加权（Inverse Distance Weighting,IDW）差值法,反映出该物种种群的遗传多样性在总体上存在空间分布不均和随经度上呈东西分化的地理分布格局。2)基于种群间地理距离与遗传距离的曼特尔检验（Mantel test）结果表明两者存在较弱的相关性（r=-0.345,R2=0.1193）,更加符合基因流模式的环境隔离（Isolation by environment,IBE）假说。3)基于成对基因流,检测到南岭-罗霄,巫山-武陵山山脉形成了种群间的地理隔离,其中尤以东西走向的南岭山脉是尾叶樱桃最显着的天然物理屏障,阻碍了4个谱系地理分组间的基因流,从而促进了不同谱系间的异域分化。此外,阿里山种群（ALS）基因流并未受到闽台之间台湾海峡地理隔离的影响,应与更新世冰期的“东山路桥”多次形成密切相关。（5）适生区模拟与生态特征评价为定量评估其当代多样性分布格局以及生态适应性,使用基于生态位理论的DIVA-GIS软件耦合BIOCLIM模型开展分析,结果包括:1)现代尾叶樱桃的分布范围较广,但在总体上存在分布不均匀格局,种群分布的核心地理范围集中在中国西部的巫山山脉和武陵山脉。2)水热变量,尤其是温度季节变化方差（bio4）被定量筛选出来,成为塑造当前地理格局的最具影响的因素。3)与同域分布的其它科植物（樟科、木兰科）比较,蔷薇科樱属植物的气候-生态位格局在区域尺度上支持水-热动态（Water-energy dynamic）假说和系统发育生态位保守性（Phylogenetic niche conservatism,PNC）假说。4)Pearson相关性分析与典范对应分析（Canonical correspondence analysis,CCA）结果均表明来自海拔生境过滤作用相比经度和纬度的作用更加显着。（6）保育计划的形成掌握遗传多样性和分布格局为物种保育或核心种质库建设提供科学决策。因此,从保育遗传学角度,大范围层面上,4个独立的原地保护单元（ix situ）能够被确定,其中处于North Group的大巴山-巫山和武陵山区作为祖先类型和现代遗传多样性中心应该予以高度重视和优先保护;而在资源（资金、人员）有限的情况下,湖南张家界（ZJJ）、壶瓶山（HPS）,贵州梵净山（FJS）、广东南岭（NL）等遗传多样性最丰富的种群作为局域尺度下原地保护和核心种子库种源的主要对象。此外,考虑到气候变化、城市化和人类经济活动对尾叶樱桃野生生境和生存带来的不断威胁,开展一定的迁地（ex situ）保护、引种扩繁亦或是跨地域的人工异交计划可以作为重要的补充。总之,在地质事件、自然选择、地理隔离与环境阻力等一系列历史-生态的综合作用下,尾叶樱桃通过种群扩散-隔离-分化事件,逐渐形成当今的生物地理格局。上述研究结果为我国亚热带森林物种的多样性起源、演化模式提供了一个新的案例,也为今后野生樱属种质资源的保护与开发利用提供参考。
石宏武[5]（2020）在《罗汉果叶绿体基因组组装分析及葫芦二烯醇合酶基因转录因子研究》文中研究指明罗汉果（Siraitia grosvenorii）是属于我国药用植物特有种,其果实中的罗汉果甜苷V具有止咳、祛痰、消炎等功效,同时又是高甜味、低热量的珍贵天然甜味剂。然而,罗汉果甜苷V在现有品种中含有量较低,其复杂的生物合成和分子调控过程未被认识限制了其进一步挖掘利用。作为与罗汉果S.grosvnenorii同属的翅子罗汉果（S.siamensis）,其果实中含有一种甜度比罗汉果甜苷V甜味更强的物质赛门苷,且含量远高于罗汉果S.grosvenorii是与罗汉果不同的甜料种质资源,但其种质非常稀有,种质资源研究也十分缺乏,所以很有必要对这两种重要的药用和甜料植物进行种质资源分子鉴别。此外,葫芦二烯醇是罗汉果甜苷和赛门苷的关键中间体结构,研究发现外源植物激素可促进葫芦二烯醇合酶基因（SgCDS）表达及相应产物积累,但该基因表达调控机制不明确,限制了甜苷合成途径的进一步优化。本论文第一部分以罗汉果S.grosvenorii和翅子罗汉果S.siamensis为研究对象,DNA测序、组装、注释和分析这两个物种的叶绿体基因组,并开发用于鉴定的分子标记。第二部分,从调控SgCDS基因的转录因子入手,克隆SgCDS启动子序列,采用酵母单杂交筛选获得调控SgCDS表达的候选转录因子,最后对候选转录因子进行了功能鉴定,并对转录因子与SgCDS启动子互作进行了探究。本论文主要研究结果如下:1.测序拼接组装注释了两个罗汉果属物种的叶绿体基因组。测序组装拼接分别获得 S.grosvenorii和 S.siamensis两个物种 158,757 bp 和 159,190 bp 的叶绿体基因组,均含有138基因,包含89条编码基因,37条tRNA以及8条rRNA,23条基因存在内含子。9条基因（accD,atpA,atpE,atpF,clpP,ndhF,psbH,rbcL和rpoC2）存在正向压力选择,两个物种与苦瓜属植物Momordica charantia进化关系最近。叶绿体基因组基因间区中的20个片段区域具有分子标记开发潜力,设计并验证了 4个可用于鉴定S.grosvenorii和S.siamensis的分子标记2.外源植物激素对罗汉果生长及甜苷合成的影响。使用MeJA及其混合物对罗汉果叶处理发现,MeJA、SA、ABA和GA四种激素混合物能有效促进SgCDS基因表达,并能短暂提升葫芦二烯醇的积累。此外,CPPU处理罗汉果果实后,果实生长受到抑制甚至出现裂果,显微观察发现果皮提前木质纤维化,CPPU不适用于膨大20天果龄的罗汉果。3.克隆并分析了SgCDS基因启动子序列。染色体步移法克隆了1,258bp的SgCDS基因启动子,预测分析其含TATA-BOX和CAAT-BOX启动子核心元件,以及响应MeJA、SA、ABA和GA作用元件。启动子不同长度5’端缺失表明启动子-128 bp到-228 bp,-279 bp到-384 bp片段和-679 bp到-879 bp片段具有较强的启动子功能。4.构建了SgCDS高表达的均一化cDNA质粒文库。以外源植物激素处理的罗汉果叶为材料,构建cDNA质粒文库pGADT7-Lib,文库库容约1.5×106 cfu,文库插入片段平均长度为1000 bp,重组率约100%,冗余率为1%。5.筛选到调控SgCDS表达的转录因子。将SgCDS启动子-260 bp～-386 bp片段作为诱饵序列构建诱饵载体,在120 mM 3-AT筛选浓度下,使用诱饵质粒酵母单杂交筛选pGADT7-Lib文库,获得SgERF1B,SgGATA8,SgMYB1,SgbHLH92a和SgbHLH92b共5个候选编码转录因子基因。6.克隆、鉴定及功能分析候选转录因子。克隆候选转录因子基因全长,分析均含有转录因子保守结构域,并发现其在罗汉果果实中均高表达,酵母单杂交回复验证了5个候选转录因子均能与诱饵序列发生互作。候选转录因子均定位于细胞核区。候选转录因子基因的过表达及沉默实验发现SgERF1B和SgGATA8均具有正向调控SgCDS基因表达的作用,SgMYB1可能参与下游甜苷的生物合成。7.鉴定SgERF1B和SgGATA8与SgCDS启动子互作的顺式元件。蛋白原核表达获得了SgERF1B-His和SgGATA8-His纯化标签蛋白。EMSA实验证明了SgERF1B作用于SgCDS启动子上的CGGCGGCGGC顺式元件,SgGATA8可以与SgCDS基因启动子上的GGTGATC顺式元件发生互作,但SgGATA8与GGTGATC顺式元件互作的特异性不强。本研究解析的罗汉果叶绿体基因组和调控SgCDS表达的转录因子,为后期集合优良性状的罗汉果分子设计育种及植物代谢工程研究奠定基础,也同时为研究其他药用植物次生代谢产物合成途径的优化提供新思路。
刘翠花[6]（2020）在《烟草NtVQ35基因的鉴定及其抗青枯病基本功能研究》文中认为由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的烟草青枯病,是对世界烟草产业具有经济重要性的细菌性病害,在热带、亚热带区域发生更为严重。VQ蛋白（FxxxVQxxTG）是植株中广泛存在的一类调节因子,不仅参与植物生长的各项生命过程,而且参与植物对逆境以及病原菌的胁迫应答。迄今,烟草vq基因家族包含哪些重要成员及其在抗烟草青枯病过程中发挥的作用尚不明确。因此,本研究首先利用生物信息学方法对烟草vq基因家族进行鉴定、系统分析其结构特征,并探索该家族成员在不同胁迫下的应答情况。经过系统筛选,筛选出NtVQ35基因。为了探索其在抗青枯病方面的功能,首先利用规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关基因（Cas9）技术（CRISPR/Cas9）和Gateway技术成功获得NtVQ35基因的编辑植株和过表达植株。然后对接种青枯病菌后的编辑植株、过表达株和野生型植株进行症状观察、病情指数统计和叶片内青枯病菌数目统计比较分析;同时对其进行比较转录组分析和水杨酸含量的测定,以期解析NtVQ35在抗青枯菌方面的作用机制。所获得的主要研究结果如下:1)探明烟草vq基因家族可分为I-VIII组,探索了几种处理的应答情况对烟草vq基因家族成员通过生物信息学方法进行系统挖掘和探索,并对其在激素【水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯利（ET）、脱落酸（ABA）、生长素（2,4D）】、非生物刺激（包括冷害、热害、伤害）以及病原菌（青枯病菌）处理下的应答情况进行系统分析,结果显示共预测得到59个烟草NtVQ蛋白,根据其氨基酸序列和所含有的多种保守结构域将其分为I-VIII组。其中II、IV、V、VI和VIII组成员可响应一种或多种激素。VII组不响应任何激素刺激。结构域相似的NtVQ基因对不同激素处理具有相似的响应模式。II和V组是响应ET处理最多的组,V组和VIII组是响应ABA最多的组。多数基因受到SA的诱导。温度处理中,NtVQ33和NtVQ34有明显的应答;而伤害处理中NtVQ32,NtVQ46和NtVQ58有明显的应答。半数以上的NtVQ基因受到烟草青枯病菌的诱导。研究发现NtVQ35基因能够同时被SA和青枯病菌高度诱导表达,对该基因的启动子区域分析,发现其启动子区域含有3个胁迫和防御响应相关的富含TC的重复序列。因此推测该基因可能在抗青枯病菌中发挥一定作用。2)初步明确vq基因家族代表基因NtVQ35负向调控烟草青枯病菌的侵染通过CRISPR技术和烟草叶盘法转基因技术成功获得烟草NtVQ35基因编辑植株遗传品系H4-8和H7-8,通过Gateway技术和烟草叶盘法转基因技术获得NtVQ35过表达遗传品系OE5、OE6和OE8。对获得的NtVQ35基因编辑株和过表达株进行表型观察,发现其跟野生型植株在生长发育上无明显差异,因此推测该基因不影响植株的生长和表型变化。对基因编辑株遗传品系H7-8、过表达株遗传品系OE6和野生型K326烟草分别接种青枯病菌,结果显示过表达植株遗传品系OE6在接种4 d后相较于野生型叶片发生明显萎蔫,病情指数为22.22%,编辑植株遗传品系H7-8相较于野生型植株症状上无特别明显变化,病情指数分别为0.55%,4.45%;9 d后,过表达植株OE6表现为叶片全部萎蔫并且茎基部颜色变黑,野生型植株表现为大部分叶片萎蔫,编辑植株H7-8表现约50%叶片出现萎蔫;过表达植株OE6、野生型植株K326和编辑植株H7-8病情指数分别为90%、71%、48.25%。此外,对接种青枯病菌后3 d的编辑植株H4-8遗传品系、过表达植株OE6遗传品系和野生型K326植株进行症状观察,发现OE6叶片接种部分发生明显的坏死和黄化,野生型接种部位出现明显的黄色晕圈,而H4-8接种部位也出现部分黄色晕圈,但相较于OE6和野生型植株表现不明显。对接种青枯病菌3 d后的叶片进行青枯菌数目的统计,可以看到在编辑植株H4-8中病菌数目最少,H7-8次之,在过表达植株OE6中病菌数目最多,表明编辑植株相较于过表达植株对青枯病菌的抗性更强。综上,NtVQ35在抗青枯病菌中发挥负向调控作用。3)探索了NtVQ35对青枯病菌负向调控作用可能与SA信号转导有关对接种青枯病菌1 d后的过表达植株遗传品系OE6、NtVQ35基因编辑植株遗传品系H4-8和野生型植株进行转录组测序分析比较,结果表明,KEGG通路中显着富集的与植物抗病性相关的代谢通路主要有黄酮类生物合成代谢途径、植物激素信号转导途径和植物-病原菌互作通路。具体表现为青枯病菌侵染后的编辑植株H4-8中与类黄酮类合成相关的基因表达量高于过表达植株OE6;在PTI途径,编码FLS2、环核苷酸门控通道蛋白（CNGC）的基因表达量显着高于过表达植株OE6,因此推测NtVQ35基因编辑株可能产生更强的基础性免疫;另一方面,在ETI途径,编辑植株H4-8中R基因RPS2相较于过表达植株,被高度诱导,说明其受到青枯病菌无毒基因Avr（效应蛋白）的激发程度高于过表达植株;编辑植株H4-8中SA、ET和BR途径的相关基因的表达量,也明显高于过表达植株,表明编辑植株相较于过表达株更抗青枯病。此外,为探索SA在烟草NtVQ35抗青枯病中发挥的作用,利用高效液相色谱法对接种青枯病菌4 d后的编辑植株H4-8、过表达植株OE6和野生型K326烟草植株中SA含量进行了测定和分析。结果表明,在青枯病菌接种4 d后,编辑植株叶片含有的游离态SA含量水平（656.9 ng/g）,显着高于野生型（204.6 ng/g）和过表达植株（164.2 ng/g）,因此表明NtVQ35对青枯病菌负向调控作用可能与SA信号转导有相关性。进一步的研究值得跟进。
丁明珠[7]（2019）在《香榧中油体蛋白和金松酸合成关键酶编码基因的鉴定与功能初探》文中认为榧树（Torreya grandis）属于裸子植物门红豆杉科（Taxaceae）榧属（Torreya）常绿乔木。香榧（T.grandis ’Merrillii’）是榧树经无性繁殖形成的中的一个优良变异类型。作为我国的特色干果,香榧种仁营养价值极高,这主要得益于其高含量油脂中丰富的不饱和脂肪酸。其中一种含量丰富的特殊多不饱和脂肪酸——金松酸（20:3Δ5,11,14,SA）,具有很高的经济和药用价值。然而,香榧油脂和金松酸合成及调控的分子基础至今未被研究。本实验以10个地区和5个发育时期的香榧种仁为研究材料,利用转录组测序、生信分析,分子、生理、生化实验等手段对香榧油脂和金松酸合成通路以及调控其合成的关键基因进行分析,并对部分关键基因进行了初步的功能解析。得到主要结果如下:1.通过对10个地区及5个发育时期香榧种仁的转录组测序,鉴定了香榧油脂合成通路及金松酸的合成路径:通过对含油率及脂肪酸组分测定,发现不同地区香榧种仁的含油率存在很大差异,且随着香榧种仁的膨大,含油率不断升高。香榧中含有6种主要的不饱和脂肪酸,其中油酸和亚油酸含量最高;金松酸含量次之,最高可以达到53 mg.g-1。2.通过进化树分析和氨基酸序列比对,分别筛选并克隆出香榧油体蛋白Oleosin,Caleosin 和 Steroleosin 的编码基因TgOLEO1,TgCLO1 和TgSLO1,产物大小分别为414bp,699bp和1017bp。烟草叶片瞬时表达的荧光定位结果表明,TgOLECO1-GFP,TgCLO1-GFP和TgSLOl-GFP蛋白均定位于内质网和油体中,且过表达这些蛋白均能够改变油体的数目,其中,TgSLO1-GFP蛋白能改变油体的大小。3.通过进化树分析和氨基酸序列比对,筛选并克隆出金松酸合成的两个关键酶,Δ9脂肪酸延长酶（Δ9 fatty acid elongase）和Δ5脂肪酸去饱和酶（Δ5 fatty acid desaturase）的编码基因TgELO1和TgDES1,产物大小为分别为846bp和1242bp。烟草叶片瞬时表达的荧光定位结果表明,TgELOl-GFP和TgDES1-GFP蛋白均定位于内质网中。转基因拟南芥叶片的脂肪酸测定结果表明,Δ9脂肪酸延长酶和Δ5脂肪酸去饱和酶能够分别以亚油酸和二十碳二烯酸为底物促进金松酸的合成。
甘露[8]（2019）在《草地早熟禾矮化突变体的遗传差异分析及DXS1基因功能研究》文中认为草地早熟禾（Poapratensis L.）作为温带地区应用最广泛的草坪草之一,具有抗寒、耐旱、绿色期长、坪观质量高等特点,但需要频繁修剪以维持较高的草坪质量。空间环境中的诱变因子能诱发植物种子产生不定向变异,可能会获得符合育种方向的优良性状。本研究中的草地早熟禾种子经过太空飞行后返回地面种植的后代植株中发现有株高降低、叶色变深等外观质量较好的的变异株系,符合草坪草优良品种的选育方向。本文以空间诱变草地早熟禾M4代的矮化突变体（dwarf mutant,A16）和野生型（wildtype,WT）为研究材料,比较两者在细胞遗传、生理表型、分子表达水平方面的差异,以及对调控植物生长发育的脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因（DXS1）及其启动子进行功能研究,进而了解空间诱变矮化突变体的变异情况和空间诱变对相关基因的影响情况,既对培育草地早熟禾矮化品种具有指导意义,也为更好地利用空间诱变进行植物育种做出贡献。研究结果如下:（1）A16与WT在细胞遗传水平上的差异:空间环境对草地早熟禾叶片组织细胞结构产生了较大的影响。WT叶片上表皮细胞狭长而稀,倾向于横向伸展;而A16上表皮细胞明显呈梭形,短宽而多,倾向于径向伸展,而且A16的叶片气孔分布更密、气孔更小。此外,A16与WT转录组测序发现了 4203个差异表达基因,而且InDel多态性分析侧面表明了A16与WT的基因组/转录组之间存在大量随机的插入/缺失突变,说明空间环境对草地早熟禾的遗传物质产生变异作用。（2）A16与WT在生理表型水平上的差异:在株高方面,矮化突变体的株高调控可能与调控植物萜类物质合成的DXS1基因的下调表达、赤霉素合成通路上的GA3ox4基因下调表达、生长素合成通路的FMO基因和PIN5输出蛋白等基因的下调表达有关,而且A16中的赤霉素和生长素含量均低于WT;在叶色方面,A16的叶绿素含量显着高于WT,且叶绿素a/b的比值比WT要低,叶色差异可能是由叶绿素合成基因UroS的上调表达以及降解基因CLH1基因的下调表达所造成的;在抗旱耐盐方面,综合胁迫处理后的生理生化的反应指标、内源ABA含量、抗逆相关基因的差异表达,A16的抗旱性比野生型WT强,耐盐性方面两者没有显着差异;在抗病性方面,虽然PR1L、NPR1L抗病相关基因在A16中的表达量在病原菌诱导前处于较低水平,但在病原菌侵染后,其转录水平均显着提高,且增幅显着大于WT,说明WT和A16在诱导抗病性方面存在差异。（3）DXS1基因在草地早熟禾中的功能研究表明:草地早熟禾DXS1（PpDXS1）基因含有一个2139 bp的ORF框,与山羊草（Aegilops tauschili）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon）的DXS1蛋白的最为相似,且属于DXS基因家族的第一族;PpDXS1基因在草地早熟禾的叶片、叶鞘和根中均有表达,其中叶片中的表达量最高;GA3、ABA、JA和病原菌侵染的外施处理均能提高PpDXS1基因的表达。此外,PpDXS1在草地早熟禾中的反义表达使得转基因株系的株高、GAs和IAA含量显着降低,而ABA和叶绿素含量在某些株系（antiDXS1-102）中是增加的,随后对antiDXS1-102转基因株系和转空载的对照植株（CK）进行转录组分析,结果表明与CK相比,与IPP/GGPP合成、GA和IAA生物合成和信号传递以及叶绿素相关的降解基因在antiDXS1-102植株中下调表达,而叶绿素和ABA的生物合成相关基因的表达上调,这与激素含量测定结果一致。（4）A16与WT的DXS1基因启动子序列的比较分析发现A16的PpDXS1基因的启动子区域存在一个715bp的插入片段和一个500bp的缺失片段,推测空间环境诱导DXS1基因启动子区发生插入/缺失突变;启动子在双荧光素酶报告系统及在转基因表达的草地早熟禾中的活性分析表明A16的PpDXS1启动子序列的相对活性是低于WT的,且活性降低是由在A16中缺失的片段所造成的;而且与缺失区域G-box元件结合的G-box结合因子（G-box binding factor 1,GBF1）对启动子活性具有转录激活作用,在过表达GBF1基因的转基因草地早熟禾中PpDXS1基因的转录水平显着提高。因此,我们推测在A16的PpDXS1启动子区缺失的部分含有的G-box元件以及与之结合的GBF1蛋白的转录激活功能可能是A16的DXS1基因启动子活性降低的原因,也是被启动子调控的DXS1基因表达水平降低的原因。综上所述,空间诱变在细胞遗传、生理表型、分子表达等水平对草地早熟禾均产生了较大影响,包括株高、叶色、生理抗性、基因表达等方面;而且空间环境通过诱发PpDXS1基因启动子发生插入/缺失突变来影响其基因表达,进而调控了植物整个生长发育过程。
胡波[9]（2019）在《甜菜夜蛾细胞色素P450和谷胱甘肽-S-转移酶基因的转录调控机制》文中提出细胞色素P450和谷胱甘肽-S转移酶具有代谢不同结构杀虫剂的能力,由P450和GST介导的代谢抗性在昆虫对各类杀虫剂抗性中普遍存在。前期的解毒酶活性测定和增效剂生物测定表明甜菜夜蛾对多种杀虫剂的抗性与P450以及GST解毒能力增强有关。但抗性品系中代谢抗性的分子机理仍不清楚,是哪些解毒基因介导了杀虫剂抗性及这些基因上调表达的调控机制也是未解之谜。本研究试图挖掘出甜菜夜蛾涉及抗药性的P450基因与GST基因,并进一步解析抗药性相关基因组成型高表达与诱导表达的调控机理。研究结果将增进人们对害虫抗药性机制的理解,为研究开发抗药性治理新技术提供新的理论指导。在本研究中,我们通过基因信息分析与克隆确定了甜菜夜蛾P450和GST的基因家族,分析了这些基因在杀虫剂胁迫下的诱导表达规律,并进一步揭示了解毒酶共诱导表达上调的调控机制;通过比较抗性种群与敏感种群间解毒基因的表达差异,找出在抗性种群中组成型高表达的P450基因,对其中表达水平最高的4种P450基因通过构建转基因果蝇进行了抗药性功能验证,并进一步通过真核表达分析其对杀虫剂的代谢活性,对其中2个P450基因的组成型上调表达机制开展了深入的研究,揭示了 P450基因在转录水平上多因素调控机理,具体结果如下:1、多数甜菜夜蛾P450基因能被杀虫剂所诱导通过克隆得到了甜菜夜蛾的68个P450基因,这些基因分属于25个家族、40个亚家族。系统进化分析显示甜菜夜蛾P450家族中属CYP2 clan和线粒体clan的成员较少,而属CYP3 clan和CYP4 clan的基因成员数量较多。同时,分析了杀虫剂处理后的基因表达响应,茚虫威、氰氟虫腙、氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯和阿维菌素分别处理甜菜夜蛾脂肪体细胞后,有50个P450基因至少对其中某一种杀虫剂的胁迫会产生表达变化的响应,其中有4个基因（CYP6AE47、CYP6AB31、CYP9A9和CYP9A10）对5种杀虫剂胁迫均有表达水平的显着上调。CYP321A8在茚虫威、氰氟虫腙、氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯诱导中显着性上调,而在阿维菌素处理后显着性下调。CYP321A9、CYP6AE10和CYP321A16对茚虫威、氰氟虫腙、氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯诱导有显着性上调变化,对阿维菌素胁迫下没有显着性变化。在本研究使用的5种杀虫剂中,甜菜夜蛾P450基因表达对阿维菌素胁迫的响应明显不同于对其他4种杀虫剂的响应,而对茚虫威、氰氟虫腙、氯虫苯甲酰胺和高效氯氟氰菊酯胁迫响应的模式基本类似。2、多个甜菜夜蛾P450基因参与杀虫剂抗药性由P450介导的代谢抗性机制在昆虫对各类杀虫剂抗性中普遍存在,先前的研究表明甜菜夜蛾对多种杀虫剂的抗性与P450解毒能力增强有关。在本研究中抗性种群P450酶活性是敏感种群的2.9倍。P450抑制剂PBO显着增加了抗性种群对毒死蜱的敏感性,增效8.1倍,同时增加了拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感。定量PCR分析表明该抗性种群有21个P450基因的表达水平较敏感种群上调2倍以上（p<0.05）,这些过表达的P450主要来源于CYP6、CYP9和CYP321家族。对其中表达水平提高最多的几个P450基因与抗药性的关系,采用2种技术进行了功能验证。首先是采用UAS/GALA二元表达系统构建表达甜菜夜蛾P450基因的转基因果蝇系,对转基因果蝇的生物测定表明,分别过表达CYP321A8、CYP321A16、CYP6AE70和CYP332A1的转基因果蝇系表现出对毒死蜱、氯氰菊酯和溴氰菊酯耐受性的显着提高,说明这4个基因的过表达提高了果蝇对这3种杀虫剂的解毒能力,可导致对这些药剂的代谢抗性。其二是利用杆状病毒表达系统对CYP321A8、CYP321A16、CYP6AE70、CYP332A1和CYP321B1进行了真核表达,体外重组蛋白具有对毒死蜱、氯氰菊酯以及溴氰菊酯的代谢能力,并进一步比较分析了这5个重组蛋白对毒死蜱的代谢动力学特性,结果显示它们均对毒死蜱都有一定的代谢活性,其中以CYP321A8和CYP321B1对毒死蜱的代谢活性最强,而CYP6AE70对毒死蜱的代谢活性相对较低。综合这些研究结果,CYP321A8、CYP321A16、CYP332A1、CYP6AE70 和 CYP321B1的组成型高表达是甜菜夜蛾对毒死蜱以及氯氰菊酯和溴氰菊酯代谢抗性的重要机制。3、顺式作用元件和反式作用因子协同调控CYP321A8和CYP321B1的组成型高表达前期的研究中发现在抗性种群中过量表达的CYP321A8和CYP321B1可以使甜菜夜蛾对毒死蜱、氯氰菊酯以及溴氰菊酯产生抗药性,然而其过量表达的调控机制尚不清楚。我们克隆了 CYP321A8和CYP321B1的上游启动子序列,并发现在这两个上游序列上存在多个转录因子结合位点。进一步分析相关转录因子在抗敏种群中的相对表达水平,结果显示抗性种群中的CncC和Maf mRNA水平分别上调5.2倍和2.8倍。荧光报告试验证实过表达的CncC和Maf可以调控CYP321A8和CYP321B1在抗性种群中的组成型高表达,同时也发现CYP321A8上游序列存在近端和远端两个有效的CncC/Maf结合位点,CYP321B1仅近端结合位点起作用。同时我们比较了抗性和敏感种群间CYP321A8和CYP321B1基因上游调控序列的差异,发现CYP321A8和CYP321B1的上游启动子区均存在多处碱基差异。荧光报告活性分析显示来自抗性种群的CYP321A8与CYP321B1上游序列启动子活性分别是敏感种群的10.4倍与1.95倍,说明抗性种群中启动子高活性也是CYP321A8和CYP321B1高表达的原因。我们还对造成抗性/敏感启动子活性差异的序列区段进行了定位,CYP321A8的启动子活性差异序列定位在-385～-142之间,CYP321B1在-258～-210之间。对该区间的碱基序列突变后再进行荧光报告活性分析,结果显示-385～-142之间M5处点突变是导致抗性CYP321A8启动子具有高活性的原因,进一步的预测发现M5处的突变位于转录因子Knirps顺式元件中,将Knirps与报告质粒共转染证明Knirps可显着上调抗性质粒P（-385/-1）-R的荧光活性,而对敏感质粒P（-385/-1）-S荧光活性没有显着性影响。这些结果表明抗性种群中CYP321A8的启动子区产生了招募转录因子Knirps的突变（M5处）,增强了 CYP321A8在抗性品系中的过表达,而敏感种群不能招募该因子,所以表达水平低。同样对CYP321B1启动子的-258～-210区间转录活性进行了比较分析,证明M2处的突变是导致抗性种群CYP321B1启动子高活性的原因。最后通过报告质粒与转录因子的共转染揭示顺式元件和反式作用因子的协同调控才是CYP321A8与CYP321B1基因在抗性种群中高表达的内在原因。4、杀虫剂通过ROS激活的CncC/Maf途径诱导GST基因的共上调表达GSTs是一类广泛分布于生物体的多功能解毒酶系,参与亲电性有毒化合物的解毒。尽管不同类型的杀虫剂诱导多个GST基因共上调表达的报道很多,但是其潜在的调控机制尚不清楚。本研究中克隆鉴定了甜菜夜蛾的31个GST基因,通过定量PCR分析了这些GST基因在甜菜夜蛾幼虫中的组织表达模式以及在杀虫剂诱导下的基因表达模式。在高效氯氟氰菊酯、毒死蜱和氯虫苯甲酰胺的胁迫下有7个GST 基因（SeGSTe9、SeGSTs6、SeGSTe1、SeGSTe6、SeGSTe8、SeGSTe14 和 SeGSTd1）均显着上调表达,暗示不同杀虫剂可能会通过类似机理介导同一 GST基因的上调表达,以及不同GST基因可通过类似机理被同一药剂所诱导。通过基因组步移的方法克隆到这7个GST基因上游约1500 bp长的启动子序列,对这些上游序列进行转录因子结合位点的预测分析发现这7个GST基因上游序列均含有CncC/Maf结合位点。进一步通过荧光报告质粒分析该位点介导的转录是否受杀虫剂胁迫的影响,将pGL3-SeGST启动子质粒转染到Sf9细胞后,杀虫剂处理能使荧光活性显着增加,将该启动子区的CncC/Maf结合位点突变后,杀虫剂处理的诱导效果显着下降。这些结果表明甜菜夜蛾利用CncC/Maf途径来响应不同杀虫剂胁迫,并诱导GST基因的表达。杀虫剂处理后细胞内活性氧显着升高,活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理可以降低杀虫剂对报告质粒pGL3-SeGST的荧光诱导活性,但不能降低杀虫剂对CncC/Maf结合位点突变体的诱导效应,说明活性氧通过CncC/Maf介导杀虫剂胁迫,从而影响GST基因的表达。以上结果表明不同类型杀虫剂可以通过ROS激活的CncC/Maf途径诱导GST基因的共上调表达。
陈才[10]（2019）在《猪转座组注释、活性分析及其对基因组、转录组和功能基因的影响》文中指出近几十年来,大量生物基因组注释研究表明,转座元件（Transposableelements,TEs）或转座子（Transposons）及其可识别的残余成分,也称为转座组（mobilome）,在原核生物和真核生物中广泛分布,对生物的基因组和基因进化发挥重要作用,转座子已成为后基因组时代的研究热点。但关于猪基因组中转座成份的注释还比较粗略,遗漏了大量信息,缺乏对猪转座组的多样性、进化、转录和转座活性及其对功能基因影响等信息的系统解读。同时转座子插入多态分子标记在猪等家畜中研究报道很少,其研究的深度和广度还远不及人类、小鼠和植物。基于此,本论文主要开展了以下研究工作:1.使用多个软件重新挖掘猪基因组中的反转录转座子,并进行了系统分类、进化动力学和插入年龄分析,构建了新的猪重复序列数据库;2.利用新构建的猪重复序列数据库,对猪基因组和转录组进行重新注释,揭示其对基因组和转录组的影响;3.根据RepeatMasker注释结果,探究了转座组对宿主基因（蛋白质编码基因和lncRNA基因）的影响;4.对年轻反转录转座子进行了转录活性、启动子活性和转座活性检测研究;5.以SINE为例,系统解析了转座子插入多态对基因外显子结构变异的影响;6.以生长发育重要候选功能基因GHR为例,系统研究了转座子插入多态对其结构变异的影响及其与表型的关联性。主要结果如下:1.从猪基因组中共鉴定到5937条L1序列,分为四个家族（L1A、L1B、L1C和L1D）,53个亚家族。分析表明猪L1具有典型的哺乳动物L1的结构（5’UTR、ORF1、IGR、ORF2和3’UTR）,总长度在5837bp到8822bp之间,5’UTR的长度变异较大,在551bp到3254bp之间,大多亚家族的IGR较长（390bp到529bp）。两个ORF比较保守,分别为900bp左右和3800 bp左右。四个家族呈现出不同的进化模式,每一个家族主导一个特定时期的进化活动,结合年龄分析表明,它们较其他LINE年轻,L1D是最年轻的一个家族,L1D1-7代表了最年轻的七个L1D亚家族。在L1D家族中共鉴定到98条结构完整的L1拷贝,含能够编码L1蛋白的两个ORF,可能具有转座活性。2.根据SINE序列的长度、相似性及结构特征,将其分成三个家族（SINEA、SINEB和SINEC）,25个亚家族,均属于tRNA起源。三个SINE家族的长度差异明显,SINEA的长度在250 bp左右（不含polyA尾）,而SINEB和SINEC相对短一些,分别为200 5p左右和120 bp左右。在基因组进化过程中,SINE呈现出三个扩增波,每个扩增波对应一类SINE转座子家族。年龄分析表明SINEA是最年轻的家族,其中SINEA1、SINEA2、SINEA3代表最年轻的三个SINE亚家族。3.ERV是LTR类反转录转座子的主要成员,分为18个家族,大多数ERV家族相对较为古老且已失去转座活性,长度大多分布在8.5kb到11 kb之间。而ERV6在近1000万年仍然比较活跃,插入年龄分析表明,ERV6是最年轻的家族,被进一步分为两个亚家族（ERV6A和ERV6B）,各包含1个能编码含gag、pol和env的长肽的拷贝,可能具有转座活性。4.转座组注释结果表明,反转录转座子占基因组的37.13%（929.09MB）,其中LINE、LTR和SINE分别占基因组的18.52%、7.56%和11.05%。DNA转座子相对而言非常少,仅占基因组的1.99%。最年轻的七个L1亚家族（L1D1-7）只占基因组的0.17%。最年轻的三个SINE亚家族（SINEA1-3）仅占0.63%,而其中最年轻的两个ERV亚家族（ERV6A和ERV6B）仅占基因组的0.02%。5.通过生物信息分析,超过80%的蛋白编码基因和1ncRNA基因含有转座子的插入,约一半的蛋白编码基因（44.30%）和四分之一（24.13%）的1ncRNA基因含有年轻反转录转座子的插入,并且约一半的蛋白编码基因（43.78%）与反转录转座子产生融合转录本。进一步分析发现,反转录转座子在蛋白编码基因和1ncRNA基因及其他们的转录本中的含量、插入位置和插入方向存在明显的偏好性。6.通过反转录转座活性实验验证了猪基因组中年轻L1具有转座活性。实验证明无论以自身的5’UTR作为启动子还是替换为CMV启动子,都能够在HeLa细胞中发生反转录转座,但转座活性显着低于人的L1（p<0.01）。当把猪L1的IGR替换为人L1的IGR时,猪L1的转座活性显着提高（p<0.05）。7.通过双荧光素酶报告系统证实,来自L1D1、L1D2和L1D7的三条正向5’UTR和一条来自L1D2的反向5’UTR在不同细胞系中检测到弱启动子活性。ERV6B的正向LTR呈现出较高的启动子活性,而ERV6A的正向LTR和ERV6B的反向LTR呈现出中等启动子活性,ERV6A的反向LTR在本次研究中未检测到启动子活性。8.三类年轻反转录转座子在多个组织和细胞系中均检测到正反向转录产物。在除生殖器官外的各组织和细胞系中呈现出相似的转录模式并且均有反向转录产物,而在生殖器官中呈现出不同的转录模式,在睾丸中L1的ORF1、ORF2,ERV的gag、pol和env的正向转录以及ERV的LTR的反向转录受到抑制,但可以清楚的检测到L1的5’UTR的反向转录产物。另外,SINE在卵巢中正反向均检测到转录,但在睾丸中却未检测到转录。在大脑和小脑中观察到较高的ERV6-LTR的反向转录水平。9.SINEA、SINEB和SINEC三个家族在基因组中的插入位点总数为1204691个,其中在基因的外显子区共鉴定到24024个插入位点,其中在编码区（CDS）共鉴定到792个,非编码区23232个,对应约30%的基因。通过比较不同年龄的SINE插入位点多态频率,发现越年轻的SINE亚家族,多态频率越高。对外显子区最年轻的三个亚家族（SINEA1-3）插入位点进行全面比对分析和实验验证,最终筛选出151个多态位点,多分布在非编码区。10.GHR基因及其侧翼区的转座子注解后发现含有155个转座子插入,绝大部分为反转录转座子（152/98.06%）,对应25.63%的序列。其中SINE类转座子最多,有74个,而其中68个来自最年轻的家族SINEA,对应5.64%的序列。对获取的15条来自不同品种基因组的GHR基因及侧翼序列比对后发现34个长度超过50 bp的结构变异,且全部为转座子插入多态引起。选取部分转座子引起的结构变异位点进行实验验证,获得5个转座子插入多态位点,其中1个在大白群体中检测后发现纯合转座子插入基因型（SINE+/+）的个体的校正背膘厚显着小于纯合无插入基因型（SINE-/-）的个体。研究对猪基因组中转座成份进行了系统的挖掘、分类、进化分析、活性分析和注解,并系统评估了转座组对基因组、转录组和功能基因的影响,并进行了分子标记挖掘及应用评估,研究结果为更加全面、深刻的认识和理解猪转座组提供了实验依据和理论基础,并为开发猪基因组新型分子标记,进行重要经济性状的精细定位提供参考。
二、Existence of homologous sequences corresponding to cDNA of the ver gene in diverse higher plant species（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Existence of homologous sequences corresponding to cDNA of the ver gene in diverse higher plant species（论文提纲范文）
（1）沙葱萤叶甲成虫夏滞育调控的分子机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 沙葱萤叶甲研究概况 |
| 1.2 滞育研究概况 |
| 1.2.1 滞育简介 |
| 1.2.2 滞育的调控机制 |
| 1.2.3 保幼激素通路关键基因 |
| 1.2.4 保幼激素对滞育的调控 |
| 1.3 组学技术 |
| 1.3.1 蛋白组学概述 |
| 1.3.2 蛋白组学在昆虫滞育研究中的应用 |
| 1.3.3 转录组学概述 |
| 1.3.4 转录组学在昆虫滞育研究中的应用 |
| 1.4 RNAi干扰技术 |
| 1.4.1 RNAi的概述 |
| 1.4.2 RNAi在昆虫学研究中的应用进展 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 1.5.1 目的及意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 2 沙葱萤叶甲成虫夏滞育的蛋白质组学研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 样品制备 |
| 2.1.3 蛋白质消化和TMT标记 |
| 2.1.4 高PH反向分离 |
| 2.1.5 低PH nano-HPLC-MS/MS分析 |
| 2.1.6 数据库搜索 |
| 2.1.7 蛋白质鉴定与定量 |
| 2.1.8 生物信息学分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 定性质控分析 |
| 2.2.2 蛋白质i TRAQ鉴定 |
| 2.2.3 差异表达蛋白定量 |
| 2.2.4 差异蛋白GO分析 |
| 2.2.5 差异蛋白KEGG分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 吞噬体通路 |
| 2.3.2 代谢变化 |
| 2.3.3 保幼激素 |
| 2.3.4 胁迫反应 |
| 2.3.5 Ca~(2+)信号传导 |
| 2.3.6 细胞骨架重组 |
| 2.3.7 核糖体蛋白 |
| 2.3.8 化学感受蛋白 |
| 3 烯虫酯处理沙葱萤叶甲转录组学分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.1.3 主要溶液配制方法 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 保幼激素类似物处理 |
| 3.2.2 转录组测序 |
| 3.2.3 qPCR验证 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 转录组测序及de novo组装 |
| 3.3.2 Unigenes功能注释 |
| 3.3.3 差异表达基因分析 |
| 3.3.4 差异表达基因的qPCR验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 能量代谢变化 |
| 3.4.2 生物合成通路 |
| 3.4.3 胁迫反应 |
| 3.4.4 信号传导通路 |
| 4 JH信号通路相关基因的鉴定及表达模式分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 供试昆虫 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 总RNA提取 |
| 4.2.2 第一链cDNA合成 |
| 4.2.3 基因鉴定 |
| 4.2.4 生物信息学分析 |
| 4.2.5 实时荧光定量PCR |
| 4.2.6 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 Met序列及表达模式分析 |
| 4.3.2 JHE序列及表达模式分析 |
| 4.3.3 FOXO序列及表达模式分析 |
| 4.3.4 Vg序列及表达模式分析 |
| 4.3.5 JHAMT序列及表达模式分析 |
| 4.3.6 Kr-h1 序列及表达模式分析 |
| 4.3.7 JHEH序列及表达模式分析 |
| 4.3.8 FAS序列及表达模式分析 |
| 4.4 讨论 |
| 5 烯虫酯对沙葱萤叶甲JH信号通路相关基因及滞育的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 供试昆虫 |
| 5.1.2 主要试剂及仪器 |
| 5.1.3 主要溶液配制方法 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 保幼激素类似物处理 |
| 5.2.2 总RNA提取 |
| 5.2.3 第一链cDNA合成 |
| 5.2.4 引物设计及合成 |
| 5.2.5 实时荧光定量PCR |
| 5.2.6 JHA处理后脂肪含量的测定 |
| 5.2.7 JHA处理后对滞育情况的观察 |
| 5.2.8 数据分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 外源JHA对羽化3d沙葱萤叶甲JH信号通路相关基因的影响 |
| 5.3.2 外源JHA对羽化5d沙葱萤叶甲JH信号通路相关基因的影响 |
| 5.3.3 外源JHA对羽化15d沙葱萤叶甲JH信号通路相关基因的影响 |
| 5.3.4 外源JHA对沙葱萤叶甲总脂含量的影响 |
| 5.3.5 外源JHA对沙葱萤叶甲成虫滞育的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 6 RNAi介导沙葱萤叶甲GdMet基因功能研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 供试昆虫 |
| 6.1.2 主要试剂及仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 dsRNA合成 |
| 6.2.2 dsRNA体外注射 |
| 6.2.3 沉默效率检测 |
| 6.2.4 沉默GdMet后 JH通路相关基因的表达 |
| 6.2.5 沉默GdMet后脂肪含量测定 |
| 6.2.6 沉默GdMet后脂肪体的观察 |
| 6.2.7 沉默GdMet后滞育情况的观察 |
| 6.2.8 数据分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 dsRNA的合成 |
| 6.3.2 GdMet基因的沉默效率 |
| 6.3.3 沉默GdMet对 JH通路相关基因表达的影响 |
| 6.3.4 沉默GdMet对沙葱萤叶甲总脂含量的影响 |
| 6.3.5 沉默GdMet对沙葱萤叶甲滞育的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 7 沙葱萤叶甲己糖激酶基因Gd HK的克隆及表达分析 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 供试虫源 |
| 7.1.2 主要试剂及仪器 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 沙葱萤叶甲己糖激酶基因cDNA全长的克隆 |
| 7.2.2 沙葱萤叶甲己糖激酶基因的生物信息学分析 |
| 7.2.3 不同发育阶段沙葱萤叶甲己糖激酶基因的表达 |
| 7.2.4 不同温度下沙葱萤叶甲己糖激酶基因的表达 |
| 7.2.5 数据分析 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 沙葱萤叶甲己糖激酶基因的克隆及序列分析 |
| 7.3.2 沙葱萤叶甲己糖激酶的序列比对 |
| 7.3.3 沙葱萤叶甲己糖激酶的系统进化分析 |
| 7.3.4 不同发育阶段中沙葱萤叶甲己糖激酶基因的表达 |
| 7.3.5 不同温度下沙葱萤叶甲己糖激酶基因的表达 |
| 7.4 讨论 |
| 8 沙葱萤叶甲核糖体蛋白基因GdRpS3a的克隆及表达分析 |
| 8.1 材料 |
| 8.1.1 供试虫源 |
| 8.1.2 主要试剂及仪器 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 沙葱萤叶甲RpS3a基因cDNA全长的克隆 |
| 8.2.2 沙葱萤叶甲RpS3a基因的生物信息学分析 |
| 8.2.3 沙葱萤叶甲RpS3a基因的表达谱分析 |
| 8.2.4 数据分析 |
| 8.3 结果与分析 |
| 8.3.1 沙葱萤叶甲RpS3a的 cDNA全长克隆及序列分析 |
| 8.3.2 沙葱萤叶甲GdRpS3a的同源序列对比及系统进化分析 |
| 8.3.3 沙葱萤叶甲RpS3a在不同发育阶段的表达模式 |
| 8.3.4 不同温度下沙葱萤叶甲RpS3a的表达模式 |
| 8.4 讨论 |
| 9 全文总结 |
| 9.1 主要结论 |
| 9.2 创新点 |
| 9.3 研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（2）梨棕榈酰基转移酶基因家族鉴定及PbPAT14功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 1 研究背景和意义 |
| 2 梨矮化砧木的选育及应用 |
| 2.1 梨异属矮化砧木 |
| 2.2 梨属矮化砧木 |
| 3 砧木矮化机理研究进展 |
| 3.1 矮化砧木激素代谢特征 |
| 3.2 矮化砧木致矮相关的遗传标记 |
| 3.3 存在的问题及展望 |
| 4 蛋白质棕榈酰化修饰研究进展 |
| 4.1 蛋白质的翻译后修饰 |
| 4.2 蛋白质棕榈酰化修饰 |
| 4.3 蛋白质棕榈酰化修饰在植物中的作用 |
| 4.4 棕榈酰基转移酶 |
| 4.5 植物中的棕榈酰基转移酶 |
| 4.6 棕榈酰基转移酶表达模式研究 |
| 4.7 棕榈酰基转移酶修饰底物的鉴定 |
| 4.8 蛋白质的去棕榈酰化 |
| 4.9 研究植物棕榈酰基转移酶及其底物的方法 |
| 5 基因编辑技术研究进展 |
| 5.1 常用的基因编辑技术 |
| 5.2 CRISPR/Cas9系统的发现与建立 |
| 5.3 CRISPR/Cas9系统在植物中的应用范围及作用机理 |
| 5.4 CRISPR/Cas9技术在果树育种中的应用 |
| 5.5 CRISPR/Cas9基因编辑靶点分析方法 |
| 5.6 CRISPR/Cas9系统存在的问题及发展方向 |
| 第一章 梨棕榈酰基转移酶基因家族鉴定及分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 数据库信息 |
| 1.2 梨PbDHHC基因家族的鉴定 |
| 1.3 梨PbDHHCs基因结构分析和蛋白结构域预测 |
| 1.4 梨PbDHHCs基因染色体定位和共线性分析 |
| 1.5 梨PbDHHCs同源进化分析和DHHC结构域保守序列分析 |
| 1.6 梨PbDHHCs基因启动子顺式作用元件和表达模式分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 梨PbDHHC基因家族鉴定 |
| 2.2 梨PbDHHCs基因染色体定位及共线性分析 |
| 2.3 梨PbDHHCs与其他物种DHHC基因同源进化关系 |
| 2.4 梨PbDHHCs基因结构及蛋白结构域分析 |
| 2.5 梨PbDHHCs基因启动子及表达模式分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 梨PbPAT14基因克隆及酶活性验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 杜梨组织总RNA提取方法 |
| 1.4 杜梨总RNA质量检测 |
| 1.5 cDNA反转录合成 |
| 1.6 梨中PbPAT14鉴定及基因克隆 |
| 1.7 Gateway系统入门载体及表达载体构建 |
| 1.8 酵母和拟南芥转化及阳性筛选 |
| 1.9 梨PbPAT14酶活性及自身棕榈酰化功能验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 杜梨总RNA质量检测 |
| 2.2 梨PbPAT14鉴定及酶活性验证 |
| 2.3 梨PbPAT14棕榈酰化功能位点验证 |
| 2.4 梨PbPAT14自身棕榈酰化修饰功能验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 杜梨遗传转化及突变体验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 杜梨基因组DNA的提取 |
| 1.4 梨PbPAT14基因靶点选择 |
| 1.5 CRISPR/Cas9载体构建及验证 |
| 1.6 杜梨组培苗对潮霉素的敏感试验 |
| 1.7 农杆菌介导的杜梨遗传转化 |
| 1.8 杜梨PbPAT14基因编辑效果检测 |
| 1.9 脱靶位点检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 梨PbPAT14基因靶点选择 |
| 2.2 基因编辑载体构建 |
| 2.3 潮霉素对杜梨组培苗致死浓度筛选 |
| 2.4 杜梨遗传转化 |
| 2.5 转基因植株阳性检测 |
| 2.6 转基因植株基因编辑效果检测 |
| 2.7 脱靶位点检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 杜梨PbPAT14功能缺失突变体矮生机理初探 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 植株生长指标测定 |
| 1.4 石蜡切片制作 |
| 1.5 激素测定 |
| 1.6 实时荧光定量PCR |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 杜梨突变体生长表型分析 |
| 2.2 杜梨突变体茎和叶片的微观结构观察 |
| 2.3 杜梨突变体内源激素含量测定及qRT PCR分析 |
| 2.4 梨PbPAT14蛋白修饰底物筛选及分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）黄瓜CsATG8c和CsATG8e基因的表达与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 植物自噬概述 |
| 1.1.1 植物自噬类型 |
| 1.1.2 自噬相关基因 |
| 1.1.3 植物自噬发生过程 |
| 1.2 植物自噬功能 |
| 1.2.1 自噬与植物生长发育 |
| 1.2.2 自噬与植物抗病 |
| 1.2.3 自噬与PCD |
| 1.2.4 自噬与非生物胁迫 |
| 1.3 植物自噬研究进展 |
| 1.3.1 植物分子调控机制进展 |
| 1.3.2 植物选择性自噬的研究进展 |
| 1.3.3 ATG8蛋白功能及研究近况 |
| 1.4 本研究的目的意义、研究内容与技术路线 |
| 1.4.1 本研究目的意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第2章 黄瓜中自噬基因的全基因组鉴定及分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 化学试剂和试剂盒 |
| 2.2.3 表达分析引物 |
| 2.2.4 营养液的配制 |
| 2.2.5 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 黄瓜自噬基因家族检索 |
| 2.3.2 黄瓜自噬基因家族染色体分布及结构分析 |
| 2.3.3 黄瓜自噬基因理化性质分析 |
| 2.3.4 黄瓜自噬家族蛋白序列比对及进化树构建 |
| 2.3.5 黄瓜自噬基因串联复制,与拟南芥共线性分析 |
| 2.3.6 黄瓜自噬蛋白家族成员的motif分析 |
| 2.3.7 黄瓜自噬蛋白的二级结构预测分析 |
| 2.3.8 黄瓜材料培养条件及胁迫处理 |
| 2.3.9 黄瓜总RNA提取,实时定量PCR |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 黄瓜自噬基因家族及理化性质分析 |
| 2.4.2 黄瓜自噬基因结构及系统发育分析 |
| 2.4.3 黄瓜与拟南芥ATG基因共线性分析 |
| 2.4.4 黄瓜ATG基因保守基序及同源基因对分析 |
| 2.4.5 黄瓜自噬基因家族染色体定位及二级结构预测分析 |
| 2.4.6 黄瓜ATG基因在SA与MeJA诱导下叶的表达分析 |
| 2.4.7 黄瓜ATG基因在高盐、干旱和碳饥饿处理根时的表达分析 |
| 2.4.8 黄瓜ATG基因在高盐、干旱和碳饥饿处理茎时的表达分析 |
| 2.4.9 黄瓜ATG基因在高盐、干旱和碳饥饿处理叶时的表达分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 黄瓜自噬基因家族生物信息学分析 |
| 2.5.2 黄瓜ATG基因受SA、MeJA诱导表达分析 |
| 2.5.3 黄瓜ATG基因在高盐、干旱处理下表达分析 |
| 2.5.4 黄瓜ATG基因在碳饥饿处理下表达分析 |
| 2.5.5 CsATG8c与CsATG8e基因在多种胁迫下的表达分析 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 黄瓜CsATG8c和CsATG8e的编码区全长序列的克隆及生物信息学分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料的培养 |
| 3.1.2 菌株 |
| 3.1.3 化学试剂和试剂盒 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 黄瓜总RNA的提取 |
| 3.2.2 基因扩增 |
| 3.2.3 CsATG8c和CsATG8e基因cDNA序列克隆 |
| 3.2.4 克隆产物序列测定及分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 黄瓜CsATG8c和CsATG8e基因克隆及质粒双酶切鉴定 |
| 3.3.2 黄瓜CsATG8c和CsATG8e基因测序及序列分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 黄瓜CsATG8c和CsATG8e基因表达载体的构建及转化拟南芥 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料的培养 |
| 4.1.2 载体和菌株 |
| 4.1.3 化学试剂和试剂盒 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 表达载体构建 |
| 4.2.2 重组质粒导入农杆菌 |
| 4.2.3 浸花法转化拟南芥 |
| 4.2.4 转化拟南芥株系的筛选 |
| 4.2.5 转基因拟南芥的PCR鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 黄瓜CsATG8c和CsATG8e表达载体的构建及双酶切验证 |
| 4.3.2 黄瓜pBI121-CsATG8c/CsATG8e农杆菌转化及验证 |
| 4.3.3 转基因拟南芥的PCR鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本论文的创新点和下一步工作 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间所发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）尾叶樱桃（Cerasus dielsiana）系统分类地位与种群生物地理学研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一章 研究背景与意义 |
| 1.1 樱属种质资与分类学研究进展 |
| 1.1.1 国内外樱属种质资源简介 |
| 1.1.2 樱属分类观点的发展与挑战 |
| 1.2 尾叶樱桃种质资源研究进展 |
| 1.2.1 尾叶樱桃的资源概况与分布格局 |
| 1.2.2 尾叶樱桃的人工繁育技术 |
| 1.2.3 尾叶樱桃的其它综合利用价值 |
| 1.3 应用分子标记技术的樱属植物研究进展 |
| 1.3.1 樱属指纹图谱构建与遗传多样性评估 |
| 1.3.2 樱属亲缘关系、系统进化与分类研究 |
| 1.3.3 小结与讨论 |
| 1.4 亲缘地理学的研究概述 |
| 1.4.1 亲缘地理学的概念 |
| 1.4.2 相关理论、标记手段与研究方法 |
| 1.4.3 亲缘地理学在我国森林植物中的研究进展 |
| 1.4.4 樱属亲缘地理学的研究进展 |
| 1.5 植物表型变异研究进展 |
| 1.6 生态位模型研究进展 |
| 1.7 本研究的科学问题及解决思路 |
| 1.7.1 尾叶樱桃研究存在的问题 |
| 1.7.2 研究目的和意义 |
| 1.7.3 技术路线示意图 |
| 第二章 基于标本与文献考证的尾叶樱桃分类学研究 |
| 2.1 尾叶樱桃分类史回顾 |
| 2.1.1 国外分类简史 |
| 2.1.2 模式标本海外分布 |
| 2.1.3 国内分类简史 |
| 2.2 分类学处理 |
| 2.2.1 尾叶樱桃后选模式标本指定 |
| 2.2.2 叶樱桃种系的分种检索表 |
| 第三章 基于叶绿体DNA序列的尾叶樱桃系统发育研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料来源与获取 |
| 3.1.2 基因组总DNA的提取与PCR扩增 |
| 3.1.3 序列处理分析 |
| 3.1.4 叶绿体RNA二级结构预测与自由能估算 |
| 3.2 研究结果 |
| 3.2.1 PCR结果与序列特征 |
| 3.2.2 单倍型分布与中介邻接网络图 |
| 3.2.3 系统发育关系的比较和分析 |
| 3.2.4 同源序列RNA二级结构模型预测与比较 |
| 第四章 基于叶表型性状的尾叶樱桃8个种群变异研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 气象和地理资料收集 |
| 4.1.2 材料来源与样品处理 |
| 4.1.3 叶表型性状的选取与测量 |
| 4.1.4 数据统计分析方法 |
| 4.2 研究结果 |
| 4.2.1 叶表型性状变异特征 |
| 4.2.2 叶表型变异来源及种群间性状分化 |
| 4.2.3 叶表型性状的主成分分析 |
| 4.2.4 叶表型性状与地理、气候因子间的相关性 |
| 4.2.5 基于叶表型性状和地理气候因子的主坐标分析与聚类分析 |
| 第五章 基于核DNA序列的尾叶樱桃亲缘地理学研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料来源与获取 |
| 5.1.2 试剂与仪器 |
| 5.1.3 实验方法 |
| 5.1.4 数据处理与分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 基于nrITS序列变异的种群遗传多样性分析 |
| 5.2.2 核糖体分型网状分支与系统发育重建(Network和 N-J树分析) |
| 5.2.3 基因流与分子变异的空间格局分析(Heatmap、SAMOVA与空间差值分析) |
| 5.2.4 种群分化与地理隔离分析(AMOVA、Mental和 Barrier分析) |
| 5.2.5 种群历史动态检测(MDS和 Neutrality test分析) |
| 5.2.6 物种分歧时间估算(BEAST分析) |
| 5.2.7 古今气候重建与比较(Max Ent分析) |
| 5.2.8 祖先分布区重建(RASP分析) |
| 第六章 基于生态位模型的尾叶樱桃现代地理分布模拟 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 分布数据获取及地图绘制 |
| 6.1.2 气候数据来源 |
| 6.1.3 地图资料来源 |
| 6.1.4 模型操作与精度检验 |
| 6.1.5 主导气候因子筛选和处理 |
| 6.2 研究结果 |
| 6.2.1 模型运行的评价 |
| 6.2.2 尾叶樱桃当代潜在分布区的模拟 |
| 6.2.3 主导气候因子的筛选以及适宜分布范围 |
| 6.2.4 最大限制因子的分析及其环境解释 |
| 6.2.5 亚热带其它物种的生态位需求比较 |
| 第七章 分析与讨论 |
| 7.1 尾叶樱桃种系的分类地位与相关异名的处理 |
| 7.1.1 长柱尾叶樱桃的种下分类地位 |
| 7.1.2 磐安樱桃与浙闽樱桃的分类地位 |
| 7.1.3 短筒樱桃的分类地位 |
| 7.2 尾叶樱桃叶表型的地理变异分析 |
| 7.2.1 尾叶樱桃叶表型变异的多样性 |
| 7.2.2 尾叶樱桃叶表型变异的来源与分化程度 |
| 7.2.3 尾叶樱桃叶表型性状对地理、气候因子的响应 |
| 7.2.4 尾叶樱桃叶表型性状变异的适应性机制 |
| 7.3 尾叶樱桃种群遗传多样性与遗传结构分化 |
| 7.4 尾叶樱桃冰期避难所及谱系时空演化的模式推论 |
| 7.5 尾叶樱桃潜在分布的生态适应性机制 |
| 7.5.1 模型评估与解释 |
| 7.5.2 分布格局的气候评估 |
| 7.5.3 我国亚热带植物生态位可塑性 |
| 7.6 尾叶樱桃种质资源保护与开发利用策略的指定 |
| 第八章 结论及展望 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 未来展望 |
| 8.2.1 选用新型的标记手段和数据处理方法 |
| 8.2.2 采用多维生态位定量分析 |
| 8.2.3 继续开展樱属核心种质资源的搜集与研究 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与科研成果 |
| 参考文献 |
| 附件1 广义李属下的樱属及其近缘属间的系统发育关系 |
| 附件2 供尾叶樱桃预实验的DNA条码筛选与PCR体系 |
| 附件3 尾叶樱桃种群间的基因流与遗传分化 |
| 附件4 尾叶樱桃地理分布的气候评价指标 |
| 附件5 尾叶樱桃野生种群生境现状 |
| 附件6 尾叶樱桃采集的标本部分扫描 |
| 附件7 个人简介 |
| 附件8 导师简介 |
（5）罗汉果叶绿体基因组组装分析及葫芦二烯醇合酶基因转录因子研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 罗汉果属资源研究进展 |
| 1.1 现有罗汉果属野生资源 |
| 1.2 罗汉果S.grosvenorii种质资源育种现状 |
| 1.3 叶绿体基因组在罗汉果物种鉴定的展望 |
| 2 罗汉果中甜苷合成通路研究进展 |
| 2.1 罗汉果甜苷类化合物 |
| 2.2 葫芦二烯醇研究进展 |
| 2.3 罗汉果甜苷合成途径 |
| 3 植物转录因子研究 |
| 3.1 转录因子的结构特征及分类 |
| 3.2 转录因子的研究方法 |
| 3.3 罗汉果中转录因子研究现状 |
| 4 植物基因启动子研究 |
| 4.1 启动子生物信息学预测及功能片段分析 |
| 4.2 响应外源植物激素的顺式作用元件 |
| 4.3 酵母单杂交及凝胶阻滞迁移实验 |
| 4.4 展望 |
| 5 本课题研究目的、内容及意义 |
| 5.1 研究目的及内容 |
| 5.2 拟解决的关键问题 |
| 5.3 本研究的意义 |
| 5.4 技术路线 |
| 第二章 罗汉果叶绿体基因组研究 |
| 1 实验试剂及仪器 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器耗材 |
| 2 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 植物基因组DNA提取 |
| 2.3 DNA测序 |
| 2.4 叶绿体基因组序列拼接及组装 |
| 2.5 叶绿体基因组基因注释及结构分析 |
| 2.6 叶绿体基因组密码子、重复序列及SSR分析 |
| 2.7 叶绿体基因组比较及选择压力分析 |
| 2.8 分子标记设计及验证 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 罗汉果属叶绿体基因组结构 |
| 3.2 IR/SC边界及IR的收缩和扩张 |
| 3.3 叶绿体基因组密码子使用分析 |
| 3.4 重复结构及SSRs分析 |
| 3.5 序列分歧及核苷酸多态性分析 |
| 3.6 葫芦科内物种叶绿体基因组聚类分析 |
| 3.7 进化选择压力分析 |
| 3.8 分子标记设计及验证结果分析 |
| 4 讨论与小结 |
| 第三章 外源植物激素对罗汉果甜苷合成途径的影响研究 |
| 1 所用试剂及仪器 |
| 1.1 主要试剂及生物试剂盒 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 外源植物激素刺激罗汉果叶及果 |
| 2.2 GC-MS和LC-MS检测化学成分含量及石蜡切片显微观察 |
| 2.3 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测合成途径关键酶基因表达量 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 外源激素处理罗汉果后化学成分含量分析以及显微观察结果 |
| 3.2 外源激素处理罗汉果后关键基因相对表达量分析 |
| 4 讨论与小结 |
| 第四章 酵母单杂交筛选与SgCDS启动子互作的转录因子 |
| 1 所用试剂及仪器 |
| 1.1 主要试剂及生物试剂盒 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 构建SgCDS基因高表达的cDNA质粒文库 |
| 2.2 SgCDS基因启动子序列的克隆及分析 |
| 2.3 构建酵母单杂交诱饵载体菌株 |
| 2.4 酵母单杂交筛选与诱饵序列CSPF2互作的转录因子 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 罗汉果SgCDS高表达的cDNA质粒文库建立 |
| 3.2 罗汉果SgCDS启动子克隆及功能分析 |
| 3.3 与SgCDS启动子互作的转录因子的筛选分析 |
| 4 讨论与小结 |
| 第五章 与SgCDS启动子互作的候选转录因子的研究 |
| 1 实验试剂耗材及仪器 |
| 1.1 实验试剂耗材及生物反应试剂盒 |
| 1.2 实验仪器设备 |
| 2 实验材料及方法 |
| 2.1 候选转录因子基因全长克隆及生物信息学分析 |
| 2.2 候选转录因子酵母单杂交回复验证 |
| 2.3 候选转录因子亚细胞定位验证 |
| 2.4 候选转录因子基因沉默和过表达验证 |
| 2.5 候选转录因子蛋白原核表达 |
| 2.6 候选转录因子与顺式元件互作验证 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 候选转录因子克隆及生物信息学预测分析 |
| 3.2 候选转录因子酵母单杂交回复验证 |
| 3.3 候选转录因子亚细胞定位验证结果 |
| 3.4 候选转录因子基因沉默与过表达 |
| 3.5 候选转录因子原核表达与EMSA验证 |
| 4 讨论与小结 |
| 第六章 结论、展望及创新点 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附录 |
（6）烟草NtVQ35基因的鉴定及其抗青枯病基本功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 烟草青枯病研究概述 |
| 1.1.1 烟草青枯病的发现和分布 |
| 1.1.2 烟草青枯病菌的生物学特性 |
| 1.1.3 烟草青枯病的病状、危害和流行规律 |
| 1.1.4 青枯病菌的致病机理 |
| 1.1.5 烟草青枯病的防控 |
| 1.2 VQ蛋白在植物抗病中的研究进展 |
| 1.2.1 VQ蛋白的发现、特征及进化分布 |
| 1.2.2 vq基因特征 |
| 1.2.3 VQ蛋白的生物学功能 |
| 1.2.4 VQ蛋白的作用机制 |
| 1.2.5 VQs保守基序的重要性 |
| 1.3 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术在植物抗病研究中的应用 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas系统的发现 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas系统的组成与作用机制 |
| 1.3.3 gRNA CRISPR-Cas9 靶位点选择优势 |
| 1.3.4 CRISPR/Cas9 在植物抗病研究中的应用 |
| 第二章 前言 |
| 第三章 烟草vq基因家族的鉴定、生物信息学分析及其在不同处理下的应答 |
| 3.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 序列的获取和鉴定 |
| 3.2.2 NtVQ基因家族成员的命名 |
| 3.2.3 NtVQ蛋白序列分析 |
| 3.2.4 NtVQ基因结构分析 |
| 3.2.5 NtVQ启动子序列分析 |
| 3.2.6 系统进化树构建 |
| 3.2.7 烟草材料的处理 |
| 3.2.8 青枯病原菌的接种方法 |
| 3.2.9 烟草RNA提取 |
| 3.2.10 烟草cDNA的合成与检测 |
| 3.2.11 实时荧光定量PCR及数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 烟草VQ蛋白鉴定、命名以及序列分析 |
| 3.3.2 系统进化树的构建与分析 |
| 3.3.3 烟草vq基因成员基因结构 |
| 3.3.4 烟草vq基因在激素处理下的应答情况 |
| 3.3.5 不同非生物胁迫下烟草vq基因的表达 |
| 3.3.6 烟草vq基因在响应病原菌胁迫时的表达 |
| 3.3.7 NtVQ基因家族顺式元件分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 烟草中VQ蛋白生信分析 |
| 3.4.2 NtVQ基因在不同处理时的表达情况 |
| 第四章 NtVQ35基因抗青枯病基本功能分析 |
| 4.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 烟草NtVQ35编辑植株的获得 |
| 4.2.2 NtVQ35过表达植株的构建与获得 |
| 4.2.3 带NtVQ35启动子表达载体植株的构建 |
| 4.2.4 青枯病菌接种方法 |
| 4.2.5 烟株接种青枯病菌后病菌数目统计方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 烟草NtVQ35编辑植株的获得 |
| 4.3.2 NtVQ35过表达植株的获得 |
| 4.3.3 NtVQ35启动子植株的获得 |
| 4.3.4 编辑植株、过表达植株、野生型烟草接种青枯病菌 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 NtVQ35 编辑植株、过表达与野生型响应Rsc侵染的转录组学研究及植株内水杨酸的测定 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 测序样品准备 |
| 5.1.2 烟草叶片总RNA提取及质量检测 |
| 5.1.3 转录组测序 |
| 5.1.4 文库构建与测序 |
| 5.1.5 数据分析 |
| 5.1.6 qRT-PCR验证 |
| 5.1.7 水杨酸测定方法及样品准备 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 总RNA质量检测 |
| 5.2.2 测序数据过滤 |
| 5.2.3 参考基因组比对结果 |
| 5.2.4 差异表达基因的筛选 |
| 5.2.5 差异表达基因表达趋势分析 |
| 5.2.6 DGEs GO功能分类富集分析 |
| 5.2.7 趋势表达基因KEGG通路富集分析 |
| 5.2.8 与植物抗病性相关代谢途径的筛选及基因分析 |
| 5.2.9 qRT-PCR验证RNA-seq数据 |
| 5.2.10 植株体内水杨酸的测定 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 主要结论、创新点及研究展望 |
| 1 主要结论 |
| 1.1 探明烟草vq基因家族可分为I-VIII组,探索了几种处理的应答情况 |
| 1.2 初步明确vq家族代表基因NtVQ35 负向调控烟草青枯病菌的侵染 |
| 1.3 探索了NtVQ35 对青枯病菌负向调控作用可能与SA信号转导有关 |
| 2 创新点 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文及参加科研项目 |
（7）香榧中油体蛋白和金松酸合成关键酶编码基因的鉴定与功能初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物油脂合成通路介绍 |
| 1.1.1 脂肪酸的合成 |
| 1.1.2 TAG的组装 |
| 1.1.3 油体的合成 |
| 1.1.4 调控油脂合成的相关基因 |
| 1.2 油体合成相关蛋白的研究 |
| 1.3 多不饱和脂肪酸的研究概况 |
| 1.3.1 多不饱和脂肪酸及其分类 |
| 1.3.2 多不饱和脂肪酸的功能 |
| 1.3.3 多不饱和脂肪酸的合成途径 |
| 1.4 金松酸的研究进展 |
| 1.4.1 金松酸简介 |
| 1.4.2 金松酸在其他物种中的分布 |
| 1.4.3 金松酸的合成途径 |
| 1.4.4 金松酸合成途径中相关酶编码基因研究进展 |
| 1.5 香榧简介 |
| 1.5.1 香榧介绍 |
| 1.5.2 香榧研究进展 |
| 1.6 研究意义与研究内容 |
| 2 油脂合成通路的鉴定及关键基因的挖掘 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同地区和不同发育时期香榧种仁含油率及脂肪酸组分分析 |
| 2.3.2 转录组数据分析 |
| 2.3.3 香榧油脂合成通路相关酶基因的筛选及转录特异性分析 |
| 2.3.4 香榧脂肪酸通路相关酶基因的表达量与含油率关联分析 |
| 2.4 总结与讨论 |
| 3 油体蛋白编码基因的鉴定与功能初探 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 油体相关蛋白TgOLEO1,TgCLO1和TgSLO1候选基因的确定 |
| 3.3.2 TgOLEO1,TgCLO1和TgSLO1基因全长扩增 |
| 3.3.3 TgOLEO1,TgCLO1和TgSLO1基因过表达载体构建 |
| 3.3.4 油体合成相关蛋白亚细胞定位 |
| 3.4 总结与讨论 |
| 4 金松酸合成关键酶编码基因的鉴定与功能初探 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 香榧种仁总RNA质量检测 |
| 4.3.2 组装结果分析 |
| 4.3.3 基因功能注释 |
| 4.3.4 香榧不同时期种仁中Δ5脂肪酸去饱和酶基因和Δ9延长酶基因的确定 |
| 4.3.5 香榧TgDES1和TgELO1基因的表达分析 |
| 4.3.6 香榧TgDES1和TgELO1基因全长扩增 |
| 4.3.7 香榧TgDES1和TgELO1基因过表达载体的构建与测序 |
| 4.3.8 TgDES1和TgELO1的亚细胞定位 |
| 4.3.10 转基因拟南芥阳性苗鉴定 |
| 4.3.11 转基因拟南芥叶片中金松酸的测定 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（8）草地早熟禾矮化突变体的遗传差异分析及DXS1基因功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 太空环境对植物生物学的影响 |
| 1.1.1 太空环境的诱变因子 |
| 1.1.2 太空环境诱变因子对植物的影响 |
| 1.1.3 牧草和草坪植物空间生物学研究进展 |
| 1.2 草地早熟禾育种研究进展 |
| 1.2.1 草地早熟禾简介及其应用 |
| 1.2.2 草地早熟禾生殖特性 |
| 1.2.3 草地早熟禾遗传育种进展 |
| 1.3 植物矮化研究进展 |
| 1.3.1 植物矮化突变的来源 |
| 1.3.2 植物矮化基因及矮化机理研究 |
| 1.4 植物萜类物质研究进展 |
| 1.4.1 萜类物质的种类及其在植物中的作用 |
| 1.4.2 萜类物质合成途径 |
| 1.4.3 MEP途径脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因的研究进展 |
| 1.5 本研究的目的、内容与技术路线 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 2 草地早熟禾矮化突变体叶片组织细胞结构的差异分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 原始材料 |
| 2.1.2 空间诱变突变体M1-M4代植株的种植和选择 |
| 2.1.3 植株高度及叶片长宽度测量 |
| 2.1.4 叶片组织细胞结构观察 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 叶片上表皮细胞形态的差异 |
| 2.2.2 气孔参数的差异 |
| 2.2.3 叶片横切面组织结构的差异 |
| 2.2.4 叶片长宽比差异 |
| 2.3 讨论 |
| 3 草地早熟禾矮化突变体生理表型的差异分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 植株高度、内源激素和叶绿素含量的测定 |
| 3.1.3 非生物胁迫处理与分析 |
| 3.1.4 生物胁迫处理与分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 矮化突变体与野生型的植株高度及喷施赤霉素后的变化 |
| 3.2.2 矮化突变体与野生型的叶绿素含量 |
| 3.2.3 矮化突变体和野生型的内源激素含量 |
| 3.2.4 矮化突变体与野生型干旱胁迫下的生理反应 |
| 3.2.5 矮化突变体与野生型盐胁迫下的生理反应 |
| 3.2.6 矮化突变体与野生型对生物胁迫的抗性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 4 草地早熟禾矮化突变体转录组测序及分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 测序样品制备及检测 |
| 4.1.2 测序cDNA文库的构建 |
| 4.1.3 RNA-seq上机测序 |
| 4.1.4 无参考基因组序列的转录组信息分析 |
| 4.1.5 荧光定量PCR分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 矮化突变体和野生型植株的转录组测序概况 |
| 4.2.2 草地早熟禾转录组与其他植物的同源分析 |
| 4.2.3 草地早熟禾矮化突变体与野生型的差异分析概况 |
| 4.2.4 植物矮化相关的差异表达基因的筛选 |
| 4.2.5 叶绿素合成代谢相关的差异表达基因的筛选 |
| 4.2.6 抗非生物胁迫相关的差异表达基因的筛选 |
| 4.2.7 抗病相关的差异表达基因的筛选 |
| 4.3 讨论 |
| 5 草地早熟禾脱氧木酮糖-5-磷酸合酶1基因的功能研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 DXS1基因克隆 |
| 5.1.3 DXS1基因序列和氨基酸序列的生物信息学分析 |
| 5.1.4 蛋白提取和Western Blot实验 |
| 5.1.5 内源激素和叶绿素含量测定 |
| 5.1.6 实时荧光定量PCR |
| 5.1.7 反义表达载体的构建及草地早熟禾的遗传转化 |
| 5.1.8 DXS1反义表达植株的转录组测序及差异表达分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 PpDXS1基因克隆及其在WT和A16中的序列比较 |
| 5.2.2 PpDXS1蛋白的生物信息学分析 |
| 5.2.3 PpDXS1基因在草地早熟禾不同组织中的表达分析 |
| 5.2.4 不同诱导因子对PpDXS1基因表达的调控 |
| 5.2.5 PpDXS1反义表达对草地早熟禾株高、叶绿素和激素含量的影响 |
| 5.2.6 PpDXS1反义转基因株系和对照植株的差异表达分析 |
| 5.3 讨论 |
| 6 启动子变异和G-box结合因子对PpDXS1基因表达的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 PpDXS1基因启动子序列的分离与克隆 |
| 6.1.3 启动子生物信息学分析 |
| 6.1.4 草地早熟禾原生质体分离及双荧光素酶表达系统 |
| 6.1.5 转录因子与启动子序列互作验证 |
| 6.1.6 遗传转化及鉴定 |
| 6.1.7 荧光定量PCR分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 PpDXS1基因启动子序列的获取及分析 |
| 6.2.2 PpDXS1启动子在原生质体双荧光素酶系统中的活性 |
| 6.2.3 PpDXS1启动子在草地早熟禾中的遗传转化分析 |
| 6.2.4 G-box结合因子对PpDXS1启动子活性的影响 |
| 6.2.5 G-box结合因子在草地早熟禾中的过表达分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 空间环境引起PpDXS1基因启动子插入/缺失突变 |
| 6.3.2 PpDXS1启动子变异影响了启动子活性 |
| 6.3.3 与变异区域结合的G-box结合蛋白对启动子活性有影响 |
| 7 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录 |
| 致谢 |
（9）甜菜夜蛾细胞色素P450和谷胱甘肽-S-转移酶基因的转录调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 甜菜夜蛾的抗药性 |
| 1.1.1 甜菜夜蛾的发生与危害 |
| 1.1.2 甜菜夜蛾的化学防治与抗药性 |
| 1.2 害虫对杀虫剂抗性的机制 |
| 1.2.1 靶标抗性 |
| 1.2.2 代谢抗性 |
| 1.3 细胞色素P450 |
| 1.3.1 细胞色素P450 |
| 1.3.2 NADPH-细胞色素P450还原酶 |
| 1.3.3 昆虫细胞色素P450基因的可诱导性 |
| 1.3.4 昆虫细胞色素P450在昆虫抗药性中的作用 |
| 1.3.5 昆虫P450基因的功能验证 |
| 1.4 昆虫谷胱甘肽-S-转移酶 |
| 1.4.1 谷胱甘肽-S-转移酶的分类及一般特性 |
| 1.4.2 谷胱甘肽-S-转移酶的生化特性 |
| 1.4.3 谷胱甘肽-S-转移酶与抗药性的关系 |
| 1.5 昆虫解毒基因表达的调控机制 |
| 1.5.1 诱导表达调控机制 |
| 1.5.2 组成型高表达调控机制 |
| 1.6 本论文的研究目的和意义 |
| 第二章 甜菜夜蛾P450的克隆与表达规律 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试虫源 |
| 2.1.2 试剂与试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 样品准备与总RNA提取 |
| 2.1.5 cDNA合成 |
| 2.1.6 基因克隆 |
| 2.1.7 基因末端扩增 |
| 2.1.8 生物信息学分析 |
| 2.1.9 细胞培养与处理 |
| 2.1.10 MTT测定 |
| 2.1.11 基因表达水平分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 甜菜夜蛾P450家族基因的克隆 |
| 2.2.2 甜菜夜蛾P450超家族系统进化分析 |
| 2.2.3 甜菜夜蛾P450组织表达谱 |
| 2.2.4 杀虫剂处理对CYP450基因表达的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 P450介导甜菜夜蛾抗药性 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试虫源 |
| 3.1.2 试剂与试剂盒 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 甜菜夜蛾的生物测定 |
| 3.1.5 P450酶活性测定 |
| 3.1.6 基因表达水平分析 |
| 3.1.7 转基因果蝇的构建 |
| 3.1.8 转基因果蝇的生物测定 |
| 3.1.9 真核表达 |
| 3.1.10 还原型CO差异光谱分析 |
| 3.1.11 P450酶活性测定 |
| 3.1.12 杀虫剂的体外代谢 |
| 3.1.13 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 甜菜夜蛾的抗药性水平与生化机制 |
| 3.2.2 P450在抗性种群和敏感种群中的表达差异 |
| 3.2.3 P450过表达对果蝇杀虫剂敏感性的影响 |
| 3.2.4 P450的真核表达与杀虫剂代谢 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 甜菜夜蛾CYP321A8和CYP321B1组成型高表达的调控机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试虫源 |
| 4.1.2 试剂与试剂盒 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 甜菜夜蛾RNA提取 |
| 4.1.5 cDNA第一链合成 |
| 4.1.6 转录因子的克隆 |
| 4.1.7 转录因子的表达水平分析 |
| 4.1.8 上游启动子区的克隆与序列分析 |
| 4.1.9 荧光报告质粒的构建 |
| 4.1.10 突变体构建 |
| 4.1.11 转录因子过表达载体构建 |
| 4.1.12 报告质粒的细胞转染 |
| 4.1.13 报告质粒荧光活性测定 |
| 4.1.14 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 CYP321A8的转录调控机制 |
| 4.2.2 CYP321B1的转录调控机制 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 甜菜夜蛾谷胱甘肽-S-转移酶基因诱导表达的调控机制 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试虫源 |
| 5.1.2 试剂与试剂盒 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 甜菜夜蛾不同组织样本的收集 |
| 5.1.5 GST基因克隆 |
| 5.1.6 生物信息学分析 |
| 5.1.7 基因表达水平分析 |
| 5.1.8 昆虫细胞培养与药剂处理 |
| 5.1.9 上游启动子区的克隆与预测分析 |
| 5.1.10 荧光报告质粒构建 |
| 5.1.11 报告质粒的细胞转染 |
| 5.1.12 荧光测定 |
| 5.1.13 ROS测定 |
| 5.1.14 数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 甜菜夜蛾GST家族基因的克隆 |
| 5.2.2 甜菜夜蛾GST的系统进化 |
| 5.2.3 GSH结合位点和底物结合位点 |
| 5.2.4 组织特异性表达谱 |
| 5.2.5 GST家族基因对杀虫剂的响应 |
| 5.2.6 上游序列转录因子结合位点的预测 |
| 5.2.7 杀虫剂通过CncC/Maf途径调控GST基因的共表达 |
| 5.2.8 ROS介导杀虫剂对GST基因的诱导表达 |
| 5.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点与尚有待解决的问题 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 攻读学位期间发表的论文 |
| 附录Ⅱ 攻读学位期间获得奖励及参加学术会议 |
| 致谢 |
（10）猪转座组注释、活性分析及其对基因组、转录组和功能基因的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 转座子介绍 |
| 1.1 转座子的定义 |
| 1.2 转座的分类 |
| 1.3 转座子的应用 |
| 2. 转座子的挖掘 |
| 2.1 从头挖掘法 |
| 2.2 基于序列同源性的挖掘方法 |
| 2.3 基于结构的挖掘方法 |
| 2.4 重复序列的校正和分类 |
| 2.5 基因组注释 |
| 3. 转座子是哺乳动物遗传变异的重要来源 |
| 3.1 转座子扩张差异是造成的基因组大小差异的主要原因 |
| 3.2 转座子是驱动基因组结构变异的重要动力 |
| 3.3 转座子对基因活性具有广泛影响 |
| 4. 反转录转座子是猪等哺乳动物基因组的重要组成成分 |
| 5. 人和小鼠基因组中均含有活性反转录转座子 |
| 6. 转座子插入多态(TIP)是重要的新型分子标记 |
| 6.1 TIP分子标记种类 |
| 6.2 TIP分子标记具有很好的应用前景 |
| 引言 |
| 第二章 猪基因组中转座子挖掘、分类和进化分析及其对基因组和转录组的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 猪基因组中反转录转座子的挖掘 |
| 1.2 猪转座组对基因组和转录组的影响 |
| 1.3 转座子年龄估算 |
| 1.4 年轻转座子插入多态检测 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 猪基因组中L1和SINE转座子的分类及进化分析 |
| 2.2 猪基因组中年轻ERV的挖掘 |
| 2.3 猪基因组中反转录转座子约占40%,而年轻反转录转座子含量很少 |
| 2.4 大多数蛋白编码基因和lncRNA基因含有转座子插入 |
| 2.5 反转录转座子在lncRNA基因和蛋白编码基因中的含量及插入方向存在偏好性 |
| 2.6 反转录转座子在lncRNA基因和蛋白编码基因的转录本中的分布存在偏好性 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 反转录转座子占据哺乳动物基因组的30%-50% |
| 3.2 L1和SINE均表现出由不同家族主导的扩增进化模式 |
| 3.3 ERV6是最年轻的ERV |
| 3.4 反转录转座子对蛋白编码基因和lncRNA基因可能具有重要影响 |
| 第三章 猪年轻反转录转座子转录活性、启动子活性及转座活性检测 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 转座子转录检测 |
| 1.2 反转录转座活性验证载体构建 |
| 1.3 启动子活性验证载体构建 |
| 1.4 细胞培养 |
| 1.5 反转录转座活性验证实验 |
| 1.6 启动子活性验证实验 |
| 1.7 数据统计 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 猪L1具有转座活性 |
| 2.2 年轻L1和ERV家族的5'UTR和LTR具有正反向启动子活性 |
| 2.3 在不同组织和细胞系中均检测到年轻的L1s和ERVs的正反向转录 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 L1 5'UTRs和ERV LTR具有正反向启动子活性 |
| 3.2 猪L1具有反转录转座活性 |
| 第四章 猪SINE转座子插入多态引起的外显子变异分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 SINE转座子与基因关联分析 |
| 1.2 外显子区年轻SINE插入位点序列获取 |
| 1.3 数据库比对鉴定转座子插入多态 |
| 1.4 外显子区年轻SINE插入多态性验证 |
| 1.5 外显子区SINE插入多态位点注释及分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 外显子区含有大量SINE插入 |
| 2.2 大量外显子含有SINE插入 |
| 2.3 不同年龄的SINE在基因内和基因间具有明显不同的插入多态频率 |
| 2.4 从外显子区鉴定到151个年轻SINE插入多态位点 |
| 2.5 外显子区SINE插入多态位点多分布在非编码区 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 SINE广泛存在于基因的非编码区 |
| 3.2 年轻SINE存在大量插入多态 |
| 3.3 不同年龄的SINE插入多态性存在明显差异 |
| 第五章 转座子插入多态引起GHR基因结构变异分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 GHR序列的获取 |
| 1.2 猪GHR基因在不同物种间的保守性分析 |
| 1.3 转座子注解 |
| 1.4 多序列比对 |
| 1.5 结构变异验证 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 获取到15条GHR基因的序列 |
| 2.2 GHR基因在不同物种中相对比较保守 |
| 2.3 转座子对GHR基因的贡献 |
| 2.4 GHR基因中存在大量结构突变 |
| 2.5 初步检测到5个转座子插入引起的结构突变 |
| 2.6 GHR-TIP5与校正背膘厚呈显着性相关 |
| 3. 讨论 |
| 全文结论 |
| 文章创新点 |
| 文章不足及下一步应开展的工作 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
四、Existence of homologous sequences corresponding to cDNA of the ver gene in diverse higher plant species（论文参考文献）
- [1]沙葱萤叶甲成虫夏滞育调控的分子机理[D]. 马红悦. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [2]梨棕榈酰基转移酶基因家族鉴定及PbPAT14功能研究[D]. 庞宏光. 河北农业大学, 2020(01)
- [3]黄瓜CsATG8c和CsATG8e基因的表达与功能分析[D]. 杨悦. 哈尔滨师范大学, 2020(01)
- [4]尾叶樱桃（Cerasus dielsiana）系统分类地位与种群生物地理学研究[D]. 朱弘. 南京林业大学, 2020(01)
- [5]罗汉果叶绿体基因组组装分析及葫芦二烯醇合酶基因转录因子研究[D]. 石宏武. 北京协和医学院, 2020(05)
- [6]烟草NtVQ35基因的鉴定及其抗青枯病基本功能研究[D]. 刘翠花. 西南大学, 2020(01)
- [7]香榧中油体蛋白和金松酸合成关键酶编码基因的鉴定与功能初探[D]. 丁明珠. 浙江农林大学, 2019(01)
- [8]草地早熟禾矮化突变体的遗传差异分析及DXS1基因功能研究[D]. 甘露. 北京林业大学, 2019(04)
- [9]甜菜夜蛾细胞色素P450和谷胱甘肽-S-转移酶基因的转录调控机制[D]. 胡波. 南京农业大学, 2019(08)
- [10]猪转座组注释、活性分析及其对基因组、转录组和功能基因的影响[D]. 陈才. 扬州大学, 2019(02)