一、人CD81分子的肝组织特异性稳定表达（论文文献综述）
杜寿文[1]（2015）在《干扰素诱导跨膜蛋白抑制痘苗病毒作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理干扰素诱导跨膜蛋白（IFITMs）是目前发现的唯一一类阻断病毒进入细胞的宿主限制因子（HRFs），对很多病毒感染均表现出抑制活性，包括囊膜病毒和非囊膜病毒，如IAV、HIV-1及呼肠孤病毒等。然而，IFITMs所抑制病毒几乎都是RNA病毒，还没有发现该类蛋白对DNA病毒抑制作用的详细报道。因此，为了探究IFITMs蛋白在痘病毒感染中扮演的角色，本研究主要围绕该类蛋白和痘苗病毒的相互作用这一主题，综合应用分子生物学、慢病毒包装技术、真核表达技术、免疫荧光技术、荧光显微镜技术、流式细胞仪、实时荧光定量PCR方法、分子荧光标记病毒示踪技术、siRNA沉默技术、免疫沉淀-质谱分析技术、激光共聚焦显微镜技术以及生物信息学等方法，系统分析IFITMs对痘苗病毒感染、复制及进入的影响以及痘苗病毒感染对该类蛋白的表达调控规律，初步探讨IFITMs的作用机制及其可能的相互作用分子。根据本课题组前期研究基础，首先对来源于HEK293T、HeLa和人PBMCs细胞的IFITMs基因与GenBank登陆基因进行同源性分析，发现IFN处理HEK293T细胞源的IFITM1基因与PBMCs源的基因编码氨基酸序列完全一致；HeLa源的IFITM3蛋白氨基酸序列与其他来源的序列存在1个氨基酸差异（HeLa：R71；其他：C71）；不同源的IFITM2蛋白氨基酸序列存在3个氨基酸差异。而且IFITM2与IFITM3的氨基酸同源性最高、结构相似，IFITM1结构与前两者不同。最终，我们选择人PBMCs细胞来源的IFITMs基因为靶基因，设计引物在N端添加Flag标签序列，然后对其在真核细胞中的表达进行验证，数据显示，IFITMs蛋白在真核细胞内获得表达，为进一步抗病毒研究奠定了基础。进而利用瞬时过表达方法检测IFITMs蛋白对痘苗病毒感染的影响。研究发现，IFITMs过表达对痘苗病毒表现出一定的抑制活性。为了更好地研究IFITMs对痘苗病毒的作用，利用慢病毒表达系统筛选构建了多种稳定表达IFITMs蛋白的细胞系（HEK293T、HeLa、BHK-21、Vero与A549），IFITMs在这些细胞系中无论是mRNA水平还是蛋白水平都获得表达。而且，分离稳定过表达IFITM3的HEK293T和HeLa细胞的膜蛋白或胞浆蛋白，Western blot检测发现IFITM3蛋白主要定位在细胞膜上，可能与其作用有关。基于建立的这些细胞系，进行病毒感染试验。通过荧光显微镜、流式细胞仪等分析发现，低感染复数的痘苗病毒在稳定表达IFITMs蛋白的HEK293T、A549、BHK-21或Vero细胞系中的感染明显受到抑制，但在HeLa细胞系中没有发现IFITMs对痘苗病毒感染显着的抑制作用，表明IFITMs抗病毒作用的发挥具有细胞依赖性。实时荧光定量PCR和Western blot方法对感染不同时间点病毒基因的表达进行分析，发现IFITMs蛋白延缓病毒基因的转录和表达，由于前期发现该类蛋白对病毒基因的表达没有直接影响，因此认为IFITMs通过抑制病毒的增殖延缓了病毒基因的转录和表达。在IFITM3稳定表达的BHK-21细胞系中病毒生长曲线显示，IFITM3抑制病毒的增殖。噬斑分析实验表明，IFITM3抑制病毒在细胞间的传播和扩散，抑制病毒的复制。此外，实验中还发现IFITMs蛋白抑制鸡痘病毒感染BHK-21细胞。为了进一步探讨内源性IFITMs在细胞固有抗病毒反应和IFN介导的抗病毒反应中的作用，设计了靶向干扰IFITMs的siRNAs，在IFITM蛋白组成性高表达的A549和HeLa细胞中进行了siRNA干扰实验，显示内源性IFITMs蛋白敲低后没有表现出感染显着增强现象，但减弱了IFN介导的抗痘苗病毒作用，而且表现出细胞类型差异。另外，在过表达IFITM3的293T细胞系中的siRNA干扰实验显示，IFITM3沉默后增强病毒感染。此外还分析了siRNA处理及处理后病毒感染时的细胞活性，发现IFITMs基因沉默对细胞的活力没有显着影响，但在病毒感染时维持细胞活性发挥一定的作用。在以上研究的基础上，以IFITM3为主要研究对象，对其在抑制病毒感染的作用阶段及机制进行了初步探索。研究发现，IFITM3抑制病毒早晚期基因转录起始，表明IFITM3作用于病毒早期基因转录起始之前的病毒颗粒的进入阶段。进而，利用激光共聚焦显微镜和分子荧光标记病毒技术分析了IFITM3对病毒-细胞结合的影响，研究发现IFITM3干扰病毒-细胞吸附过程。同时，利用激光共聚焦显微镜观察病毒进入过程，综合以上数据发现IFITM3在病毒进入阶段已经发挥抑制作用。此外，在过表达IFITM3的BHK-21细胞系中对IFITM3进行了定位分析，结果发现IFITM3在细胞膜和细胞浆内均有定位，结合前面IFITM3为膜蛋白的数据，表明该蛋白定位于细胞膜等膜结构上，有利于解释该蛋白对病毒吸附的干扰作用。通过内体酸化或酸化抑制分析显示，IFITM3主要抑制低pH介导进入的病毒感染，且细胞培养环境pH的降低不利于IFITM3作用的发挥。此外，还发现痘苗病毒感染晚期下调IFITMs蛋白的表达，但在mRNA水平变化不明显。此外，痘苗病毒感染后细胞内部分IFN产生通路上关键分子的转录分析显示，STING、IRF3和IRF7转录变化显着，但在感染晚期IFN和IFNβ转录增强（48hpi）。提示，痘苗病毒感染负调节IFITMs蛋白的表达。同时为了更好地理解IFITM3作用机制，我们还利用“Flag免疫沉淀-质谱分析”筛选了病毒感染时IFITM3可能的相互作用蛋白，发现65个未感染细胞鉴定结果中不存在的宿主蛋白和6个痘苗病毒蛋白，正在对这些蛋白进行验证，在下一步更为精细的实验分析中，可能会发现相关的相互作用分子，阐明其作用分子机制。综上，本论文为深入理解IFITMs的抗病毒谱和病毒与细胞间复杂的相互作用关系提供了一些线索。尽管当前对于IFITMs抗病毒的认识主要集中在有囊膜的RNA病毒，但我们提供了在过表达的情况下，IFITMs蛋白通过干扰痘苗病毒的进入阶段限制病毒感染。同时我们还分析了IFITMs蛋白在IFN介导的抗病毒反应中的作用。这些结果有助于探讨IFITMs蛋白作为病毒进入抑制因子的潜在应用价值及深入分析痘苗病毒进入途径和IFITMs抗病毒分子机制。
闫舫[2]（2014）在《hESCs来源的肝系细胞构建HCV易感的细胞模型和人源化小鼠模型研究》文中研究指明由丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）所致的急、慢性感染，并逐渐发展为肝硬化、肝纤维化，甚至肝细胞肝癌，是目前公认的危害全球人类健康的重大传染性疾病。从1989年HCV首次发现和鉴定以来，HCV的发病机制、生命周期、抗病毒药物以及疫苗研究方面进展非常缓慢，这是因为HCV感染具有严格的种属特异性，其自然感染宿主仅限于人和黑猩猩。缺乏HCV自然感染的体外细胞模型以及体内动物模型成为制约HCV研究领域发展的重要原因。人的肝细胞是HCV感染的宿主细胞，但人肝细胞来源有限，且为终末分化细胞；而目前大部分HCV体外研究的细胞模型均为肝肿瘤细胞系细胞，无法模拟正常人肝细胞的感染及深入进行HCV感染机制的研究。将人肝细胞植入小鼠体内构建人源化肝脏嵌合鼠是HCV研究的理想动物模型。感染性HCV和肝损伤免疫缺陷小鼠是构建该疾病模型的前提条件，而选择对HCV易感的、具有高度增殖、分化和植入能力的靶细胞则是关键。常见用于构建人源化肝脏模型的小鼠包括：NOD/SCID鼠、uPA-SCID鼠、ALB-uPA-SCID鼠、FRG小鼠和AFC8-hu HSC/Hep小鼠等。用于移植的细胞多数为尸体肝脏分离获得的原代肝细胞，来源非常有限，体外无法长期培养，且原代肝细胞是终末分化细胞，移植回小鼠肝内后，整合及再生的能力有限，因此原代肝细胞不是构建人源化肝脏小鼠的理想种子细胞来源。人的胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）由于具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性，能在体内、外被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型，因此成为构建体外HCV感染细胞模型及人源化肝脏嵌合小鼠模型的理想种子细胞。自2001年开始，多个研究团队利用小鼠ESCs、hESCs甚至人的诱导多潜能干细胞（iPSCs），采用不同的诱导分化方案，将其诱导分化成肝细胞样细胞。这些诱导分化来的细胞具有肝细胞相似的形态及肝细胞的功能，但功能仍不完善。随着HCV JFH-1病毒株的分离及其体外Huh7细胞培养模型的建立，对HCV生命周期的研究逐渐深入，人们发现，宿主细胞表面的特异性受体及某些蛋白分子决定了宿主细胞对HCV的易感性。与HCV入侵密切相关的受体及蛋白分子包括低密度脂蛋白受体（LDLR）、CD81、清道夫受体BI（SR-BI）、claudin-1（CLDN-1）及occludin（OCLN）等，其中细胞间紧密连接（tight-junction，TJ）中的OCLN不仅是HCV入侵的必要条件，而且通过介导细胞-细胞间的相互作用决定了细胞的分化命运。因此，我们期望以人胚胎干细胞为种子细胞，通过小分子、细胞因子及细胞外基质（ECM）组合在体外建立并优化分步诱导方案，以提高干细胞的增殖分化效率，获得功能完善的肝细胞样细胞；在此基础上，应用高感染性的HCVcc对诱导分化不同阶段的细胞进行感染展开HCV体外感染规律的研究，寻找具有较高HCV易感性的肝系细胞分化阶段；应用小分子或细胞因子组合，提高肝系细胞对HCV的易感性；将具有高易感性的肝系细胞感染后，再移植回FR小鼠体内，构建HCV易感的人源化肝脏小鼠，获得能够模拟人体自然感染过程的体外HCV感染细胞模型及整合效率更高、HCV易感的人源化肝脏嵌合鼠模型，为研究HCV发病机制、生命周期及抗病毒药物靶点筛选奠定基础和提供技术平台，也为突破疾病动物模型建立的传统模式探索新思路。具体研究内容及结果如下：一、hESCs肝向诱导分化体系建立及HCV感染规律研究根据体内肝脏发育分化的谱系特点，应用stepwise策略，分别在诱导分化的不同阶段加入不同的细胞因子和小分子化合物组合，筛选和建立了将hESCs向成熟、有功能的肝细胞诱导分化的方案；经过上述优化的stepwise诱导分化体系的作用，获得的肝细胞样细胞能够分泌白蛋白、尿素；PAS染色呈阳性；具有ICG的吸收和排泌功能；细胞的同质性较好（细胞中人ALB的表达量可达91.4%）。stepwise诱导分化策略的建立及功能性肝细胞的获得为后续体外HCV易感性研究奠定了基础。通过分步诱导策略，使细胞处于发育分化的特定阶段，再以HCVcc感染不同阶段的细胞，探索HCV体外感染规律的变化。结果显示，诱导分化早期的细胞（ES、DE）不能被HCVcc感染，当诱导分化进入HS阶段可被HCVcc感染，HB阶段的细胞具有较高的HCV RNA拷贝数，成熟肝细胞样细胞对HCV的易感性下降；尽管与HCV入侵相关的OCLN蛋白，在ES向肝细胞分化过程中表达量没有显着改变，但分布位置发生了改变，细胞极性是影响HCV入侵以及影响宿主细胞对HCV易感性的主要原因。二、VEGF调节分化细胞极性从而改变其对HCV易感性的研究本研究将外源性VEGF引入诱导分化体系中，一方面观察其对诱导分化细胞向肝系细胞分化的影响，另一方面验证其对细胞极性形成的影响，进而观察VEGF能否促进诱导分化细胞对HCV的易感性。qRT-PCR和细胞免疫荧光染色结果显示，加入VEGF后，有助于维持诱导分化细胞的干性，也有助于提高HCV的易感性。VEGF是通过降低OCLN的磷酸化水平，进而促使OCLN由膜顶面向基底膜转移，使细胞处于去极化状态，最终影响细胞对HCV的易感性。三、基于hESCs的人源化肝脏小鼠模型构建及其HCV易感性研究为获得HCV易感的人源化肝脏小鼠模型，本研究采取了新的构建策略：首先选取体外具有较高HCV易感性的HB阶段细胞，将其在体外先进行感染；然后再将感染的细胞肝内原位注射移植回小鼠体内，通过规律性撤除NTBC使小鼠肝细胞发生不可逆的损伤，从而使移植回的人肝祖细胞能够有效整合到Fah/Rag2/小鼠肝内。实验结果证实，经过这种策略构建的人源化肝脏小鼠，能够成功挽救NTBC撤药小鼠的生命，生存率可达75%；肝组织免疫组织化学染色证明，植入的细胞是人源的细胞（FAH、抗人肝细胞抗体、ALB等均为阳性），同时这些细胞也表达HCV的非结构蛋白NS5A和核心蛋白Core；但在构建的人源化肝脏小鼠模型中未检测到病毒血症的发生。四、IFN-β-siRNA干扰提高HCV感染性的体内/外研究HCV感染肝细胞后，主要引起肝细胞自身免疫反应，通过产生I型干扰素（IFN-α/β）达到清除病毒的目的。因此，我们利用IFN-β的siRNA，探索体内、外干扰IFN-β后，是否可减少肝细胞对HCV的清除，从而使携带病毒的肝细胞整合入FR小鼠肝脏后产生病毒血症。研究表明，经过siRNA干扰作用，持续感染的细胞中HCV RNA拷贝数能够维持在105数量级长达8天，说明针对IFN-β的siRNA干扰，具有减少自身免疫对HCV清除的作用；在体内干扰实验中，我们仍然未观察到病毒血症的发生，但针对IFN-β的siRNA作用可减少肝细胞对病毒的清除。综上，本研究建立了高效的诱导人胚胎干细胞向肝细胞分化成熟的培养体系，诱导分化细胞能够功能性整合入FR小鼠肝内，成功构建了人源化肝脏小鼠模型；揭示了HCV感染肝系细胞的谱系特异性规律，即发育分化早期的肝干细胞就对HCV易感，而在肝系细胞中，肝祖细胞具有更高的HCV易感性；初步阐明细胞间紧密连接及细胞极性影响HCV易感性的机制；提出新的构建HCV易感的人源化肝脏小鼠模型新策略，基于此策略构建的HCV感染的人源化肝脏小鼠模型，为开展HCV生命周期研究、致病机理研究及抗HCV复制药物筛选和评价提供了新的技术平台。
阎少多[3]（2014）在《HCV小鼠模型的建立及其在肝脏免疫损伤研究中的应用》文中研究指明丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）是黄病毒属的单股正链RNA病毒,是慢性肝炎的主要致病因子之一。临床资料显示,丙肝患者的肝细胞极易发生损伤,且肝细胞的自身修复能力减弱、增生异常,最终引发肝纤维化、肝硬化及肝癌的发生,迄今仍缺乏有效的防治手段。加强丙型病毒性肝炎的相关基础研究,是当前丙型病毒性肝炎防治研究中的重要命题。HCV是一种非细胞毒性的嗜肝病毒,丙肝患者肝细胞极易发生损伤的现象主要是由宿主免疫系统与受病毒感染的肝细胞间的相互作用引起。特别是宿主肝脏免疫系统对被感染肝实质细胞的异常免疫反应导致了肝细胞损伤与修复的平衡失调。但HCV和宿主肝脏免疫系统间相互作用的机制尚不明确,探索HCV和宿主肝脏免疫系统之间的相互作用是本研究的重要目的。本研究分以下两个部分展开：1.肝脏特异性稳定转染技术的探索与应用合适的动物模型是探索HCV免疫致病机理的重要环节。目前,可感染HCV的动物模型仅限于黑猩猩、嵌合人类肝细胞小鼠模型及多种HCV受体联合转基因小鼠模型。但由于受数量有限、价格昂贵等因素的影响,限制了这几类动物模型在基础研究中的广泛应用。传统的HCV转基因小鼠模型为研究HCV蛋白与宿主之间的相互作用奠定了良好的基础,但由于存在先天免疫耐受,使其不能应用于HCV和肝脏免疫系统间的相互作用研究。基于此,采用合适的方法建立免疫功能正常并适于实验室广泛应用的HCV动物模型是目前抗HCV相关研究的重要环节。1.1眼底静脉丛水动力转染技术的建立基于经典的水动力转染技术和眼底静脉丛注射技术建立的眼底静脉丛水动力转染技术具有良好的肝脏靶向性,在目前缺乏合适的HCV小动物模型的前提下,通过该方法建立HCV小鼠模型替代HCV体内感染模型可能是一种快速、高效、稳定、简便的构建HCV肝脏特异性转基因动物模型的新方法。传统的水动力转染技术有其自身难以克服的缺点,因此,本研究结合眼底静脉丛输注建立了眼底静脉丛水动力转染技术。该技术是将大量含有目的基因表达质粒的盐水溶液从眼底静脉快速注入实验动物体内,实现外源基因在肝脏特异、高效表达。通过条件摸索,确立了应用该技术的最适转染条件,并分析了其对实验动物器官机能的影响。在转染效率方面,眼底静脉丛水动力转染技术与经典的尾静脉水动力转染技术相当。该技术操作更简单、可重复性强。最为关键的是,眼底静脉丛水动力转染技术克服了尾静脉水动力转染仅能用于尾静脉适合注射的实验动物的应用限制。该技术除可用于常规实验动物外,还可用于尾静脉无法注射或无尾静脉的实验动物,有效拓展了水动力转染技术的应用范围。1.2密码子优化的噬菌体整合酶介导外源基因在小鼠肝脏长期稳定表达噬菌体整合酶技术是一种可以介导外源基因在靶细胞发生特异性整合的生物酶技术。新近报道的鼠密码子优化的噬菌体整合酶针对鼠类基因特点进行密码子优化,对于鼠源细胞具有更高的整合效率。为促进水动力转染技术导入肝组织中的外源基因在小鼠肝细胞中长期稳定表达,我们在实验中引入鼠密码子优化的噬菌体整合酶技术。并以NF-κB sensor质粒作为报告基因,通过与噬菌体整合酶表达质粒共转染实现对活体小鼠肝脏长期稳定转染的技术优化,建立了可长期监测肝脏NF-κB活性的小动物模型。研究结果显示,与传统的噬菌体整合酶系统相比,鼠密码子优化的噬菌体整合酶可以更加有效的促使外源基因在活体小鼠肝细胞中发生整合,并介导外源基因长期高效表达。1.3基于水动力转染和整合酶技术建立HCV基因组肝脏长期表达小鼠模型在前期研究工作基础上,我们联合水动力转染技术和鼠密码子优化的噬菌体整合酶技术,基于免疫功能正常的C57BL/6小鼠,建立了HCV全基因组肝脏长期稳定表达的动物模型。此外,在HCV全基因组表达载体上融合了报告基因—萤火虫荧光素酶,HCV在小鼠肝脏的表达情况可以通过活体成像技术进行实时监测,为后续实验提供了方便。2.HCV促进小鼠肝脏免疫损伤的机制研究强势的肝脏免疫系统是机体抵御外来侵袭的重要防御机制。占肝脏淋巴细胞总数30%左右的NK细胞,对抵抗病毒、寄生菌感染和恶性转化细胞侵润等侵害具有十分重要的意义。但NK细胞是否参与丙肝患者肝细胞损伤的免疫过程尚不明确。因此本研究寻找以NK细胞为代表的肝脏免疫细胞在丙肝患者肝细胞损伤中的作用机制,可能是防治HCV所导致的肝脏疾病的重要方法。2.1HCV对小鼠肝脏免疫细胞的影响以本研究建立的免疫功能正常的HCV全基因组肝脏长期表达小鼠模型为基础,首先分析HCV表达对肝脏免疫细胞的影响,结果显示：HCV降低了小鼠肝脏NK细胞的数量,但不影响其活性；HCV对小鼠其他类型的肝脏淋巴细胞（NKT、T、DC等）未造成显着影响。这一结果与临床报道相似。2.2HCV促进Con A诱导的小鼠肝脏损伤及其免疫学机制鉴于NK细胞在肝脏天然免疫系统中发挥的重要作用,我们认为,肝脏NK细胞的减少可能会对机体的免疫反应产生一定的影响。为进一步探索HCV与宿主肝脏免疫系统的关系,基于该HCV小鼠模型,并结合Con A诱导的自身免疫性肝损伤模型,对HCV免疫致病机理进行探索。结果显示：中等剂量Con A刺激后,HCV组小鼠的肝脏免疫损伤现象增强；而高剂量Con A刺激后,HCV小鼠发生严重的自身免疫性肝炎并促使小鼠死亡率增高。进一步研究结果显示：ConA静脉注射诱发小鼠自身免疫性肝炎后,小鼠肝脏免疫细胞活化,其中肝脏天然免疫细胞---NK细胞的数量和功能在HCV组和对照组小鼠间的差异最为明显。选择性清除小鼠体内的NK细胞,则HCV小鼠对Con A诱导的肝损伤的敏感性降低,肝损伤减轻。说明HCV小鼠对Con A诱导的肝损伤的敏感性增强与小鼠肝脏NK细胞的过度活化相关。针对NK细胞功能的研究结果显示,肝脏NK细胞免疫功能过度激活依赖于NK细胞表面激活性受体NKG2D及其胞内与其免疫活性密切相关的细胞因子（IFN-γ、TNF-α等）的表达。同时,NKG2D在肝细胞表面的配体NKG2DL（H60）的表达水平也显着上调。综上所述,本研究结合眼底静脉丛水动力转染技术、密码子优化的噬菌体整合酶和活体荧光成像技术,基于免疫功能正常的C57BL/6小鼠,建立了可视化的HCV肝脏特异性长期表达小鼠模型。研究显示,该模型对Con A诱导的肝损伤更加敏感,而这一现象与肝脏NK细胞的异常活化相关,肝脏NK细胞发挥病理性免疫损伤作用主要是通过;NKG2D/NKG2DL（H60）相关信号通路及其胞内与其免疫活性相关的细胞因子（IFN-y、TNF-α等）的表达。本研究从肝脏天然免疫系统角度部分解释了HCV和肝脏免疫细胞间的相互关系,对HCV急慢性感染的防控及HCV导致的肝脏疾病的治疗具有一定的理论意义。而该动物模型的建立也为今后探索HCV介导的肝脏病理生理学机制及研发潜在的HCV疫苗及免疫治疗方法提供了一个有效的工具。
周小军[4]（2012）在《新型HCV感染细胞模型及小鼠模型研究》文中提出丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要因素之一，其慢性化及致癌率高，是严重威胁人类健康的公共卫生问题。目前尚缺乏有效的HCV预防性疫苗，这进一步增加了HCV的防控难度。HCV具有高度种属特异性，仅能感染人和黑猩猩，不能自然感染小鼠，致使HCV感染性模型缺乏，严重阻碍了HCV复制及致病机制研究、抗病毒药物及疫苗研制与评价等。建立新型HCV感染性细胞模型及小动物模型，对HCV基础及应用研究具有重要意义。本研究分别利用Tet-on可诱导系统和第三代腺病毒载体系统，探索并建立了新型HCV感染细胞模型及小鼠模型，以期为HCV复制与致病机制研究、疫苗及抗病毒药物评价等提供一个新的技术手段。1.肝组织特异性可诱导uPA转基因小鼠模型研究（1）可诱导uPA转基因人肝嵌合小鼠模型的建立及鉴定人肝嵌合小鼠模型是将人肝细胞异种移植到受体鼠肝内建立的适合于嗜肝病毒体内感染研究的小鼠模型，现有的Alb-uPA/SCID转基因人肝嵌合小鼠模型，由于在肝组织特异性白蛋白（Albumin）启动子作用下组成性表达小鼠尿激酶原激活剂（urokinase-type plasminogen activator, uPA）分子，造成出生小鼠肝损伤，为人肝细胞的移植及嵌合生长提供了微环境；但其严重不足之处是小鼠出生时死亡率高达70%90%，使得该模型稳定性差，繁育及操作难度大。因此，建立繁育和操作简单、稳定性好和死亡率低的模型是发展该模型的关键。为了降低Alb-uPA/SCID小鼠出生时高死亡率，增强模型稳定性，本研究采用Tet-on可诱导系统建立了一种可诱导uPA转基因表达的人肝嵌合小鼠模型。首先，我们分别构建了Tet-on-Albumin和TRE2-uPA转基因载体，在体外证实了Albumin启动子具有体外转录活性，并且Dox可诱导活性uPA分子表达。在此基础上，我们分别制备了Tet-on-Albumin和TRE2-uPA两种转基因小鼠。实验结果显示Albumin启动子也具有体内转录活性，可调控性rtTA蛋白在Tet-on-Albumin转基因小鼠肝组织特异性表达。研究结果显示Dox可诱导uPA在Tet-on-Albumin/TRE2-uPA双转基因小鼠肝组织特异性表达，且渗漏表达率极低，Tet-on-Albumin/TRE2-uPA/SCID小鼠经Dox诱导后进行了HepG2和Huh-7细胞脾内移植。结果显示，其有效嵌合度可达30%，小鼠死亡率低于5%。本研究成功建立了一种肝组织特异性可诱导uPA转基因小鼠模型，并且以此为基础建立了可诱导型uPA转基因人肝嵌合小鼠模型，为进一步开展HCV感染研究以及抗病毒药物评价奠定了基础。（2）可诱导uPA转基因小鼠模型用于HBV转染及HCV感染研究本研究将可诱导Tet-on-Albumin/TRE2-uPA双转基因小鼠应用于pAAV-HBV水动力转染模型研究。结果显示，与Dox未诱导小鼠相比，Dox诱导的Tet-on-Albumin/TRE2-uPA双转基因小鼠转染pAAV-HBV后，HBV基因组在小鼠体内复制表达明显增加，小鼠肝脏炎性损伤显着加重，血清中白介素-6及肿瘤坏死因子α显着升高（p<0.01），肝组织病理损伤加重，AFP基因转录水平升高。相比于C57BL/6小鼠，可诱导Tet-on-Albumin/TRE2-uPA双转基因小鼠更适合HBV水动力转染模型的建立，其应用于uPA与HBV病毒复制及致病机制研究具有更显着的优势。此外，本研究以可诱导uPA转基因人肝嵌合小鼠模型为基础，进一步开展了HCV阳性血清感染研究。通过尾静脉接种HCV阳性血清后， HCV蛋白和RNA检测为阴性。其原因可能是HCV阳性血清感染滴度较低或小鼠种属特异性等综合因素所致，具体原因有待进一步探索。相比于直接利用阳性血清接种感染，利用具有高转导效率的载体介导HCV感染，其稳定性和有效性或将提高。可诱导uPA转基因小鼠模型的建立，为进一步开展HBV转染及HCV感染研究奠定了基础。2.第三代腺病毒介导的HCV全基因组细胞模型及小鼠模型研究现有的人肝嵌合小鼠模型属于免疫缺陷型小鼠，不能有效应用于肝炎病毒感染致病、免疫感染机制及疫苗研究和评价等方面。因此，建立非免疫缺陷型（即正常免疫状态）的可用于HCV复制与致病机制研究、疫苗及抗病毒药物评价的小鼠模型，已成为HCV模型研究新的重要方向。采用转基因技术或病毒载体介导病毒基因组建立相应的动物模型是值得探索研究的新的技术途径。为了建立具有正常免疫状态的HCV小鼠模型，本研究采用辅助病毒依赖型腺病毒（HDAd,helper-dependent adenovirus）载体介导HCV全基因组，探索建立制模简便而模型稳定的HCV新型细胞模型和小鼠模型。HDAd是第三代腺病毒载体，又称空壳载体，由于去除了腺病毒全部的编码反式作用蛋白的基因（功能由辅助病毒提供），仅保留了两端反向末端重复序列（ITRs, inverted terminal repeats）以及包装信号（Ψ），因而其包装容量高达37kb，可用于HCV全基因组的包装；而目前常用的其他病毒载体因包装容量限制，无法用于HCV约10kb全基因组的包装及递送。HDAd具有高滴度、高转导效率、低毒性以及肝组织嗜性等优点，也使其非常适合HCV全基因组呈递。本研究首次利用HDAd包装HCV全基因组，进行HCV全基因组细胞模型以及小鼠模型的建立和评价研究，以期为HCV复制与致病机制研究、疫苗及抗病毒药物评价提供一个新的技术手段。（1）第三代腺病毒介导的HCV全基因组细胞模型虽然近年来，HCV感染性细胞模型取得一定进展，以Huh-7细胞及其衍生细胞系为基础，先后建立了HCV2a型JFH1全基因组体外转录RNA瞬时转染细胞模型以及JFH1基因组cDNA稳定转染细胞模型，以上两种转染模型均能支持HCV的有效复制及病毒产生，但转染性细胞模型对转染细胞的状态和转染条件要求较高，其可重复性及稳定性有待进一步提高。本研究采用HDAd介导HCV全基因组感染的一种新的技术途径，探索建立操作简便和模型稳定的HCV感染细胞模型。首先在HCV2a型JFH1全基因组3’加入一个HDV核酶位点后将其连入HDAd载体中，通过辅助病毒AdNG163实现重组HDAdJFH1病毒的包装、扩增及梯度离心纯化，得到较高滴度的重组HDAdJFH1病毒，进而建立HDAd介导的HCV全基因组细胞模型。细胞免疫荧光、Western blot及Northern blot结果显示，HDAd介导了HCV core、NS3蛋白以及HCV RNA在Huh-7细胞中的有效表达。实时定量结果显示，细胞培养上清中HCV RNA水平最高可达1.8×107拷贝/ml。另外，上清再感染的细胞免疫荧光、抗体阻断以及透射电镜和免疫电镜结果均表明，细胞及培养上清中产生了感染性HCV病毒颗粒。实验研究表明，通过HDAd介导，我们建立了一种新型HCV感染性细胞模型，该模型可稳定连续传代，有效支持HCV复制及感染性HCV产生，HCV感染性滴度最高达1×103ffu/ml。同时该细胞模型也可用于α干扰素等抗病毒药物评价。实验结果还显示，HDAd同样能介导HCV1b型Con1全基因组感染性细胞模型的建立。这对建立不同基因型的HCV细胞模型和进行相关抗病毒药物评价等具有重要意义。（2）第三代腺病毒介导的HCV全基因组小鼠模型HCV具有高度种属特异性，仅能感染人和黑猩猩，不能自然感染小鼠，目前尚无法实现HCV在非免疫缺陷型小鼠体内复制和感染。本研究通过HDAd介导HCV全基因组小鼠模型的建立，通过辅助病毒AdNG163实现重组HDAdJFH1病毒的包装、扩增，经梯度离心纯化后，HDAdJFH1病毒滴度可达2×1011病毒颗粒数（viral particle, vp）/ml，将1×1010vp HDAdJFH1以及HDAdGFP病毒分别通过尾静脉注射入C57BL/6小鼠体内建立了由HDAd介导的HCV2a型JFH1全基因组小鼠模型。结果显示该小鼠模型可支持HCV的表达和复制，肝组织中可检测到HCV core、NS3蛋白以及HCV RNA，血清中HCV RNA水平可持续至感染后第8周。利用建立的HCV小鼠模型对抗-HCV药物miR-122拮抗剂进行了抗病毒效果评价，实验结果显示，miR-122拮抗剂在小鼠模型体内可有效抑制HCV的复制。该研究表明，建立的HDAd介导的HCV全基因组小鼠模型可应用于HCV药物研究和评价。这也为该模型在致病机制和疫苗评价等方面的研究奠定了基础。
吴静[5]（2010）在《慢性乙型肝炎患者不同免疫状态下外周血NK细胞亚群的特点及临床意义》文中指出目的:研究慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B ,CHB ）患者不同免疫状态下外周血自然杀伤细胞（natural killer cell,NK）亚群的表达特点,并探讨其与血清乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（hepatitis B virus deoxyribonucleic acid,HBV DNA）载量、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）水平之间的关系。方法:采用流式细胞术检测各研究组:健康对照组10例、慢性乙型肝炎患者46例,包括慢性乙型肝炎免疫耐受期组（immune tolerant phase: HBV-DNA>7 log10 copies/ml,ALT≤40U/ L）25例、慢性乙型肝炎免疫清除期组（immune clearance phase:HBV-DNA阳性,ALT>40U/L）21例的外周血NK细胞亚群的表达,以实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测血清HBV DNA载量,同时检测血清ALT水平。结果:健康对照组、CHB免疫耐受期组及免疫清除期组外周血中CD56bright NK细胞的比例分别为: 0.546±0.173,0.647±0.294,0.877±0.493;CD56bright NK细胞的比例在CHB免疫清除期组显着高于其它二组,并均有统计学差异（P<0.05）;但三组之间CD56dimNK细胞的比例无差异性。相关性分析显示,免疫耐受期组外周血CD56bright NK细胞的比例与血清HBV DNA载量呈负相关（P<0.05）,而免疫清除期组无此相关性。结论:外周血CD56bright NK细胞比例的增高可能是反映CHB患者免疫清除状态的指标之一;同时NK细胞及其亚群在抗HBV适应性免疫反应中发挥着重要的免疫调节作用。
姚相杰[6]（2007）在《杆状病毒介导的丙肝病毒可感染体外细胞培养体系的建立》文中进行了进一步梳理丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）是引起输血后及散在性的非甲非乙型肝炎（Non-A, Non-B Hepatitis, NANBH）主要病原体，世界上有超过1.7亿的HCV慢性感染者。HCV的感染已经成为一个世界性的医疗问题。缺乏稳定可靠的扩增HCV的体外细胞培养体系和动物模型曾长期阻碍HCV的研究和抗病毒药物的筛选。随着近年来HCV2a（JFH1）和相关嵌合型感染性克隆株cDNA的构建，这一状况有所改善。杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的DNA病毒，作为生物杀虫剂广泛应用于害虫防治。随着分子水平的基础研究迅猛发展，杆状病毒作为一种新型的基因转移载体受到人们的高度重视。本文把杆状病毒载体应用于HCV体外细胞培养体系的建立中。通过杆状病毒载体的介导把HCV JFH1亚型的全基因组cDNA导入敏感细胞Huh7-lunetT7中，在该细胞内稳定表达的T7RNA聚合酶的帮助下实现HCV基因组的转录和表达，从而建立一种新的HCV体外细胞培养体系。第一章以综述的形式介绍了HCV的病毒学特点和研究现状，系统回顾了HCV体外细胞培养体系的建立发展过程及存在的问题；同时介绍了杆状病毒的特点和作为基因转移载体在HCV研究中的应用。第二章主要研究了利用杆状病毒AcMNPV做载体在肝癌细胞中表达HCV基因组的情况。首先构建了含有HCVJFH1亚型全基因组cDNA的重组杆状病毒vAcJFH1和对照病毒vAcJFH1（GND），建立了稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系Huh7-lunetT7。然后把含有HCVJFH1全基因组的重组杆状病毒转导Huh7-lunetT7细胞来实现HCV全基因组的表达。RT-PCR、链特异性RT-PCR的检测结果显示在被转导的Huh7-lunetT7细胞内有HCV正负链的合成，而Real-time RT-PCR的结果则表明转导细胞的上清中HCV的基因拷贝数可以达到107拷贝／mL，而且HCV基因组拷贝数的增加和对照相比是一个动态变化过程，先逐步升高，当细胞密度太大的时候略有下降。Western-blot和免疫荧光分析表明HCV结构蛋白E2在转导后24h开始表达，NS5B蛋白在转导后12h开始表达，而且主要在细胞质中呈点状分布。电镜、免疫电镜显示在转导的细胞上清中可以检测到直径55nm左右的HCV病毒颗粒。蔗糖密度梯度离心则进一步证明这些HCV病毒颗粒存在于1.08-1.10克／mL的浮力密度梯度范围内。第三章进一步对一次转导产生的HCV病毒体的感染性进行了分析。把一次转导细胞的上清过滤后感染HCV敏感细胞系Huh7-lunet CD81，结果在被感染细胞内不仅检测到了HCV正负链的合成，还检测到了HCVE2蛋白的表达。这表明利用杆状病毒载体产生的HCV病毒体具有自然感染性，可以感染敏感细胞系Huh7-lunet CD81，并能在其中复制产生HCV负链RNA中间体和合成病毒蛋白。第四章则研究了HCV／HBV混合感染中的相互作用，特别是HCV蛋白对HBV启动子的调控作用。结果表明，HCV的NS2蛋白可以激活HBVX启动子的活性。论文首次利用杆状病毒载体系统在肝癌细胞中建立了一种可感染性的HCV体外细胞培养体系，在该体系中不仅能检测到HCV病毒颗粒的存在，而且能检测到HCV的复制。此外该体系利用T7启动子而非CMV启动子去实现HCV基因组在细胞质中的表达，转录产物5’端不加帽，不入核，更贴近HCV自然发生过程。该体系的建立为研究HCV的致病机理和疫苗研制、抗病毒药物筛选提供了一种新的平台。
闻晓波[7]（2006）在《新城疫病毒样颗粒的构建及其出芽机制的研究》文中研究指明病毒样颗粒（Virus-like particles,VLP）是指含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒,不含有病毒核酸,不能自主复制,其在形态上与真正病毒粒子相同或相似,俗称为伪病毒颗粒或假病毒颗粒。近年来,VLP技术在病毒的形态学研究、病毒的组装和出芽机制的研究以及某些传染病的疫苗开发上应用广泛。例如,在人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）、人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）、戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）和轮状病毒（Rotavirus）等诸多病毒的形态发生学、病毒装配、病毒的出芽机制以及高效疫苗开发等研究上均取得了可喜的进展,VLP技术发挥了越来越重要的作用。 新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是引起禽类急性、高度接触性传染病—新城疫（Newcastle disease,ND）的病原,给养禽业造成了严重经济损失,虽然有疫苗可用于该病的预防,但由于对病原的致病机理、免疫机理了解不充分,一直没能从根本上控制该病。迄今为止,对NDV的研究局限于针对单个基因的结构与功能方面,对各基因的功能及其编码蛋白之间的相互作用还不是很清楚。本研究针对NDV出芽机制不清楚和亚单位疫苗免疫效果不理想这一重要理论和实践问题,拟以VLP技术为突破口,阐明NDV出芽的主要机制和影响因素。 由于哺乳动物细胞的转录、转译和转译后修饰的保守性,在真核细胞中表达的重组蛋白可具备功能性,可进行结构与功能的分析以及蛋白质对细胞功能生理效应的分析。杆状病毒表达系统可为高水平表达的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境,能进行翻译后的加工修饰,此系统最突出的特点就是能获得重组蛋白高水平的表达。所以,本试验首次在哺乳动物细胞和昆虫细胞-杆状病毒表达系统建立NDV-LP的技术,并进一步研究VLP的形成和病毒的出芽机制,以及病毒与细胞之间相互作用的机理,并为研发新型的亚单位疫苗奠定基础。 在哺乳动物细胞表达系统中,分别构建了瞬时表达F48E9株NDV结构蛋白M、NP、F和HN的重组表达质粒pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN,采用脂质体转染HeLa细胞后。通过间接免疫荧光试验证明四个结构蛋白均能够瞬时表达成功。pCAGG-M、pCAGG-NP单独转染HeLa细胞后,进一步通过western blot试验检测到了M和NP蛋白的表达:同时pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN组合共转染HeLa细胞时,观察到明显的细胞融合现象。NDV的F蛋白为融合蛋白,具有细胞融合活性,但仅F蛋白的单独作用还不能诱导细胞融合,其功能的发挥还需要HN蛋白的协同作用。这一结果也佐证了所构建的重组表达质粒pCAGG-F和pCAGG-HN转染HeLa细胞后,F和HN蛋白得到了成功表达,并且具有功能活性。在证明重组质粒单独表达成功后,pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN共转染HeLa细胞,通过western blot在细胞培养上清中,检测到了四个结构蛋白的共表达。
廖小玲[8]（2006）在《用噬菌体随机肽库筛选hCD81模拟小肽》文中提出丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）感染引起的一种世界性传染病,目前全球HCV感染者近1亿7千万。HCV急性感染后约40-60%以上患者发展为慢性感染,其中部分病人可发展为肝硬化或肝癌。迄今为止,对HCV慢性感染尚无高效的特异性治疗方法。 HCV属于黄病毒家族,是单股正链RNA病毒,基因组全长约9.5kb,有一个大的开放阅读框,可翻译成一个约3000个氨基酸的多聚蛋白前体,该前体蛋白在宿主信号肽酶和病毒自身蛋白酶的加工下,产生结构蛋白（C,E1,E2,）和非结构蛋白（P7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A,NS5B等）。 HCV的包膜糖蛋白E2分布于病毒颗粒表面,可能与病毒和宿主间免疫应答及介导病毒进人靶细胞等过程密切相关,因此成为预防HCV感染研究中的主要角色。E2蛋白能与肝细胞表面的多种分子结合,其中,人CD81分子（hCD81）已被公认为是HCV的重要受体。虽然CD81介导HCV感染的机制尚不清楚,但是体外试验表明,CD81分子是HCV感染原代肝细胞以及肝源性肿瘤细胞所必需的。因此,靶向人CD81的模拟分子对于HCV感染的治疗有着应用前景,这也是目前HCV治疗药物领域的一个研究热点。 在本实验中,我们首先分别在哺乳动物细胞中表达了HCV E2蛋白和在大肠杆菌中表达了人CD81分子大胞外环。再以hCD81单抗为配基,从噬菌体12肽库中筛选hCD81模拟小肽,通过实验证明能竞争抑制HCV E2和hCD81的结合。 第一部分 HCV包膜E2蛋白和人CD81分子大胞外环的表达及HCV假病毒的构建 用中国仓鼠卵巢细胞（CHO）分泌表达HCV包膜E2蛋白。首先根据1b基因型HCV包膜E2蛋白编码基因的核苷酸序列设计并合成引物,以聚合酶反应（PCR）扩增HCV包膜E2蛋白外段基因;将neo基因插入真核表达质粒pCI-neo的内含子基因的剪切供体与剪切受体位点之间,而将HCV包膜E2蛋白基因置于Deo基因内含子的3′端,构建了新型的哺乳动物细胞表达质粒载体pCIDA-neo-E2。该质粒载体利用真核启动子高水平调控HCV包膜E2基因的表达,借助于内含子的剪切功能筛选用的标记基因（neo）仅低水平表达。以表达质粒pCIDA-neo-E2
贾帅争,胡锦辉,郑晓玲,吕丽萍,刘敏霞,詹林盛,王全立[9]（2005）在《应用水动力转染技术使人低密度脂蛋白受体、CD81和浸入诱导蛋白L同时在小鼠体内表达》文中研究指明为建立人低密度脂蛋白受体（LDLR）、CD81和浸入诱导蛋白L（Sip-L）等多个HCV感染相关分子共表达的转基因小鼠,首先分别构建了白蛋白启动子调控的人LDLR、CD81和Sip-L基因的小鼠肝脏组织特异性表达载体,将3种质粒同时采用水动力转染技术导入小鼠体内,RT-PCR和免疫组化技术检测转入体内基因的表达及持续时间。结果表明,转染8h后即可检测到3种基因在体内转录,人LDLR和CD81在转染1～4d后可在50%～90%的肝细胞中高效表达,7d后检测不到目的基因表达。为了进一步延长转染基因在小鼠体内的表达时间,又分别构建了人LDLR、CD81和Sip-L的染色体整合型表达载体,将它们与噬菌体ФC31的整合酶表达载体同时水动力转染小鼠,3种基因在体内表达时间可持续到转染后25d。以上结果表明建立了多个HCV感染相关分子共表达的转基因小鼠,为确定这些分子能否使小鼠感染HCV奠定了基础。
陆春玲[10]（2004）在《对虾白斑综合症病毒受体阻断剂的初步筛选》文中研究表明对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）自92年以来养殖一类宿主广且毒力强的对虾病原，给海水养殖业带巨大的经济损失。十几年来，各研究者从其组织病理学、免疫学、基因组学及蛋白质组学等深入分子生物学水平的研究，对该病原有了很深了解。然而有关其抗病毒药物的研究至今未见有报道， 本论文建立了96孔板上建立了对虾鳃膜受体蛋白和WSSV的特异结合模型，研究了二者结合的量比关系，及包被蛋白的最适量；还研究了TxitionX-100、SDS及NP40等表面活性剂对结合活性的影响，发现TxitionX-100和NP40可提高结合活性，而SDS则会使结合活性降低。通过本研究，改进了96孔板上病毒和鳃膜受体蛋白特异结合的技术。 研究了一些多糖对WSSV受体的阻断作用，筛选得到的三种多糖对WSSV的受体结合有很强的抑制作用。包被对虾鳃膜受体蛋白，使受体结合与固相载体上，然后加入多糖H处理过的地高辛标记的WSSV，实验结果发现，多糖H处理过的WSSV结合活性有很明显的降低；把WSSV包被于固相载体上，加入分别用多糖A及多糖P处理过的地高辛标记的对虾鳃膜受体蛋白，结果显示，二者对鳃膜受体蛋白结合活性也有很明显的抑制作用。进行了多糖H对健康虾的抑制感染研究，结果表明多糖H对WSSV的感染有一定程度的抑制作用。揭示了多糖抗WSSV感染的可行性。 通过毕赤酵母表达系统成功表达了WSSV的两个粘附蛋白VP281及VP292，96孔板上分析其结合活性，结果显示VP281有很强的结合活性，提示了酵母表达的VP281能保持其原有的生物活性；分别研究VP292、VP281及其阳离子交换层析柱得到纯化样品对WSSV的受体阻断作用，发现都有很强的抑制效果，进一步说明二者特别是VP281在WSSV侵染过程中的重要性。阐明了VP281是WSSV的一个关键性粘附蛋白，同时也揭示了抗病毒策略的另一条途径是酵母表达产物的应用。
二、人CD81分子的肝组织特异性稳定表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人CD81分子的肝组织特异性稳定表达（论文提纲范文）
（1）干扰素诱导跨膜蛋白抑制痘苗病毒作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 内源性抗病毒免疫研究进展 |
| 1.1 病毒性疾病流行的严峻形势 |
| 1.2 内源性免疫概述 |
| 1.3 病毒诱导的干扰素抗病毒反应 |
| 1.4 干扰素刺激基因与宿主限制因子 |
| 1.5 内源性限制因子与天然免疫 |
| 1.6 内源性限制因子与病毒进化关系 |
| 1.7 结语 |
| 第2章 IFITMs 家族蛋白结构与功能 |
| 2.1 IFITMs 作为内源性限制因子的发现 |
| 2.2 IFITMs 抗病毒谱 |
| 2.3 IFITMs 定位、结构与翻译后修饰 |
| 2.4 IFITMs 蛋白作用模式与机制 |
| 2.5 小结 |
| 2.6 立题依据 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 人 IFITMs 基因克隆、鉴定及其抗痘苗病毒作用初探 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 稳定表达人 IFITMs 基因细胞系的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 人 IFITMs 抑制痘病毒感染与复制 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 人 IFITM3 抑制痘苗病毒感染机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 痘苗病毒感染对 IFITMs 蛋白表达影响及 IFITM3 相互作用分子筛选 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表学术论文及主要科研成果 |
| 导师及作者简介 |
| 致谢 |
（2）hESCs来源的肝系细胞构建HCV易感的细胞模型和人源化小鼠模型研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 hESCs 肝向诱导分化体系建立及 HCV 感染规律研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 VEGF 调节分化细胞极性从而改变其对 HCV 易感性的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 基于 hESCs 的人源化肝脏小鼠模型构建及其 HCV 易感性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 IFN-β-siRNA 干扰提高 HCV 感染性的体内/外研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（3）HCV小鼠模型的建立及其在肝脏免疫损伤研究中的应用（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 肝脏特异性稳定转染技术的探索与应用 |
| 前言 |
| 第一节 眼底静脉丛水动力转染技术的建立 |
| 实验材料及方法 |
| 实验结果 |
| 第二节 密码子优化的噬菌体整合酶介导外源基因在小鼠肝脏长期稳定表达 |
| 实验材料及方法 |
| 实验结果 |
| 第三节 基于水动力转染和整合酶技术建立HCV基因组肝脏长期表达小鼠模型 |
| 实验材料及方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 HCV促进小鼠肝脏免疫损伤的机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 HCV对小鼠肝脏免疫细胞的影响 |
| 实验材料及方法 |
| 实验结果 |
| 第二节 HCV促进Con A诱导的小鼠肝脏损伤及其免疫学机制 |
| 实验材料及方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 文章发表 |
（4）新型HCV感染细胞模型及小鼠模型研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 肝组织特异性可诱导uPA转基因小鼠模型研究 |
| 第一节 可诱导uPA转基因人肝嵌合小鼠模型的建立及鉴定 |
| 第二节 诱导型uPA转基因小鼠模型用于HBV转染及HCV感染研究 |
| 第二部分 第三代腺病毒介导的HCV全基因组细胞模型及小鼠模型研究 |
| 第一节 第三代腺病毒介导的HCV全基因组细胞模型研究 |
| 第二节 第三代腺病毒介导的HCV全基因组小鼠模型研究 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 论着 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）慢性乙型肝炎患者不同免疫状态下外周血NK细胞亚群的特点及临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| NK细胞在慢性病毒感染中的作用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 乙型肝炎病毒小鼠动物模型建立的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章及参加国际会议交流情况 |
| 致谢 |
（6）杆状病毒介导的丙肝病毒可感染体外细胞培养体系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 丙肝病毒简介 |
| 2 HCV复制感染细胞培养体系的建立 |
| 3 HCV感染的动物模型 |
| 4 杆状病毒载体应用的研究 |
| 5 杆状病毒载体在HCV研究中的应用 |
| 6 本论文研究的内容和意义 |
| 第二章 杆状病毒介导的HCVJFH1基因组在肝癌细胞中的表达 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 杆状病毒载体介导产生的HCV病毒体的感染性的验证 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 丙肝病毒和乙肝病毒混合感染中丙肝病毒蛋白对乙肝病毒启动子的调控 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 发表文章目录 |
| 致谢 |
（7）新城疫病毒样颗粒的构建及其出芽机制的研究（论文提纲范文）
| 第一章 绪论 |
| 1 VLP在基础研究中的应用 |
| 1.1 VLP在病毒形态发生学方面的研究 |
| 1.2 VLP在病毒组装和复制过程中的研究 |
| 1.3 VLP在囊膜病毒出芽过程中的研究 |
| 2 病毒样颗粒在预防医学和疫苗开发中的应用 |
| 2.1 VLP在HIV的研究与应用 |
| 2.2 VLP在HPV的研究与应用 |
| 2.3 VLP在HCV的研究与应用 |
| 2.4 VLP在HEV的研究与应用 |
| 2.5 在其他病毒性疫苗研制中的作用 |
| 3 耦联VLP疫苗 |
| 4 VLP在分子载体中的研究应用 |
| 5 VLP在免疫测定中的应用 |
| 5.1 在抗原检测中的应用 |
| 5.2 在抗体检测中的应用 |
| 6 存在的问题与展望 |
| 7 本研究的目的与意义 |
| 第二章 新城疫病毒样颗粒在哺乳动物细胞内的出芽 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2.1 质粒与菌株 |
| 2.2.2 酶与标记物 |
| 2.2.3 细胞培养用试剂 |
| 2.2.4 仪器设备 |
| 2.2.5 引物 |
| 2.2.6 DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 M、NP、F和HN基因的克隆 |
| 2.2.8 重组表达载体的构建 |
| 2.2.9 重组质粒的纯化 |
| 2.2.10 间接免疫荧光试验 |
| 2.2.11 重组质粒共转染HeLa细胞 |
| 2.2.12 重组质粒共转染Vero细胞 |
| 2.2.13 抗NDV M和NP蛋白阳性血清的制备 |
| 2.2.14 Western blot检测M、NP蛋白的表达 |
| 2.2.15 Western blot检测M、NP、F和HN蛋白的共表达 |
| 2.2.16 透射电镜样品的制备 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 重组质粒的构建 |
| 2.2.2 间接免疫荧光试验 |
| 2.2.3 pCAGG-M与pCAGG-NP、pCAGG-F、pCAGG-HN组合共转染HeLa细胞 |
| 2.2.4 pCAGG-M与pCAGG-NP、pCAGG-F、pCAGG-HN组合共转染Vero细胞 |
| 2.2.5 原核表达NDV的M蛋白和NP蛋白 |
| 2.2.6 western blot检测M和NP蛋白在HeLa细胞上的表达 |
| 2.2.7 western blot检测M、NP、F和HN蛋白在HeLa细胞上的共表达 |
| 2.2.8 透射电镜结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 新城疫病毒样颗粒在昆虫细胞内的出芽 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 质粒与菌株 |
| 3.1.2 酶与标记物 |
| 3.1.3 扩增引物 |
| 3.1.4 突变引物 |
| 3.1.5 F和NP基因的点突变过程 |
| 3.1.6 M和HN基因的扩增 |
| 3.1.7 M、NP、F和HN全长基因的亚克隆 |
| 3.1.8 pAcAB4-F、pAcAB4-F-NP-M和pAcAB4-F-NP-M-HN杆状病毒转移载体的构建 |
| 3.1.9 pAcAB4-NP、pAcAB4-NP-M和pAcAB4-NP-M-HN杆状病毒转移载体的构建 |
| 3.1.10 pAcAB4-M和pAcAB4-HN杆状病毒转移载体的构建 |
| 3.1.11 转染用质粒的纯化 |
| 3.1.12 Sf9昆虫细胞的复苏 |
| 3.1.13 转染昆虫细胞 |
| 3.1.14 重组杆状病毒的PCR鉴定 |
| 3.1.15 蚀斑纯化重组杆状病毒 |
| 3.1.16 间接免疫荧光试验 |
| 3.1.17 M，NP，F和HN蛋白的共表达 |
| 3.1.18 M，NP，F和HN蛋白的单独表达 |
| 3.1.19 细胞超薄切片样品制作和观察 |
| 3.1.20 透射电镜观察VLP结构 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 F和NP基因的点突变 |
| 3.2.2 M和HN基因的克隆 |
| 3.2.3 杆状病毒转移载体的构建过程 |
| 3.2.4 蚀斑纯化重组杆状病毒的PCR鉴定 |
| 3.2.5 间接免疫荧光试验结果 |
| 3.2.6 M，NP，F和HN蛋白在昆虫细胞内的共表达 |
| 3.2.7 M，NP，F和HN蛋白在昆虫细胞内的单独表达 |
| 3.2.8 细胞超薄切片 |
| 3.2.9 负染电镜结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 简历 |
（8）用噬菌体随机肽库筛选hCD81模拟小肽（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 HCV包膜E2蛋白和人CD81分子大胞外环的表达及 HCV假病毒的构建 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 hCD81样模拟小肽的随机肽库筛选与活性鉴定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）应用水动力转染技术使人低密度脂蛋白受体、CD81和浸入诱导蛋白L同时在小鼠体内表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 小鼠肝脏特异性启动子调控的人LDLR、CD81和Sip-L的真核表达载体的构建 |
| 1.3 小鼠肝脏特异性启动子调控的人LDLR、CD81和Sip-L的染色体整合型表达载体的构建 |
| 1.4 人LDLR、CD81和Sip-L基因的体内水动力转染 |
| 1.5 RT-PCR |
| 1.6 免疫组化 |
| 2 结果 |
| 2.1 水动力转染使GFP报告基因在小鼠体内表达 |
| 2.2 人LDLR、CD81、SIP-L在小鼠体内的同时表达及持续时间 |
| 2.3 噬菌体ФC31整合酶介导的人LDLR、CD81、SIP-L在小鼠体内的同时表达及持续时间 |
| 3 讨论 |
（10）对虾白斑综合症病毒受体阻断剂的初步筛选（论文提纲范文）
| 第一章 引言 |
| 第一节 WSSV的生物学特征及其分子生物学研究状况 |
| 1 白斑综合症病毒的宿主及传播途径 |
| 2 白斑综合症病毒病的病症及病理学 |
| 3 WSSV的生物学特征 |
| 4 WSSV的主要结构蛋白 |
| 参考文献 |
| 第二节 动物病毒受体阻断剂的研究现状 |
| 1 病毒-细胞受体相互作用的机制 |
| 2 病毒受体和病毒粘附蛋白的本质 |
| 2.1 病毒受体的本质 |
| 2.2 病毒粘附蛋白 |
| 3 主要的病毒受体阻断剂 |
| 3.1 多糖及其衍生物对病毒-细胞受体作用的影响 |
| 3.2 其他 |
| 参考文献 |
| WSSV受体阻断的研究现状 |
| WSSV受体阻断可供选择的途径 |
| 本论文拟采取的技术路线 |
| 第二章 对虾鳃细胞膜蛋白与病毒的特异结合及表面活性剂对结合活性的影响 |
| 第一节 病毒及对虾鳃膜蛋白的纯化与标记 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 人工感染螯虾实验 |
| 1.2 病毒纯化 |
| 1.3 Broadford法对病毒蛋白定量 |
| 1.4 病毒地高辛标记 |
| 1.5 标记结果的验证 |
| 1.6 病毒蛋白的SDS-PAGE多肽分析 |
| 1.7 虾鳃膜蛋白的提取 |
| 1.8 虾鳃膜蛋白的蛋白定量及地高辛标记 |
| 1.9 鳃膜蛋白的SDS-PAGE带型分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的纯化 |
| 2.2 病毒的蛋白定量 |
| 2.3 病毒的标记结果验证 |
| 2.4 病毒蛋白的SDS-PAGE多肽分析 |
| 2.5 虾鳃膜蛋白的提取 |
| 2.6 虾鳃膜蛋白的蛋白定量 |
| 2.7 鳃膜蛋白的SDS-PAGE带型分析 |
| 3 讨论 |
| 本节使用的试剂与缓冲液配置方法 |
| 第二节 96孔板上虾鳃膜蛋白与病毒特异结合的量比关系及表面活性剂对结合活性的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 虾鳃膜蛋白 |
| 1.2 病毒蛋白 |
| 1.3 96孔板上鳃膜蛋白与地高辛标记的病毒蛋白特异结合的正交实验 |
| 1.4 DIG-WSSV和虾膜蛋白结合饱和浓度的测定 |
| 1.5 96孔板上病毒蛋白和地高辛标记的鳃膜蛋白特异结合正交实验 |
| 1.6 DIG-虾膜蛋白和WSSV结合饱和浓度的测定 |
| 1.6 冷冻保存的虾膜蛋白和新鲜虾膜蛋白结合活性的比较 |
| 1.7 表面活性剂对结合活性的影响 |
| 2 结果 |
| 2.1 96孔板上鳃膜蛋白与地高辛标记的WSSV特异结合的正交实验 |
| 2.2 地高辛标记的病毒和虾膜蛋白结合饱和量 |
| 2.3 96孔板上病毒蛋白和地高辛标记的鳃膜蛋白特异结合的正交实验 |
| 2.4 DIG-虾膜蛋白与WSSV结合饱和量 |
| 2.5 冷冻保存的虾膜蛋白和新鲜虾膜蛋白结合活性的比较 |
| 2.6 表面活性剂对结合活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 本文所用的溶液试剂配方 |
| 第三章 多糖H等多糖对WSSV的受体阻断研究 |
| 第一节 多糖在亚细胞水平上的WSSV受体阻断初步筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒提纯和蛋白定量及地高辛标记 |
| 1.2 虾鳃膜蛋白的提取和蛋白定量及地高辛标记 |
| 1.3 多糖H对鳃膜蛋白与病毒结合的抑制实验 |
| 1.4 多糖P对鳃膜蛋白与病毒结合的竞争抑制实验 |
| 1.5 多糖A对鳃膜蛋白与病毒结合的竞争抑制实验 |
| 1.6 硫酸软骨素对鳃膜蛋白与病毒结合的竞争抑制实验 |
| 1.7 硫酸葡聚糖对鳃膜蛋白与病毒结合的竞争抑制实验 |
| 2 结果 |
| 2.1 多糖H对鳃膜蛋白与病毒结合的竞争抑制实验: |
| 2.2 多糖P、多糖A、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖对鳃膜蛋白与病毒结合的竞争抑制实验: |
| 3 讨论 |
| 第二节 多糖H对健康虾的感染抑制实验 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验用虾及分组 |
| 1.2 毒种的处理 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验的结果检测和评估 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 酵母表达产物对WSSV的受体阻断研究 |
| 第一节 表达产物VP281和VP292的检测及结合活性的分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 VP37、VP39菌株的大量发酵及发酵产物的制备 |
| 1.2 VP281、VP292酵母表达产物的SDS-PAGE检测 |
| 1.3 表达产物与虾膜蛋白结合活性的分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 VP281、VP292酵母表达产物的SDS-PAGE检测 |
| 2.2 VP281和VP292与鳃膜蛋白结合活性的分析 |
| 3 讨论 |
| 第二节 VP292、VP281及其层析柱分离纯化组分对WSSV受体阻断研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒的分离纯化及定量 |
| 1.2 鳃膜蛋白的提取及标记 |
| 1.3 VP281的阳离子交换层析法纯化 |
| 1.4 表达产物及纯化组分的Broadford蛋白定量 |
| 1.5 VP281及其层析柱分离纯化后的竞争抑制实验 |
| 1.6 VP292酵母表达产物的竞争抑制实验 |
| 2 结果 |
| 2.1 VP281的阳离子交换层析纯化SDS-PAGE检测 |
| 2.2 表达产物及纯化组分的蛋白定量 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 本节的试剂配方 |
| 本研究工作的结论 |
| 致谢 |
四、人CD81分子的肝组织特异性稳定表达（论文参考文献）
- [1]干扰素诱导跨膜蛋白抑制痘苗病毒作用及其机制研究[D]. 杜寿文. 吉林大学, 2015(08)
- [2]hESCs来源的肝系细胞构建HCV易感的细胞模型和人源化小鼠模型研究[D]. 闫舫. 中国人民解放军军事医学科学院, 2014(01)
- [3]HCV小鼠模型的建立及其在肝脏免疫损伤研究中的应用[D]. 阎少多. 中国人民解放军军事医学科学院, 2014(01)
- [4]新型HCV感染细胞模型及小鼠模型研究[D]. 周小军. 中国人民解放军军事医学科学院, 2012(10)
- [5]慢性乙型肝炎患者不同免疫状态下外周血NK细胞亚群的特点及临床意义[D]. 吴静. 南京医科大学, 2010(02)
- [6]杆状病毒介导的丙肝病毒可感染体外细胞培养体系的建立[D]. 姚相杰. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）, 2007(06)
- [7]新城疫病毒样颗粒的构建及其出芽机制的研究[D]. 闻晓波. 中国农业科学院, 2006(10)
- [8]用噬菌体随机肽库筛选hCD81模拟小肽[D]. 廖小玲. 第二军医大学, 2006(09)
- [9]应用水动力转染技术使人低密度脂蛋白受体、CD81和浸入诱导蛋白L同时在小鼠体内表达[J]. 贾帅争,胡锦辉,郑晓玲,吕丽萍,刘敏霞,詹林盛,王全立. 生物技术通讯, 2005(04)
- [10]对虾白斑综合症病毒受体阻断剂的初步筛选[D]. 陆春玲. 中国海洋大学, 2004(01)