一、三种基因导入系统对视网膜色素上皮细胞转染效率的研究（论文文献综述）
由佳鑫[1]（2021）在《干细胞外泌体miR-141对视网膜氧化应激损伤的保护作用及机制》文中认为背景:年龄相关性黄斑变性（Age related macular degeneration,AMD）是一种常见的致盲性眼病,主要是由于黄斑部的退行性病变引起。目前对AMD的发病因素尚不完全清楚,但有研究发现氧化应激在AMD发生发展机制中发挥重要作用,过度的氧化应激反应会造成视网膜色素上皮细胞（RPE细胞）功能紊乱。视网膜光损伤模型是研究AMD的常用体内模型之一,其发病的重要机制是视网膜感光细胞和RPE细胞中的光敏物质吸收可见光中的过量光子,产生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）,当ROS物质在细胞内持续聚集并且无法被抗氧化因子所清除时,其介导的氧化应激反应会导致RPE细胞的损伤、蛋白质变性、细胞膜结构破坏最终导致细胞凋亡。RPE细胞是视网膜中主要的细胞成分之一,其功能的改变对视网膜相关疾病（视网膜炎、视网膜变性及营养不良、视网膜剥离）的发生和发展至关重要。目前大多数学者采用白色LED冷光源来诱发光损伤动物模型,选择白光来模拟日光对视网膜的损伤,从而构建类似于AMD的动物模型。氧化应激是机体在遭受各种有害物质刺激时,体内高活性分子如ROS自由基产生过多,使得氧化系统和抗氧化系统动态失衡,从而导致组织损伤。研究发现,NF-E2相关因子2（NF-E2-related factor 2,Nrf2）通过与抗氧化反应原件（anti-oxidative response element,ARE）相互作用调节编码抗氧化蛋白,是重要的内源性抗氧化应激通路之一。生理状态下,Nrf2与Kelch样关联蛋白1（Kelch-like ECH2 associated protein 1,Keap1）结合,并通过Keap1蛋白将其锚定于由肌动蛋白构成的细胞骨架上,从而无法进入细胞核发挥转录活性。当受到ROS刺激时,Keap1与Nrf2解耦联使得Nrf2转移入核,启动下游保护性蛋白基因的转录,提高细胞抗氧化应激能力。微RNA（micro RNA,miRNA）是一类单股的、长20-25个核苷酸短序列,通过与其靶信使核糖核酸（m RNA）的3’UTR完全或不完全配对,在转录后水平调节基因的表达,每个miRNA可以干扰很多m RNAs,反之每个信使核糖核酸可以监管多个miRNA。近年来研究表明,在人类的基因组中大约有900多种独特的miRNA,并且1/3的基因是被miRNAs调控的。miRNAs在人类及动物的各种生理及病理过程中起重要作用,它们可以参与控制一些生物过程,包括细胞生长、凋亡、发育、新陈代谢、压力调适、激素信号通路和分化等。miRNA-141（miR-141）是miRNA-200（miR-200）家族的成员,通过调节不同的信号通路,在生理状态和疾病发生、发展过程中发挥重要作用。骨髓间充质细胞具有高度自我更新、多向分化和免疫调节功能的干细胞,已成为再生医学中组织器官修复研究的热点细胞。干细胞在眼科领域的研究也有报道,如视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、角膜缘干细胞缺乏和视神经损伤等。而干细胞被证实能够分化为RPE细胞、神经样细胞、光感受器细胞。同时干细胞能够分泌多种细胞因子和神经营养因子,对抗局部炎症反应,起到对视网膜细胞的保护作用,改善视网膜的微环境。骨髓间充质干细胞发挥生物学功能可能是通过旁分泌的外泌体实现的。外泌体是一种由活细胞分泌的脂质双分子层结构,其内包含许多分子调控物质如脂质、蛋白质和核酸。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型,其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等病理生理学过程。随着外泌体提取及检测技术的不断成熟,干细胞分泌的可改善视网膜微环境的细胞因子均可在干细胞分泌的外泌体中检测出来。新近研究显示,干细胞分泌的外泌体中不仅含有各种保护性营养因子,还含有能够促进这些营养因子转录和翻译的调控因子。因此,针对干细胞外泌体的研究已成为当下研究热点。外泌体作为纳米级别的运输载体,较干细胞相比体积更小,而且免疫原性更低,被认为可能成为未来进行细胞治疗的理想载体。目的:本研究主要探讨骨髓间充质干细胞外泌体中miR-141对视网膜氧化应激损伤的保护作用及机制。方法:1.骨髓间充质干细胞外泌体的提取与鉴定:对骨髓间充质干细胞培养基上清液进行超高速离心,获得囊泡物质。对提取的囊泡物质进行电镜观察及特异性膜蛋白CD9,CD63,CD81的检测。2.骨髓间充质干细胞外泌体对RPE细胞氧化应激损伤的保护作用:将50μg/ml骨髓间充质干细胞外泌体加入到RPE细胞培养基中,对照组RPE细胞培养基中加入等体积PBS溶液。应用H2O2诱导建立RPE细胞氧化应激损伤模型。比较两组RPE细胞活力值,细胞凋亡水平,caspase-9表达水平,Bcl2和Bax的表达水平。3.miR-141/Keap1/Nrf2通路在RPE细胞氧化应激反应中的分子机制:通过查阅文献发现Keap1-Nrf2-ARE通路是抗氧化应激损的经典通路。利用Targe Ssan在线生物信息分析软件对与Keap1有潜在结合位点的miRNA进行预测。通过荧光素酶报告基因实验验证预测的miR-141与Keap1的结合位点。分别过表达或抑制miR-141后,1)q PCR和蛋白电泳检测Keap1、Nrf2、HO-1和NQO1的表达水平。2)MTS检测细胞活力值。3)caspase-9活性试剂盒检测细胞凋亡水平。过表达miR-141后,应用Nrf2抑制物进行补救实验,观察miR-141是否通过Nrf2发挥抗氧化的保护作用。通过q PCR和蛋白电泳检测Keap1、Nrf2、HO-1和NQO1的m RNA和蛋白表达水平,观察RPE细胞活力值以及细胞凋亡水平。4.骨髓间充质干细胞外泌体miR-141对RPE细胞氧化应激损伤的保护作用:分别提取过表达miR-141的骨髓间充质干细胞外泌体、抑制miR-141的骨髓间充质干细胞外泌体和正常的骨髓间充质干细胞外泌体,将三组外泌体分别加入RPE细胞培养基中共培养48h后,用200μM H2O2对RPE细胞诱导6h,之后检测过表达miR-141或抑制miR-141的BMSCs-exo对于RPE细胞氧化应激损伤的作用,1)q PCR和蛋白电泳检测HO-1、NQO1和caspase 9的表达水平。2)MTS检测细胞活力值。3)caspase-9活性试剂盒检测细胞凋亡水平。5.骨髓间充质干细胞外泌体对急性视网膜光损伤的保护作用:用LED灯构建小鼠急性视网膜光损伤模型。将骨髓间充质干细胞外泌体注射入小鼠的玻璃体腔内,对照组为对侧眼等量PBS玻璃体腔注射,组织HE染色观察视网膜形态学改变,q PCR和蛋白电泳检测Bcl2、Bax、HO-1、NQO1和caspase-9的表达水平。结果:1.骨髓间充质干细胞外泌体的提取与鉴定:对超高速离心法提取的骨髓间充质干细胞上清液中的囊泡物质进行鉴定。电镜下发现囊泡为直径大小约100nm左右的双层膜结构,具备外泌体的形态学特征。结合蛋白电泳CD9,CD63和CD81抗体阳性,说明所提取的囊泡为外泌体。2.骨髓间充质干细胞外泌体对RPE细胞氧化应激损伤的保护作用:将50μg/ml骨髓间充质干细胞外泌体加入到RPE细胞培养基中,发现预先加入外泌体的RPE细胞在H2O2的诱导下,较未加入外泌体的RPE细胞的细胞活力值高,细胞凋亡水平下降,m RNA和蛋白水平检测结果显示caspase-9表达降低,Bax表达降低而Bcl2表达升高。3.miR-141/Keap1/Nrf2通路在RPE细胞氧化应激反应中的分子机制:生物信息分析（Target Scan在线预测网站）预测Keap1与miR-141之间有潜在的结合位点。荧光素酶报告基因实验证实miR-141和Keap1在293T细胞中具有可结合性。对miR-141可能通过Keap1激活Nrf2抗氧化应激通路这一推测进行体外实验,发现过表达miR-141能够抑制Keap1,使得Nrf2与Keap1偶联减少,Nrf2转移入核增多,在核内开启HO-1和NQO1的转录和翻译。抑制miR-141能够减少其对Keap1的抑制作用,使得Nrf2转移入核减少,从而降低HO-1和NQO1的转录和翻译。4.骨髓间充质干细胞外泌体miR-141对RPE细胞氧化应激损伤的保护作用:发现和对照组比过表达miR-141的骨髓间充质干细胞外泌体使得H2O2诱导的RPE细胞活力值升高,caspase-9活性降低,HO-1和NQO1的蛋白和m RNA表达水平升高,从而减轻了H2O2诱导的RPE细胞氧化应激损伤。但是抑制miR-141的骨髓间充质干细胞外泌体使得H2O2诱导的RPE细胞活力值降低,caspase-9活性升高,HO-1和NQO1的蛋白和m RNA表达水平降低。5.骨髓间充质干细胞外泌体对急性视网膜光损伤的保护作用:玻璃体腔注射骨髓间充质干细胞外泌体的小鼠和对照组相比在光损伤模型中外核层细胞损伤数目明显减少,并且视网膜内HO-1和NQO1的蛋白和m RNA表达水平升高,而caspase-9的蛋白和m RNA表达水平降低。结论:1.应用超高速离心法可以提取骨髓间充质干细胞外泌体。2.骨髓间充质干细胞外泌体对H2O2诱导的RPE细胞氧化应激损伤具有保护作用。3.荧光素酶报告基因实验证实miR-141与Keap1之间具有可结合性。miR-141/Keap1/Nrf2信号通路在RPE细胞氧化应激过程中起到保护性调控作用。4.骨髓间充质干细胞外泌体中的miR-141对RPE细胞氧化应激损伤具有保护作用。5.体内实验证实骨髓间充质干细胞外泌体对急性视网膜光损伤具有保护作用。
蔡丹瑞,沈吟[2]（2020）在《腺相关病毒在视觉系统神经示踪及眼科治疗中的应用进展》文中认为腺相关病毒（AAV）属微小病毒科。目前血清型AAV有12种,其因低免疫原性、无致病性、宿主范围广、可长期表达等优点,成为眼科非跨突触病毒示踪和基因治疗中的重要载体,包括携带荧光蛋白后在视觉传导通路中的示踪技术、加入特定元件实现靶向结合基因组修饰、作为病毒载体进行基因治疗等多种应用方式的实现。但AAV载体仍存在一些问题,如对靶向细胞的感染效率和特异性不高以及在临床试验中机体免疫反应较重等。因此,未来仍需对AAV的病毒生物学特性进行深入研究。
才源[3]（2020）在《新型Cas9/RecA基因编辑技术治疗视网膜色素变性》文中指出视网膜色素变性是一种以视杆和视锥光感受器细胞丧失为特征的遗传性视网膜疾病,是进行性视力丧失和遗传性失明的主要原因。光感受器细胞是视网膜内的感觉神经元,它们将光信号转换为电信号传递到下游,再到高级中枢,以进行视觉信号处理。患有视网膜色素变性的患者最初由于失去视杆细胞产生夜盲的表型,其次是由于继发的视锥细胞变性而导致的白天视力丧失。PDE6B基因编码鸟嘌呤3’,5’-磷酸二酯酶6 β亚基,参与到视杆细胞光信号转导过程中,约占常染色体隐性遗传视网膜色素变性病因的4%至5%。无视杆小鼠（rd1小鼠）是视网膜色素变性小鼠模型,在Pde6b基因中发生一个单碱基的点突变（Y347X,从C到A）。突变小鼠表现出早发的严重的视杆细胞变性,导致进行性视力丧失并最终完全失明。因此,rd1小鼠是用于推进视网膜色素变性疾病治疗方法研究的合适的动物模型。之前,已有研究工作开发了多种策略来拯救rd1小鼠中的光感受器细胞变性,例如补充缺失基因的腺相关病毒（AAV）载体或促进细胞存活的小分子药物,以及小鼠受精卵基因编辑,但是这些方法都显示出明显的缺点,例如效率低或无法进行基因校正以维持持久的表型等,而大多数人类遗传疾病是在出生后诊断出来的,受精卵操作手段对此并无助益。因此,需要建立具有更高在体基因编辑效率的基因编辑新策略,以在出生后动物模型中进行精确的基因编辑。簇状规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）-Cas9是一种已广泛用于基因工程中的基因编辑技术。CRISPR-Cas9技术依靠单向导RNA指导Cas9在目标基因位点上产生DNA双链断裂,断裂可以通过非同源末端连接（NHEJ）修补或依赖DNA模板进行同源性定向修复（HDR）途径,其中NHEJ已被广泛用于基因敲除。但是,NHEJ是易于出错的基因组编辑途径,可在DSB中引入其他插入或缺失。相反,尽管被认为效率低下并且依赖于细胞分裂,HDR依然是广泛应用于种系或可增殖细胞的基因组编辑的高保真途径。然而,哺乳动物成熟组织中的大多数细胞,包括神经元,随着成熟而丧失其增殖能力。因此,Cas9介导的HDR途径很少在成熟组织和细胞中应用。因此,我们旨在设计一种基于HDR的基因组编辑技术,以精确纠正视网膜色素变性治疗出生后的rd1小鼠视网膜中的基因突变。大肠杆菌重组酶A（RecA）蛋白可以提高哺乳动物和植物细胞中的同源重组效率。RecA是5’-三磷酸腺苷（ATP）依赖性的DNA结合蛋白,可在同源重组中催化DNA链交换反应。这些事实促使我们研究在Cas9介导的基因组编辑中添加细菌RecA蛋白是否可以特异性增加HDR的频率,因此我们开发了一种Cas9/RecA技术,该技术融合了化脓性链球菌Cas9（spCas9）和靶向sgRNA的RecA,以纠正出生后rd1小鼠体内的基因突变,从而提高了体内HDR效率。我们的研究表明,在体外和体内,使用Cas9/RecA系统均可提高HDR效率。且该系统在有丝分裂和退出有丝分裂的感光细胞中,都可以大幅度提高HDR效率,从而修复错误基因、提升感光细胞存活。更重要的是,视觉行为学范式瞳孔光反射和离体视网膜电图ERG显示,修复后小鼠视网膜显示出明显的ERG信号和瞳孔光反射提升,表明rd1小鼠视觉能力得以一定程度的修复。综上,本研究建立了一种改进的基于HDR的基因修复系统,实现了退出有丝分裂神经元的在体精准基因修复,一定程度上表明了从源头治疗此种单基因突变导致的眼盲疾病的理论可行性,具有重要的科学和临床意义。
蔡斌翠[4]（2019）在《蛋白组学分析吸烟对ARMS2/HTRA1高危型RPE细胞的影响及优化干细胞系建立》文中认为目的1、通过基于iTRAQ技术的蛋白质谱分析对吸烟者血清和非吸烟者血清作用于ARMS2/HTRA1高危型及野生型RPE细胞前后蛋白质谱的测定,筛选组间差异蛋白,并对其进行功能和通路富集分析,探究吸烟与ARMS2/HTRA1高危基因型在AMD发病中的作用机制,寻找二者之间关联及影响的直接证据。2、应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对干细胞进行靶基因修饰,建立ARMS2高危型、HTRA1高危型纯合优化干细胞系,从而达到将紧密连锁的ARMS2/HTRA1高危基因分开研究的目的,为之后特异性的分析ARMS2以及HTRA1的分子生物学特性,明确AMD真正的致病基因提供了细胞模型。方法1、从预筛选的健康人群分别收集吸烟者血清和非吸烟者血清,探索最佳血清作用浓度。收集角膜移植后的供体眼球,分离培养ARMS2/HTRA1高危型及野生型个体来源的人原代RPE细胞。同时,将ARMS2/HTRA1高危型及野生型个体来源的iPSCs定向诱导分化为iPSCs-RPE细胞。将预混的吸烟者血清和非吸烟者血清分别作用于ARMS2/HTRA1高危型及野生型的原代RPE细胞7天后,提取各实验组的细胞总蛋白,进行基于iTRAQ技术的蛋白质谱检测,Q-Exactive质谱仪检测肽段信号,Thermofisher Proteome Discoverer1.3/1.4软件进行数据采集及分析,得到差异蛋白谱。筛选pvalue<0.05和ratio值1.2倍（上调1.2、下调0.833）的蛋白为可信的差异蛋白。对可信的差异蛋白进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。重复蛋白质谱样品准备的作用条件于高危型及野生型iPSCs-RPE细胞,通过Real-time PCR、Westernblot、IF等实验方法验证筛选出的差异蛋白。通过用FITC标记的感光细胞外节段（POS）与吸烟者血清和非吸烟者血清作用后的高危型iPSCs-RPE细胞共培养,检测各组细胞吞噬功能的差异。2、构建HTRA1过表达慢病毒感染ARPE-19细胞系,嘌呤霉素筛选获得HTRA1过表达稳转细胞株后,检测Caveolin-1的表达水平,探索HTRA1过表达与Caveolin-1表达的关系。3、应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,根据靶基因序列设计sgRNA,构建打靶载体,对ARMS2/HTRA1高危型干细胞进行靶向基因修饰,建立ARMS2高危型、HTRA1高危型纯合优化干细胞系。结果1、高通量质谱分析发现吸烟者血清作用下,不同于野生型的高危型的差异蛋白有400个,筛选剔除个体差异蛋白,得到Caveolin-1等7个具有明显差异的可信蛋白。通过Real-time PCR、Western blot和IF等实验验证了吸烟者血清暴露后,高危型RPE细胞中Caveolin-1在mRNA和蛋白水平均表达上调,且RPE细胞的吞噬功能增强。2、过表达HTRA1的稳转细胞株中,Caveolin-1在mRNA水平和蛋白水平表达显着增强。吸烟者血清与AMD高危基因HTRA1过表达对于Caveolin-1蛋白表达增强有协同叠加作用。3、成功建立ARMS2高危型、HTRA1高危型纯合优化干细胞系,为之后ARMS2/HTRA1高危基因在AMD致病机制中的分别研究提供细胞模型。结论蛋白组学分析吸烟者血清刺激后,ARMS2/HTRA1高危型RPE细胞的差异蛋白变化明显大于野生型,这些差异蛋白表达的变化很可能与AMD的发病相关。该研究证明了AMD的高危基因HTRA1表达上调和AMD高危环境因素吸烟,通过上调Caveolin-1的表达,代偿性增强RPE细胞吞噬功能,引起氧化负担加重,导致废物的积累、消除及随后的炎症反应最终导致感光细胞的破坏,从而促进AMD的发生和发展。
于淼[5]（2019）在《CRISPR/Cas9介导基因编辑制备FoxJ1缺失小鼠气道上皮细胞和遗传修饰雪貂模型》文中认为基因编辑是指借助细胞自身的基因组损伤修复机制对目标基因的核苷酸序列进行碱基删除、插入、定点突变和组合编辑等基因操作技术。近年出现的CRISPR/Cas9定点基因编辑技术极大提高了基因编辑效率、推进了基因功能的研究,并在构建人类疾病模型、推动基因治疗、加快农作物和动物的遗传改良等领域有着巨大的应用潜力。在传统的呼吸道干细胞功能研究中,需要使用基因型相同的细胞群作为研究对象。如何运用CRISPR技术对呼吸道干细胞群进行基因编辑,并高效的筛选阳性编辑的细胞成为了一个急需攻克的难题。本研究首次将荧光报告基因的优势与CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术的特点相结合,建立了有效的基因编辑细胞富集平台,突破了 CRISPR技术在干细胞研究领域的应用瓶颈。首先,采用经体外酶切筛选出高效靶向Loxp位点的sgRNA（LoxP-sgRNA）转染表达Cas9的ROSA26-LoxP-tdTomato-stop-LoxP-EGFP（ROSA-TG）报告基因小鼠气道上皮细胞,结果发现CRISPR/Cas9高效介导LoxP位点中间的tdTomato基因剪切,红色荧光细胞向绿色和无色荧光的转变率达到72.7%。扩增并亚克隆转染细胞基因组内2个Loxp中间的序列,测序分析证实绝大部分克隆发生了双酶切（96.6%）。其次,使用该LoxP-sgRNA同2条靶向小鼠FoxJl基因2号外显子的sgRNA共转染上述ROSA-TG细胞,用流式细胞术筛选绿色荧光转换细胞作为FoxJl基因敲除富集细胞。对亚克隆绿色细胞FoxJl基因两个识别位点内的序列分析来评估该平台的富集效果,发现所有来自绿色荧光细胞的克隆子在FoxJl基因内100%发生了靶向双位点酶切（26/26）,而红色细胞内只有25%发生了双酶切（7/28）。基因表达分析进一步证实绿色荧光细胞内未检测到FoxJl的mRNA转录。上皮细胞分化试验结果显示,绿色荧光细胞分化的气道上皮中纤毛细胞占4.32%,而红色细胞中的纤毛细胞占38.5%。对囊性纤维化跨膜转运调节体（CFTR）介导的上皮细胞电生理功能分析进一步表明,无Loxp剪切的红色荧光细胞来源上皮中CFTR介导的诱导微电流和抑制微电流分别为33.6μA/cm3和64.5μA/cm3,分别是绿色荧光细胞诱导微电流7.21μA/cm3和抑制微电流13.4μA/cm3的4.66倍和4.81倍。说明FoxJl基因的敲除对细胞分化后的CFTR氯离子通道产生了明显的抑制作用。同时,为扩展该基因编辑细胞富集平台的应用,本研究额外筛选了靶向敲除EGFP和tdTomato基因的sgRNA,可用红、绿色荧光的淬灭作为替代筛选标签。与小鼠呼吸道比较,雪貂的呼吸道无论在生理学还是细胞组成与生物学方面都更接近于人类。表达平滑肌肌动蛋白（αSMA）的气道肌上皮细胞最近被确定为气道上皮内的重要干细胞亚群,在气道上皮的损伤修复和维护气道稳态方面发挥主要作用。为深入研究肌上皮干细胞的发育来源和慢性呼吸道疾病的病理发生,本项目在前期建立CRISPR/Cas9基因编辑细胞富集平台工作的基础上,进一步构建了雪貂ROSA-TG和αSMA-CreERT2品系报告基因模型。在技术上,为探索一种利用CRISPR技术快速、高效构建雪貂模型的新方法,本研究在构建这些转基因雪貂模型时分别尝试利用细胞内的两种不同的DNA损伤修复机制——非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HDR）来介导敲入。在雪貂ROSA-TG品系构建过程中,首先在雪貂基因组中设计了 3条靶向ROSA基因的sgRNA,并用体外酶切法筛选出最优的1条用于试验。将克隆构建好的供体质粒消化为单链DNA后与sgRNA共同显微注射到179枚雪貂受精卵中。将151枚发育到2细胞阶段的受精卵移植到5只假孕受体雪貂体内,产生了 23只雪貂幼崽。经PCR基因分型、测序分析及Southern blot验证,获得了 4只健康的ROSA位点敲入荧光报告系统TG的转基因杂合体雪貂。使用表达Cre重组酶的腺病毒感染转基因雪貂的纤维细胞的试验和Southern印迹法均证实了敲入的Cre/LoxP荧光报告系统的有效性和准确性。同样,在αSMA-CreERT2品系雪貂构建中,使用设计并筛选出的最佳的1条靶向雪貂基因组ACTA2基因的sgRNA,与构建好的单链DNA供体质粒共同显微注射到155枚雪貂受精卵内。将得到的110枚发育到2细胞阶段的受精卵移植到5只假孕受体雪貂体内,共产生16只雪貂幼崽。经PCR基因分型、测序分析及Southern印迹法验证,共获得4只健康的具有转基因靶向敲入的杂合体雪貂。通过对αSMA-CreERT2转基因雪貂纤维细胞的Cre报告基因慢病毒感染、TGFβ激活αSMA的表达和他莫昔芬协助Cre入核转运试验,证实了基因组整合的各个功能元件均具有完全功能。综上所述,本论文充分利用了 CRISPR/Cas9技术的无种属限制、特异性强和高效快捷的优势,将试验内容从小鼠原代细胞基因敲除株的建立逐步深入到转基因雪貂模型的构建,研究对象从体外小鼠气道上皮基底干细胞逐步扩展到体内雪貂受精卵和组织特异性的肌上皮干细胞,研究方式从荧光基因敲除延伸到分别利用NHEJ和HDR通路进行报告基因敲入。为CRISPR技术以及转基因雪貂模型在干细胞研究领域的广泛应用打下基础。本项目建立的雪貂模型可用于针对肌上皮干细胞的谱系追踪研究,以揭示呼吸道干细胞功能、修复再生以及细胞异常增生的发生机制。本研究内容将为利用CRISPR/Cas9技术制备基因修饰原代细胞模型,以及利用雪貂模型研究呼吸道干细胞生物学提供技术方法和有效可靠的模型。
纪振宇[6]（2018）在《肝细胞生长因子HGF通过Dll4/Notch信号通路调节RF/6A细胞的生物学功能》文中提出第一部分GEO数据库分析AMD患者与正常人眼组织中HGF的含量及功能预测目的:通过GEO数据库对比分析AMD患者和正常人眼组织HGF、VEGF的表达差异,并通过KEGG数据库对AMD患者中表达增强的基因集进行相互作用分析,得到可能与AMD发病机制相关的信号通路。方法:在GEO数据库中以“Age-related macular degeneration”为检索词,筛选芯片样本和种属,按照样本数量及匹配度排序,获得样本量最大的芯片数据GSE29801,利用R语言将芯片进行数据可视化转化,比较芯片各组间HGF和VEGF的表达差异;通过KEGG数据库分析AMD患者中表达增强的基因集,与生物体中作用已知的信号通路对比,得到可能与AMD发生相关的信号通路。结果:（1）对芯片组织HGF的表达分析显示:AMD患者与正常人眼在黄斑区外视网膜组织中表达量分别为14.75±7.29、12.53±7.30,在黄斑区外RPE-脉络膜复合体中表达量分别为8.97±2.66、9.06±3.32,在黄斑区RPE-脉络膜复合体组织中表达量分别为10.96±6.70、9.86±3.45,两两对比无统计学差异（P>0.05）。而黄斑区视网膜中HGF表达量有显着性差异（16.96±9.05 vs 11.78±5.10,P<0.05）,AMD患者黄斑区视网膜的HGF表达量明显升高。（2）对HGF的表达分析显示:AMD患者与正常人眼在黄斑区外视网膜组织中表达量分别为183.38±115.68、140.36±86.9,在黄斑区外RPE-脉络膜复合体中表达量分别为135.03±55.36、105.06±49.94,在黄斑区视网膜组织中表达量分别为160.11±104.72、111.53±57.91,在黄斑区RPE-脉络膜复合体组织中表达量分别为125.96±41.58、112.47±42.44,四组中AMD患者的VEGF整体表达呈增强趋势,差异在黄斑区外RPE-脉络膜复合体和黄斑区视网膜组织中具有统计学意义（P<0.05）。（3）KEGG结果:与正常人眼黄斑区视网膜组织相比,AMD患者黄斑区视网膜组织的1058个基因集中,有534个基因集表达上调,其中12个基因集的表达显着性增强（P<0.01）及49个基因集的表达增强（P<0.05）,其中发现S1P信号通路、SEMA4D相关信号通路Wnt信号通路等在AMD患者黄斑区视网膜组织中的表达明显增强。结论:GEO数据库分析发现AMD患者眼部黄斑区视网膜组织中HGF的表达有所增强,VEGF在RPE-脉络膜复合体和视网膜组织中表达均有所增强,说明HGF与VEGF参与了 AMD的发生;KEGG数据库分析发现AMD患者基因芯片表达增强的基因有部分基因参与了内皮细胞增殖迁移和血管生成的生物学过程。第二部分缺氧条件下人视网膜色素上皮细胞中HGF含量的变化及外源性HGF蛋白对RF/6A细胞的影响目的:探讨ARPE-19细胞在缺氧不同时间段HGF和VEGF的表达及细胞因子的分泌情况,研究外源性HGF对RF/6A细胞增殖、迁移和管型形成能力的影响。方法:（1）将生长状态良好的第7～8代ARPE-19细胞分为正常对照组和缺氧处理组,加入300μM氯化钴进行缺氧处理,收集Oh,2h,4h,8h,12h,24h各个时间段ARPE-19细胞的mRNA和蛋白,并收集24h的细胞上清液。Real-time RCR和Western Blot检测细胞中HGF和VEGF的mRNA和蛋白表达,ELISA法检测细胞上清中HGF、VEGF、CCL11、CCL24的蛋白含量。（2）生长状态良好的第7～8代RF/6A细胞分为正常对照组,5ng/mlHGF蛋白处理组,25ng/mlHGF蛋白处理组和50ng/ml HGF蛋白处理组,将细胞接种于96孔板和Transwell小室中,在不同外源性HGF蛋白浓度环境下培养,MTT法检测RF/6A细胞的增殖能力,Transwell小室法检测RF/6A细胞的迁移能力,采用matrigel胶血管形成实验检测RF/6A的管型形成能力。结果:（1）缺氧不同时间后ARPE-19细胞mRNA的表达:与正常对照组相比,HGF的mRNA水平在缺氧2h后开始增高（P<0.05）,在缺氧4h、8h后mRNA水平持续增加（P<0.05）,在缺氧12h后mRNA水平达到一个峰值（P<0.05）,12h之后mRNA水平逐渐降低（P<0.05）。而VEGF的mRNA水平在缺氧2h、4h仅有增高趋势（P>0.05）,从8h开始明显增加（P<0.05）,并持续至24h后（P<0.05）;（2）缺氧不同时间后ARPE-19细胞的蛋白表达:与正常对照组相比,HGF的蛋白表达在缺氧2h、4h并无明显变化（P>0.05）,从缺氧8h开始逐渐增高,持续至缺氧24h后（P<0.05）。VEGF的蛋白表达在缺氧2h、4h、8h无明显的改变（P>0.05）,缺氧12h、24h后VEGF蛋白表达显着性增高（P<0.05）;（3）ARPE-19细胞缺氧24h后细胞上清液中HGF、VEGF、CCL11、CCL24等细胞因子含量均显着性增加（P<0.05）;（4）5ng/ml外源性HGF蛋白对RF/6A细胞的增殖、迁移和血管形成能力无明显影响（P>0.05）,从25ng/ml浓度开始,HGF蛋白逐渐表现出促增殖、促迁移和促管型形成能力,50ng/ml的HGF蛋白促管型形成能力较25ng/ml更强P<0.05。结论:在缺氧条件下HGF和VEGF的表达明显增强,分泌型细胞因子HGF、VEGF、CCL11、CCL24含量均有所增加,说明上述细胞因子参与了 RPE细胞的缺氧损伤过程;HGF蛋白可以通过调节内皮细胞的功能进而参与CNV的形成,上述几种细胞因子可能共同影响AMD的发生。第三部分共培养条件下HGF siRNA转染人视网膜色素上皮细胞对RF/6A细胞的影响及其相关机制探究目的:探讨共培养体系下,HGFsiRNA转染ARPE-19细胞后对RF/6A细胞增殖、迁移和管型形成能力的影响,观察Dll4/Notch信号通路的变化。方法:（1）将生长状态良好的第7～8代ARPE-19细胞分为正常对照组、实验组、阴性对照组、转染试剂对照组,Real-time RCR和Western Blot检测HGF siRNA对mRNA和蛋白沉默效率;（2）将生长状态良好的第7～8代ARPE-19细胞分为正常对照组,氯化钴缺氧处理组及氯化钴+HGF siRNA处理组,在共培养体系下,观察ARPE-19细胞对RF/6A细胞增殖、迁移和管型形成能力的影响,并检测各组ARPE-19细胞中HGF、VEGF、CCLs及Dll4/Notch信号通路的变化。结果:（1）Real-time PCR和Western Blot结果显示:与正常对照组相比,实验组RPE细胞中HGF的表达明显受到抑制（P<0.05）,mRNA和蛋白水平分别降低了 82%和66%,阴性对照组和转染试剂对照组RPE细胞中HGF的基因和蛋白表达均没有明显变化（P>0.05）,且转染试剂和siRNA对细胞的生长无明显毒副作用;（2）共培养体系中,氯化钴缺氧处理组的RF/6A细胞增殖、迁移和管型形成能力均有所增强（P<0.05）,氯化钴+HGFsiRNA处理组RF/6A增殖、迁移和管型形成能力明显下降（P<0.05）;（3）共培养24h后,缺氧状态下,ARPE-19细胞中HGF、VEGF、CCL11、CCL24的mRNA表达均显着性增强（P<0.05）,Dll4/Notch 信号通路中 D114、Notch1 的 mRNA 表达有所上升（P<0.05）,但 Notch4的表达没有明显变化（P>0.05）。经过HGF siRNA转染处理后,ARPE-19细胞中HGF、VEGF的mRNA表达均明显降低（P<0.05）,CCL11、CCL24的表达有下降趋势（P>0.05）,Dll4/Notch信号通路整体下调（P<0.05）。结论:HGF siRNA可以明显抑制ARPE-19细胞中HGF的基因和蛋白表达,并且可以逆转缺氧诱导的RF/6A细胞功能的增强,这种HGF可能通过调控D114/Notch信号通路及VEGF的表达调控内皮细胞的功能。
余天[7]（2017）在《丝氨酸蛋白酶HtrA1对蓝光损伤人视网膜色素上皮细胞的影响及机制研究》文中提出第一部分人视网膜色素上皮细胞光损伤模型的建立及丝氨酸蛋白酶HtrAl的表达研究目的:构建蓝光损伤的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial,RPE）ARPE-19细胞体外模型,在此基础上观察丝氨酸蛋白酶HtrAl在光损伤模型中的表达情况。方法:体外培养人视网膜色素上皮ARPE-19细胞,取第8-12代生长良好的传代细胞用于实验。将细胞分为正常对照组、光损伤模型组。采用波长400nm的蓝色节能灯以（2000±500）Lux持续光照人ARPE-19细胞6h建立光损伤模型。显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测构建模型细胞凋亡情况。实时聚合酶链反应（Real-Time PCR）和蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测12h,24h,48h及72h不同时间点光损伤模型细胞HtrAlmRNA和蛋白表达变化情况。建模后光损伤模型组再分为针对HtrAl的小干扰RNA（HtrAl siRNA）组、阴性对照组、空白对照组。应用Lipofectamine2000将HtrAl siRNA转染至HtrAl siRNA组细胞;阴性对照组细胞转染非特异的阴性siRNA（control siRNA）;空白对照组为单纯光损伤模型细胞。采用Real-Time PCR和 Western blot检测siRNA干扰效率。结果:显微镜下观察光损伤模型组部分细胞边界及细胞核边界不清,色素颗粒增多,出现损伤性的变化;流式结果显示光损伤模型组凋亡率较正常细胞组明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。Real-Time PCR结果显示光损伤模型组细胞mRNA表达量在12h、24h、48h、72h各个时间点均较正常对照组明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示,24h、48h、72h光损伤模型组HtrAl蛋白表达量较正常对照组明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。正常对照组HtrAl mRNA和蛋白的表达量随着时间无明显变化。小干扰RNA技术干扰后,Real-Time PCR和Western blot结果显示HtrAl siRNA组HtrAl mRNA表达量和蛋白表达量显着小于正常对照、阴性对照组和空白对照组（P<0.05）。结论:蓝光照射可引起人ARPE-19细胞损伤性变化、凋亡增加,该体外模型可用于年龄相关性黄斑变性研究的模型。在光损伤模型组人ARPE-19细胞中,HtrAl表达随着时间逐渐增加表达增加,提示HtrA1可能参与了其中的损伤变化过程;HtrAl siRNA能有效的沉默HtrAl基因表达。第二部分siRNA介导丝氨酸蛋白酶HtrAl沉默对光损伤模型人视网膜色素上皮细胞增殖、迁徙以及凋亡的影响目的:观察siRNA介导丝氨酸蛋白酶HtrAl沉默对光损伤模型人RPE细胞生长、迁徙以及凋亡的影响,并探讨可能参与凋亡的相关因子的表达情况。方法:采用波长400nm的蓝色节能灯以（2000±500）Lux持续光照人ARPE-19细胞6h建立光损伤模型。用脂质体Lipofectamine 2000将HtrA siRNA转染光损伤模型细胞建立HtrAl siRNA组,转染control siRNA为阴性对照组,单纯光损伤细胞为空白对照组。正常细胞为正常对照组。CCK-8、transwell小室法及流式细胞仪分别检测细胞增殖、迁徙以及凋亡、细胞周期情况;Real-Time PCR和Western blot检测相关凋亡蛋白Bax、Caspase-3以及Bcl-2的表达情况。结果:与阴性对照组、空白对照组比较,HtrA1 siRNA组细胞增殖及迁徙能力明显下降（P<0.05）;HtrAl siRNA组细胞的凋亡率较阴性对照组、空白对照组明显下降,停留在G0/G1期数目增多,差异有统计学意义（P<0.05）;HtrAlsiRNA组Bax及Caspase-3的mRNA和蛋白表达较阴性对照组、空白对照组均明显降低,而Bcl-2的mRNA和蛋白表达均明显增高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论特异性沉默HtrAl基因的表达可以降低蓝光损伤的人RPE细胞增殖、迁徙能力以及凋亡,使细胞停留在G0/G1期数目增多;同时通过下调Bax、Caspase-3以及上调Bcl-2的表达来降低蓝光引起的细胞凋亡。第三部分下调丝氨酸蛋白酶HtrAl表达对光损伤模型人RPE细胞血管内皮生长因子A影响及其机制研究目的:观察siRNA介导丝氨酸蛋白酶HtrAl沉默对光损伤模型人RPE细胞血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A）影响,并探讨其可能机制。方法:采用波长400nm的蓝色节能灯以（2000±500）Lux持续光照人ARPE-19细胞6h建立光损伤模型。用脂质体Lipofectamine 2000将HtrA siRNA转染光损伤模型细胞建立HtrAl siRNA组,转染control siRNA为阴性对照组,单纯光损伤细胞为空白对照组,正常细胞为正常对照组。Real-Time PCR和Western blot检测各组HtrAl、VEGF-A以及NF-κB的mRNA和蛋白表达情况。结果:HtrAl siRNA组细胞HtrAl、VEGF-A以及NF-κB mRNA相对表达量较阴性对照组、空白对照组均有明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）;HtrA1 siRNA组细胞HtrAl、VEGF-A以及NF-κB蛋白相对表达量较阴性对照组、空白对照组均有明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）;阴性对照组、空白对照组与正常对照组比较,HtrAl、VEGF-A以及NF-κB表达明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:光损伤模型中,HtrAl、VEGF-A以及NF-κB在光损伤后呈现出同向的增长趋势;下调HtrAl表达后,转录因子NF-κB以及VEGF-A表达下降。提示这几个细胞因子之间可能存在一定的联系,参与了光损伤的病理生理过程。
袁志刚[8]（2012）在《腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因抑制PVR的研究》文中提出目的通过建立兔增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy, PVR）动物模型,探讨腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因对PVR增生的抑制作用及机制,评价其治疗PVR的效果。方法1.PVR动物模型的建立：青紫蓝兔28只,随机分成两组,实验组及对照组各14只。实验组采用玻璃体腔注射人富含血小板血浆（Platelet-rich plasma,PRP）联合巩膜外冷冻建立PVR模型,对照组采用玻璃体腔注射兔PRP建立PVR模型。行间接眼底镜、B型超声及HE染色检查,观察PVR程度及视网膜脱离的发生情况。2.p21WAF1/CIP1在PVR发病机制中的作用：青紫蓝兔27只,随机分成两组,正常组3只,实验组24只。正常组不做任何处理；实验组每只兔随机选取一只眼作为实验眼,采用玻璃体腔注射人PRP联合巩膜外冷冻建立PVR模型。行蛋白免疫印迹（Western blot, WB）和逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）,检测PVR模型建立后第7d、14d、21d及28d视网膜组织中p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E蛋白及mRNA的表达。3.体外实验：体外培养hRPE407细胞,细胞同步化后,分为磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution, PBS）组、阴性对照（adenovirus mediated delivery of non-target control, Ad-NC）组和腺病毒p21WAF1/CIP1载体转染（adenovirus mediated delivery of p21WAF1/CIP1, Ad-p21）组。行WB和RT-PCR检测p21WAF1/CIP1、CDK、cyclin E蛋白及mRNA在细胞中的表达；行3-甲基-2-噻唑硫酮（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT）试验、流式细胞仪及Transwell检查。4.体内实验：青紫蓝兔50只,随机分成4组,正常对照组2只,PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组各16只。其中PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组按照前述方法建立PVR模型。正常组不做任何处理,PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组于建模后第7d玻璃体腔分别注入PBS、Ad-NC及Ad-p215ul。第14d时,行WB和RT-PCR检测p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E蛋白及mRNA在视网膜组织中的表达。行间接眼底镜、B型超声及HE染色,观察第28d各组PVR程度及视网膜脱离的发生情况。结果1.建模后观察28d,实验组20眼均发生了视网膜脱离,发生率为100%；对照组,13眼发生了视网膜脱离,发生率为65%,两组差异有统计学意义（P<0.01）。2. WB和RT-PCR检测结果显示,PVR模型建立后7d、14d、21d及28d视网膜组织内p21WAF1/CIP蛋白及mRNA表达水平均低于正常组,第14d时表达最低（P<0.01）,而CDK2、cyclin E表达均高于正常组,在第14d时表达水平最高（P<0.01）3.WB和RT-PCR检测结果显示在Ad-p21组,p21WAF1/CIP蛋白和mRNA的表达均增高,说明腺病毒成功介导p21WAF1/CIP基因转染人视网膜色素上皮细胞,并稳定表达。MTT检测细胞转染p21WAF1/CIP基因48h后其增生抑制率达到43.13%,较其它组细胞生长速度减慢。细胞周期检测结果显示,Ad-p21组处于G0/G1期的细胞所占百分比显着高于PBS及Ad-NC组（P<0.01）。Transwell小室检测结果显示Ad-p21组穿膜细胞数,明显低于PBS及Ad-NC组（P<0.01）。4.间接眼底镜及B超结果显示PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组第28d视网膜脱离的发生率分别为100%、91.67%和33.33%。建模后第14d时,WB和RT-PCR显示Ad-p21组p21WAF1/CIP1蛋白及mRNA的表达显着高于正常组、PBS组及Ad-NC组（P<0.01）,而CDK2、cyclin E表达明显低于其它组（P<0.01）。结论1.采用玻璃体腔注射人PRP联合巩膜外冷冻可成功建立了PVR动物模型,视网膜脱离的发生率为100%。2.p21WAF1/CIP1基因在PVR发病机制中可能起着重要作用。3.腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因能有效抑制人视网膜色素上皮细胞的增生及迁移。4.腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因可有效减轻PVR程度,并降低视网膜脱离发生率。
高妍[9]（2012）在《新型高分子脂质体优化转染VEGF siRNA对视网膜新生血管抑制的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：对载质粒DNA的高分子脂质体进行性能分析,优化其转染条件；观察其细胞毒性及转染不同细胞的转染效率；研究高分子脂质体作为基因载体在氧诱导视网膜病变动物模型中对视网膜新生血管的抑制作用,体现其独特的穿膜能力和缓释功能,为将来制备靶向性药物/基因共载多功能给药系统提供实验基础和理论依据。方法：1.课题组自行合成羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐（OQLCS/chol）纳米粒子,将穿膜肽（Tat）与其表面的功能基团连接制备出兼具跨膜、长循环功能的高分子脂质体,并对其表征进行检测。研究该高分子脂质体对质粒DNA在不同质量比、不同作用时间及血清存在与否条件下的包载效能,制定最优的转染条件；采用高速离心法进行体外释放动力学实验,绘制体外释放曲线；利用CCK-8法检测不同浓度高分子脂质体在不同时间分别对视网膜色素上皮（RPE）细胞的毒性,找到适于细胞转染的安全浓度；在优化条件下转染RPE细胞,同时以商品化的Lipofectamine2000做对照,比较两者的转染效率。2.建立缺氧条件下RPE细胞模型,转染48时后收集细胞上清通过ELISA法检测各组VEGF量的变化,细胞爬片后行免疫组织化学染色分析各组VEGF蛋白的表达,采用Real-time PCR检测各组RPE细胞内VEGF mRNA的变化。3.采用改良的Smith’s法建立氧诱导视网膜病变C57BL/6J小鼠模型,共95只,另有27只小鼠于正常氧环境中饲养。P11天时行小鼠玻璃体腔内注药,不同时间点,于正常打药组中随机选取两只小鼠行视网膜铺片,荧光显微镜下观察GFP的表达情况；各组中抽取两只小鼠FITC-dextran心脏灌注后行视网膜铺片观察视网膜血管形态的变化；分别于各组随机抽取两只小鼠,行HE染色,统计突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数；于各组随机抽取的两只小鼠做5gm冰冻切片,DAPI核染后荧光显微镜下观察,以反映高分子脂质体携带质粒DNA的穿膜能力。结果：1.纳米粒平均粒度为134nm,Zeta电位为+39.64mV,包载质粒后为236nm。透射电镜下纳米粒呈大小均匀的圆形粒子。体外释放实验显示载质粒DNA的高分子脂质体在体外最初5天为突释相,约有70%的质粒释放；此后至第14天呈稳态缓释。该高分子脂质体毒性较低,最高安全浓度为20ug/mL。2.通过电泳阻滞实验,筛选出高分子脂质体与质粒DNA质量比≥2：1时、混合时间为30-40min、无血清存在的培养液为最优转染条件；并以此条件转染RPE、Hela及RF/16,对RPE的转染率约为69%,对Hela细胞的转染效率约为52%,对RF/16转染效率约为80%。3.对缺氧后的RPE转染后观察,高分子脂质体组和Lipo组均能有效地将质粒DNA转染入细胞并表达。48小时后收集细胞上清,行ELISA法检测各组VEGF量,高分脂质体组和Lipo组中VEGF含量较模型组明显降低,差异均有显着性（P<0.01）,其中Lipo组抑制程度略较高分脂质体组大,但差异不具有显着性（P=0.10）。72小时后行细胞免疫组化显示细胞内VEGF的变化,Lipo组和高分脂质体组对VEGF表达产生明显的抑制作用,胞浆内棕色着染明显淡薄,OD值相比高分子脂质体组略低于Lipo组（P=0.443）。Real-time PCR结果显示转染后48小时,高分脂质体组和Lipo组VEGF mRNA的变化与ELISA结果相似。4.成功建立了氧诱导视网膜病变小鼠模型。玻璃体腔内注射后可见注药后第1天视网膜内即有GFP表达,至第6天达到高峰,第11天时在高分子脂质体组仍能看到GFP表达,Lipo组不明显。FITC（?）心脏灌注后显示视网膜无灌注区及新生血管范围在高分子脂质体组及Lipo组明显改善,效果相当。HE染色后行突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数,结果表明P17天时高分子脂质体组及Lipo组均能有效抑制新生血管生成,P22天时,高分子脂质体效果仍能显现,新生血管内皮细胞核数较Lipo组少,差异具有显着性（P<0.01）。冰冻切片显示,注射后第1天,在高分子脂质体组及Lipo组均可以观察到玻璃体腔内有GFP的表达,高分子脂质体组有部分于视网膜表面表达；注射后第6天,两组的表达量均较高,且GFP表达位于RPE层附近；注射后第11天,在高分子脂质体组切片中仍能找到GFP的表达,但在Lipo组已很难找出。行VEGF的Western Blot检测,玻璃体腔内注射后6天,高分子脂质体组与Lipo组抑制效果相当（P=0.092）；P22时高分子脂质体组较Lipo组抑制明显,差异有显着性（P<0.05）。Real-timePCR结果与western blot结果相似。结论：1.自行制备的Tat化的高分子脂质体O-羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐/胆固醇具有粒径均匀、分散性好、Zeta电位较高、细胞毒性较小的特点,体外释放能在较短时间达到治疗浓度,后续可缓慢平稳释放。2.该高分子脂质体能携带基因很好的转染RPE细胞、Hela细胞及RF/16细胞,转染效率与商品化的Lipofectamine2000相当。3.该高分子脂质体携带治疗基因可以减少视网膜新生血管的生成,且具有显着的穿膜能力及缓释功能,在体内可维持较长时间的治疗效果,具有临床应用的开发前景。
邱晓頔[10]（2012）在《白内障患者诱导性多能干细胞（iPS）的建立及其定向分化的研究》文中研究指明年龄相关性白内障（age-related cataract, ARC）为全球致盲眼病的主要原因。在我国约有250万人因白内障致盲,占全球白内障致盲总数的10%。随着人口的老龄化,预计我国每年新增白内障患者将超过100万,而我国的白内障年手术量尚不足以解决每年的新增例数。因此,我国的白内障盲防治问题十分严峻。而先天性白内障是指出生前即存在,或出生后才逐渐形成的先天遗传或发育障碍的白内障,超过1/3的患者是遗传所致。任何参与、影响晶状体发育的基因突变都可能导致先天性白内障的发生。因此,明确先天性白内障的发病机制对于治疗及预防先天性白内障的发生发展具有重要的意义。白内障摘除联合人工晶状体（intraocular lens, IOL）植入是目前治疗白内障最常用且效果较为理想的方法,而后囊膜混浊（posterior capsular opacification, PCO）是影响病人术后远期视力预后的最常见的并发症,其术后5年的发生率高达30%左右。虽然可以利用激光或者手术切开混浊的后囊膜,但是却增加了病人的经济负担,并会带来新的并发症。所以如何预防PCO的发生是眼科医生和病人都比较关注的一个问题。体细胞诱导成为多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）的研究成果被国际生命科学界誉为具有里程碑意义的创新之举。多能干细胞能够自我更新,能在体内外分化成几乎所有类型的细胞,在再生医学等方面有巨大的应用潜力,具有极高的理论研究价值。通常用来源于囊胚期胚胎的内细胞团的胚胎干细胞、通过核移植得到的胚胎干细胞以及在成体细胞中转入外源转录因子得到的iPSCs,进行体细胞重编程研究。在短短数年的时间里,此项研究已经在细胞重编程的机理研究、探索疾病的发生发展机制以及临床医学的应用等领域引发了很多突破性的进展；而且这一非克隆干细胞技术的诞生,成功地避开了长期以来争论不休的伦理问题,极大地推动该领域和相关科学领域的发展。与胚胎干细胞研究相比,体细胞重编程技术可以为更多的患者提供特异性多能干细胞。因而,在医学应用方面（例如器官培养和器官移植等）有广阔的前景。患者特异性的多能干细胞的建立能够为疾病发病机制的研究、治疗药物的筛选及细胞移植治疗提供有力的工具。采用慢病毒载体将外源性转录因子导入白内障患者晶体上皮细胞,从而获得诱导性多能干细胞。白内障患者来源的多能干细胞的建立,能够为晶体发育、细胞分化、衰老提供便利的细胞模型,同时可为白内障治疗药物的筛选及白内障发病机制的研究提供有力的研究工具。第一部分原代人晶体上皮细胞的体外培养目的对正常人晶体、年龄相关性白内障晶体上皮细胞及人皮肤成纤维细胞进行体外培养,并观察体外培养的晶体上皮细胞及皮肤成纤维细胞的生物学特性及组织学变化。方法正常人晶体上皮细胞培养取材于角膜移植术后供体眼的晶状体囊膜,年龄相关性白内障晶体上皮细胞培养取材于白内障超乳手术中撕除的晶体前囊膜。角膜移植术后供体眼的晶状体沿赤道部后方约2mm环形剪开后囊膜,小心取下完整的前囊膜和赤道部囊膜,剪成1mm×1mm大小的组织块,利用组织块贴片法,进行原代人晶状体上皮细胞的培养。白内障晶体前囊膜在超乳手术中完整取材、洗去粘弹剂之后剪成1mm×1mm大小的组织块,利用组织块贴片法进行培养。使用0.25%胰酶溶液对融合后的细胞进行消化传代。取年龄相关性白内障患者的皮肤组织,剪成1mm3大小的组织块,过夜消化,离心收集细胞,经多次传代后,获得较为纯化的皮肤成纤维细胞进行培养。在倒置相差显微镜下对三种细胞进行形态学观察。采用CCK-8法连续7天测定三种细胞的增殖速率,绘制生长曲线并进行比较。结果正常人晶体囊膜组织块贴壁48～72小时后可见人晶状体上皮细胞从组织块边缘长出,约10～15天达到融合。初期正常人晶体上皮细胞为多角形,胞体透亮,细胞边界清晰。融合后的细胞具有上皮细胞的形态特征,为典型的六角形或多边形。在体外细胞可传五代,但第三代以后细胞表型向成纤维细胞转化。第三代以后正常人晶体上皮细胞胞体呈梭形或长条形。第五代正常人晶体上皮细胞老化,胞浆内出现大小不等的空泡样改变,最后崩解死亡。白内障患者晶体上皮细胞形态与增殖能力与正常晶体上皮细胞相类似,但部分白内障晶体上皮细胞与正常人晶体上皮细胞形态差异较大,更接近成纤维细胞,且细胞在第一次传代后即老化崩解。人皮肤成纤维细胞伸展呈梭形或多边形,在经过多次培养传代后,可得到较为纯化的成纤维细胞。CCK-8法绘制的生长曲线表明人皮肤成纤维细胞具有最高的增殖速率,白内障患者的晶体上皮细胞增殖最慢。结论利用组织块贴片法进行人晶状体上皮细胞培养,操作简单,成功率高。第二代人晶状体上皮细胞是进行细胞学及相关研究比较理想的实验对象。正常人晶体上皮细胞具有较好的生长及增殖能力,而白内障晶体上皮细胞增殖力差、细胞形态不佳。人皮肤成纤维细胞在消化离心后经过多次传代能够获得纯化的成纤维细胞。人皮肤成纤维细胞增殖最快,正常人晶体上皮细胞增殖速率居中,白内障患者晶体上皮细胞增殖速率最慢。第二部分白内障患者诱导性多能干细胞的建立目的分别构建表达OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒载体（Lentivirus）,并转染年龄相关性白内障患者体外培养的晶体上皮细胞,诱导建立患者来源的诱导性多能干细胞,与同一患者来源的皮肤成纤维细胞对比,观察限定因子对于诱导多能干细胞的诱导效率。方法选择3例诊断为年龄相关性白内障的患者,取其晶体前囊膜及皮肤组织进行体外培养。白内障晶体前囊膜在超乳手术中完整取材、洗去粘弹剂之后剪成lmm×lmm大小的组织块,利用组织块贴片法进行培养。使用0.25%胰酶溶液对融合后的细胞进行消化传代。取上述3例年龄相关性白内障患者的皮肤组织,剪成Imm3大小的组织块,过夜消化,离心收集细胞,经传代后,获得较为纯化的皮肤成纤维细胞进行培养。分别将含有OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒载体质粒（plenti-hOCT4/plenti-hSOX2/plenti-hKLF4）同辅助质粒（pCMV-gag-pol-PA/pCMV-VSVg）一起共感染293T细胞,重组包装构建慢病毒载体（分别为Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4）.将构建的三种慢病毒载体混合分别感染第2代的白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞,培养5天后,与小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts, MEFs）进行共培养,直至出现iPSCs。采用碱性磷酸酶（ilkaline phosphatase, AKP）染色比较白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞诱导生成iPSCs的效率差异。同时培养人H9胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）进行对照。结果利用组织块贴片法培养的白内障患者晶体上皮细胞及消化法培养的人皮肤成纤维细胞形态与增殖能力较好,第2代细胞适用于进行慢病毒感染。构建的慢病毒载体enti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4能高效转染两种细胞,并不影响细胞的状态及增殖能力。在慢病毒载体转染后第5天,将白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞分别与MEFs进行共培养,在转染后第12天开始出现与ESCs形态相似的细胞克隆。细胞克隆碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AKP）染色阳性,说明已成功诱导出iPSCs。采用AKP染色各比较3例患者的白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞诱导生成iPSCs的效率差异,在1×106的细胞接种密度下,白内障晶体上皮细胞平均可生成27.7个AKP阳性的细胞克隆,而人皮肤成纤维细胞平均仅生成15个细胞克隆。白内障晶体上皮细胞诱导形成的iPSCs细胞克隆与ESCs在细胞形态上具有相似性。结论构建的慢病毒载体Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4能高效转染白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞,并成功诱导出与ESCs形态相似、AKP染色阳性的iPSCs,且白内障晶体上皮细胞与人皮肤成纤维细胞相比具有更高的iPSCs诱导效率。第三部分白内障患者诱导性多能干细胞的鉴定目的对诱导建立的白内障患者来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）进行鉴定,检测细胞的分子标记及体内外分化能力,评价其多能性。方法对已成功诱导的白内障患者来源的iPSCs进行多能性鉴定：基因表达、免疫荧光染色分析、RT-PCR检测、体外分化拟胚体、体内分化畸胎瘤检测。提取iPSCs、ESCs和白内障患者晶体上皮细胞的总RNA采用HG-U133-2array （Affymetrix）对三种细胞的全基因表达谱进行检测并进行对比。提取iPSCs、 ESCs和白内障患者晶体上皮细胞的总RNA, RT-PCR检测人ESCs标志性基因（Nanog、OCT-4、REX-1、SOX-2、VIMENTIN）表达。采用细胞免疫组化荧光（immunohistochemistry, ICH）检测人ESCs标志性抗原（SSEA-3、SSEA-4、Nanog、 TRA-60、TRA-81、OCT-4）的表达。将iPSCs悬浮培养观察拟胚体（embryoid body,EB）形成,并在培养基中添加特殊成分（BMP4, FBS, retinoic acid （RA））观察EB的体外分化。将iPSCs接种至裸鼠皮下,观察畸胎瘤形成及体内分化情况。结果基因表达谱的分析结果显示,iPSCs与ESCs（?）（?）基因表达谱极为相似,但与白内障患者晶体上皮细胞的基因表达谱有较大差异。我们选择了1例56岁的年龄相关性白内障患者的iPSCs,并随机选择其中4个细胞克隆（分别命名为iPS1、iPS2、iPS3、iPS4）进行检测。RT-PCR检测的结果显示,iPS1与ESCs的ESCs标志性基因Nanog、OCT-4、REX-1、SOX-2和VIMENTIN的表达最为相似,而其他3株克隆与ESCs存在一定的差异。对iPS1进行ICH检测显示,人ESCs标志性抗原（SSEA-3、SSEA-4、Nanog、TRA-60、TRA-81、OCT-4）在iPS1中明显表达。体外分化拟胚体的结果显示,EB的分化使得Nanog和OCT-4表达下调,培养基中分别添加BMP4、FBS、RA之后,外胚层标志性基因NACM、TH和GFAP/内胚层标志性基因amylase、SOX7和AFP/中胚层标志性基因PECAM、desmin和SCL在EB中的表达均出现了不同程度的上调表达。对EB细胞进行ICH检测结果显示,EB细胞表达中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、外胚层标志物β-微管蛋白（tubulin beta1, Tuj-1）和内胚层标志物甲胎蛋白（α-fetoprotein, AFP）。体内分化畸胎瘤的结果显示,裸鼠注射iPSCsl个月左右可在裸鼠注射部位见肿块形成,2个月后摘除肿瘤进行组织切片检查,镜下可见三个胚层的组织细胞。结论研究诱导的iPSCs在基因表达谱、ICH、RT-PCR检测、体内外分化能力方面与ESCs极为相似,建立的iPSCs具有与ESCs相同的多向分化能力。第四部分白内障患者诱导性多能干细胞向晶体前体细胞的分化诱导目的探讨利用诱导因子三步法将白内障患者来源的多能干细胞诱导为晶体前体细胞的方法,评价分化细胞与晶体细胞的相似性。方法对已成功诱导的白内障患者晶体上皮细胞来源的iPSCs及ESCs进行三步法的分化诱导：在细胞培养基中添加（1）第0～5天100ng/ml Noggin;（2）第5～15天100ng/ml bFGF、20ng/ml BMP4和20ng/ml BMP7;（3）第15～30天100ng/ml FGF2和20ng/ml Wnt-3a.每5天提取iPSCs和ESCs的RNA, RT-PCR检测晶体细胞分化标志基因PAX6、SCX2、SIX3、CRYAB、CRYAA、BFSP1和MIP表达情况,并绘制变化曲线。采用ICH检测分化过程中晶体细胞分化标志PAX6、α晶体蛋白和β-晶体蛋白的表达。提取iPSCs、ESCs和人晶体的总蛋白,Western-blot法检测晶体细胞分化标志PAX6、α-晶体蛋白和β-晶体蛋白的表达水平并进行比较。取3例人晶状体,分别为22岁、44岁和65岁,提取总蛋白,并提取白内障患者晶体上皮细胞来源的iPSCs、人皮肤成纤维细胞来源的iPSCs及ESCs的总蛋白,Western-blot法检测间隙连接蛋白43（connexin43）和纤维连接蛋白（fibronectin）,以评价其上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transitions, EMT）的程度。结果经过三阶段诱导因子的作用后,对发生分化的iPSCs和ESCs进行的RT-PCR检测显示,PAX6、CRYAB、CRYAA、BFSP1和MIP的表达持续上升,SOX2的表达持续下降,SIX3的表达则是先上升后下降。ICH检测的结果显示分化过程中,iPSCs出现了晶体细胞分化标志PAX6、α-晶体蛋白和β-晶体蛋白的持续表达。Western-blot的结果显示,iPSCs、ESCs和人晶体中均有PAX6、α-晶体蛋白和β-晶体蛋白的表达,但ESCs的蛋白表达水平相对较低。EMT评价的结果显示,connexin43在22岁晶体中表达量最高,随着年龄的增加而明显降低,fibronectin则随着年龄的增加表达量逐渐增高；而在白内障患者晶体上皮细胞来源、人皮肤成纤维细胞的iPSCs及ESCs诱导分化的细胞中,connexin43在白内障患者来源的细胞中表达量最高,而fibronectin（?）勺表达相似。结论三阶段诱导因子的组合作用能够成功诱导出晶体前体细胞,且诱导分化的细胞能够稳定表达晶体细胞的标志性基因及蛋白。白内障患者晶体上皮细胞来源的iPSCs（?）比人皮肤成纤维细胞来源的iPSCs及ESCs具有更低的EMT程度。
二、三种基因导入系统对视网膜色素上皮细胞转染效率的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、三种基因导入系统对视网膜色素上皮细胞转染效率的研究（论文提纲范文）
（1）干细胞外泌体miR-141对视网膜氧化应激损伤的保护作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1 年龄相关性黄斑变性 |
| 2 氧化应激中的Keap1/Nrf2通路 |
| 3 microRNA |
| 4 骨髓间充质干细胞 |
| 5 外泌体分子功能及其在眼科疾病中的研究进展 |
| 5.1 外泌体的由来 |
| 5.2 外泌体的功能 |
| 5.3 外泌体与眼科疾病 |
| 5.4 外泌体作为眼科疾病的生物标志物 |
| 5.5 外泌体作为药物载体 |
| 6 总结 |
| 第2章 骨髓间充质干细胞外泌体的提取与鉴定 |
| 概述 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 骨髓间充质干细胞外泌体对RPE细胞氧化应激损伤的保护作用 |
| 概述 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 miR-141/Keap1/Nrf2通路在RPE细胞氧化应激反应中的分子机制 |
| 概述 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 骨髓间充质干细胞外泌体miR-141对RPE细胞氧化应激损伤的保护作用 |
| 概述 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 研究方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6 章 骨髓间充质干细胞外泌体对急性视网膜光损伤的保护作用 |
| 概述 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）腺相关病毒在视觉系统神经示踪及眼科治疗中的应用进展（论文提纲范文）
| 1 AAV概述 |
| 1.1 AAV的血清型 |
| 2 AAV对视觉系统神经环路的标记 |
| 3 AAV与常间回文重复序列丛集/常间回文重复 |
| 3.1 常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集 |
| 3.2 AAV载体在CRISPR/Cas系统中的应用 |
| 4 AAV在视网膜相关遗传性疾病基因治疗中的应用 |
| 4.1基因治疗在遗传性眼病中的应用 |
| 4.2 AAV载体在视网膜色素变性中的应用 |
| 4.3 AAV载体在LCA中的应用 |
| 5 小结 |
（3）新型Cas9/RecA基因编辑技术治疗视网膜色素变性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 视网膜色素变性 |
| 1.1.1 视觉、眼睛与视网膜 |
| 1.1.2 视网膜与视觉疾病 |
| 1.1.3 视网膜色素变性 |
| 1.1.4 视网膜色素变性病因 |
| 1.2 基因治疗 |
| 1.2.1 基因治疗的目的 |
| 1.2.2 基因治疗的发展 |
| 1.2.3 基因治疗的分类 |
| 1.2.4 基因编辑治疗 |
| 1.2.5 在体基因治疗与视觉疾病 |
| 1.2.6 在体基因编辑治疗应用与限制 |
| 1.3 基因编辑治疗的研究现状 |
| 1.3.1 基因编辑治疗的出现——核酸酶技术发展 |
| 1.3.2 基因编辑治疗的曙光——CRISPR/Cas9 |
| 1.3.3 基因编辑治疗的快速发展 |
| 1.3.4 基因编辑治疗走向临床 |
| 1.3.5 基因编辑治疗的新策略 |
| 1.4 选题意义 |
| 1.4.1 选题理由 |
| 1.4.2 创新点 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.1.1 常用试剂 |
| 2.1.2 常用溶液 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验动物 |
| 2.3.1 动物伦理声明 |
| 2.3.2 实验动物饲养 |
| 2.3.3 转基因动物繁育 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 小鼠基因鉴定 |
| 2.4.2 质粒提取与质粒构建 |
| 2.4.3 mRNA检测 |
| 2.4.4 体外同源重组效率检测 |
| 2.4.5 幼鼠视网膜在体电穿孔转染 |
| 2.4.6 视杆细胞修复检测 |
| 2.4.7 Cas9脱靶检测 |
| 2.4.8 小鼠视网膜感光细胞形态学观察 |
| 2.4.9 离体视网膜电图记录 |
| 2.4.10 瞳孔光反射检测 |
| 2.5 数据分析 |
| 2.5.1 分析软件 |
| 2.5.2 分析方法 |
| 第3章 结果分析和讨论 |
| 3.1 Cas9/RecA系统设计原理 |
| 3.1.1 Cas9系统诱导双链断裂 |
| 3.1.2 RecA促进链交换反应和同源修复序列的富集 |
| 3.1.3 MS2系统可以将RecA蛋白拉到Cas9作用位点附近 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 Cas9/RecA系统可以促进体外细胞的同源重组效率提升 |
| 3.2.1 Cas9/RecA系统不影响非同源粘性末端连接效率 |
| 3.2.2 Cas9/RecA系统可以促进同源重组效率提升 |
| 3.2.3 小结 |
| 3.3 rd1视网膜色素变性模型小鼠验证在体基因编辑的可行性验证 |
| 3.3.1 rd1小鼠中并不存在其他影响视觉功能的基因 |
| 3.3.2 rd1小鼠pde6b基因内含子插入序列不影响mRNA剪接 |
| 3.4 Cas9/RecA系统诱发了在体同源重组修复 |
| 3.4.1 Cas9/RecA系统在体编辑系统设计 |
| 3.4.2 分子生物学手段检测同源重组的发生 |
| 3.4.3 Cas9/RecA系统在体基因编辑治疗过程中未检测到脱靶 |
| 3.4.4 小结 |
| 3.5 PO阶段干预延缓了视网膜光感受器细胞的退化 |
| 3.5.1 视杆细胞退化显着抑制 |
| 3.5.2 视锥细胞退化显着抑制 |
| 3.5.3 修复的视杆细胞和视锥细胞集中在视网膜中心区域 |
| 3.5.4 小结 |
| 3.6 P3阶段干预延缓了视网膜光感受器细胞的退化 |
| 3.6.1 P3阶段小鼠视网膜光感受器细胞处于非分裂状态 |
| 3.6.2 视杆细胞退化显着抑制 |
| 3.6.3 视锥细胞退化显着抑制 |
| 3.6.4 小结 |
| 3.7 生理功能检测显示Cas9/RecA系统修复的有效性 |
| 3.7.1 Cas9/RecA系统修复rd1小鼠出现感光能力 |
| 3.7.2 视杆细胞贡献了修复的感光能力 |
| 3.7.3 感光诱发的电活动随光强增加而增加 |
| 3.7.4 P3天修复也可以修复部分感光能力 |
| 3.7.5 所修复的光感受器细胞可以向下传递电活动 |
| 3.7.6 小结 |
| 3.8 行为学检测显示Cas9/RecA系统修复的有效性 |
| 3.8.1 Cas9/RecA系统修复rd1小鼠出现瞳孔光反射 |
| 3.8.2 弱光下的瞳孔光反射由视杆细胞介导 |
| 3.8.3 小结 |
| 3.9 结论 |
| 3.10 讨论 |
| 3.10.1 Cas9/RecA系统对于促进同源重组修复的意义和有效性 |
| 3.10.2 非分裂细胞实现同源重组修复 |
| 3.10.3 视锥细胞残留为基因编辑治疗视杆细胞后的继发性治疗过程 |
| 3.10.4 比较多种基因编辑手段Cas9/RecA具有明显的优势 |
| 第4章 总结和展望 |
| 4.1 拓展应用到非人灵长类动物模型中 |
| 4.2 在体基因编辑治疗的不断加深突破 |
| 4.3 促进基因编辑研究领域的交叉融合 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文以及所获奖项 |
（4）蛋白组学分析吸烟对ARMS2/HTRA1高危型RPE细胞的影响及优化干细胞系建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、吸烟者血清作用于ARMS2/HTRA1 高危型及野生型RPE细胞的i TRAQ蛋白组学分析 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要试剂配制 |
| 1.1.4 主要设备仪器 |
| 1.1.5 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 iPSCs-RPE细胞的形态特征及RPE特异性标志物鉴定 |
| 1.2.2 人原代RPE细胞获得及基因分型 |
| 1.2.3 最佳血清作用浓度为20% |
| 1.2.4 基于iTRAQ蛋白组学分析结果 |
| 1.2.5 差异蛋白验证 |
| 1.2.6 吸烟者血清刺激高危型iPSCs-RPE细胞后吞噬功能增强 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 AMD疾病细胞模型 |
| 1.3.2 高通量蛋白质谱表明吸烟者血清刺激后,高危型和野生型的蛋白表达存在明显差异 |
| 1.3.3 吸烟者血清暴露后高危型RPE细胞的吞噬功能增强 |
| 1.4 小结 |
| 二、HTRA1与Caveolin-1 的关系探索 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要设备仪器 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 成功构建HTRA1 过表达慢病毒 |
| 2.2.2 过表达HTRA1后Caveolin-1 蛋白表达上调 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立高危型及野生型优化干细胞系 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要设备仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 RPE细胞移植的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）CRISPR/Cas9介导基因编辑制备FoxJ1缺失小鼠气道上皮细胞和遗传修饰雪貂模型（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 CRISPR/CAS9基因编辑技术在动物模型制备中的应用 |
| 1.2 气道上皮干细胞研究进展 |
| 第二章 CRISPR/CAS9介导基因编辑联合靶向报告基因富集FoxJ1基因敲除小鼠原代呼吸道上皮细胞 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论与结论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 CRISPR/CAS9介导非同源末端连接构建ROSA26“着陆点”荧光报告基因雪貂模型 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论与结论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 CRISPR/CAS9介导同源重组建立αSMA-CreERT2敲入转基因雪貂模型 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论与结论 |
| 4.6 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）肝细胞生长因子HGF通过Dll4/Notch信号通路调节RF/6A细胞的生物学功能（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略语与符号 |
| 引言 |
| 第一部分 GEO数据库分析AMD患者与正常人眼组织中HGF的含量及功能预测 |
| 材料与方法 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 缺氧条件下人视网膜色素上皮细胞中HGF含量的变化及外源性HGF蛋白对RF/6A细胞的影响 |
| 材料与方法 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 共培养条件下HGF siRNA转染人视网膜色素上皮细胞对RF/6A细胞的影响及其相关机制探究 |
| 资料与方法 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）丝氨酸蛋白酶HtrA1对蓝光损伤人视网膜色素上皮细胞的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略语与符号 |
| 引言 |
| 第一部分 人视网膜色素上皮细胞光损伤模型的建立及丝氨酸蛋白酶HtrA1的表达研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 siRNA介导丝氨酸蛋白酶HtrA1沉默对光损伤模型人视网膜色素上皮细胞增殖、迁徙以及凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 下调丝氨酸蛋白酶HtrA1表达对光损伤模型人视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子A影响及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 年龄相关性黄斑变性流行病学及相关基因研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 视网膜母细胞瘤相关基因研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（8）腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因抑制PVR的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、PVR动物模型的建立 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 对象 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 眼科检查结果 |
| 1.2.2 眼科B超结果 |
| 1.2.3 PVR分级 |
| 1.2.4 组织病理学检查 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 PVR的基本病理过程和分期 |
| 1.3.2 常见PVR动物模型的建立方法 |
| 1.3.3 玻璃体腔注射人PRP联合巩膜外冷冻建立兔PVR模型 |
| 1.4 小结 |
| 二、p21~(WAF1/CIP1)在PVR发病中作用机制的研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 对象 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 WB方法检测视网膜p21~(WAF1/CIP1)、CDK2、cyclin E蛋白表达 |
| 2.2.2 RT-PCR法检测视网膜p21~(WAF1/CIP1)、CDK_2、cyclin E mRNA的表达 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 细胞因子在PVR发病中的作用 |
| 2.3.2 细胞周期及其调控机制 |
| 2.3.3 p21~(WAF1/CIP1)的生物学功能 |
| 2.3.4 p21~(WAF1/CIP1)在PVR发病机制中的作用 |
| 2.4 小结 |
| 三、腺病毒介导外源性p21~(WAF1/CIP1)基因抑制体外培养hRPE细胞增殖及迁移 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 对象 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 p21~(WAF1/CIP1)基因转染人视网膜色素上皮细胞形态及数目的影响 |
| 3.2.2 MTT法检测细胞增殖 |
| 3.2.3 Transwell检测细胞迁移 |
| 3.2.4 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 3.2.5 WB法检测p21~(WAF1/CIP1)、CDK_2、cyclin E蛋白的表达 |
| 3.2.6 RT-PCR方法检测p21~(WAF1/CIP1)、CDK_2、cyclin E mRNA的表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 RPE细胞在PVR发病中的作用研究 |
| 3.3.2 p21~(WAF1/CIP1)基因对hRPE细胞增殖及迁移能力的影响 |
| 3.3.3 腺病毒转染p21~(WAF1/CIP1)基因对hRPE细胞周期调控的机制 |
| 3.4 小结 |
| 四、腺病毒介导p21~(WAF1/CIP1)基因抑制兔PVR的实验研究 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 对象 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 临床观察结果及PVR分级 |
| 4.2.2 标本大体观察及病理结果 |
| 4.2.3 WB及RT-PCR检测视网膜p21~(WAF1/CIP1)、CDK_2、cyclin E表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 腺病毒介导堆因转染技术在眼部疾病中的应用 |
| 4.3.2 增生性玻璃体视网膜病变的治疗现状 |
| 4.3.3 腺病毒介导p21~(WAF1/CIP1)基因对PVR的抑制作用 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（9）新型高分子脂质体优化转染VEGF siRNA对视网膜新生血管抑制的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、高分子脂质体的制备、表征研究及转染条件优化 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 VEGF siRNA的设计与合成 |
| 1.1.3 质粒的制备 |
| 1.1.4 高分子脂质体的制备 |
| 1.1.5 高分子脂质体及质粒-高分子脂质体复合物的表征分析 |
| 1.1.6 高分子脂质体的细胞毒性实验 |
| 1.1.7 高分子脂质体转染条件的筛选 |
| 1.1.8 高分子脂质体与Lipo转染效率的比较 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 紫外分光光度计行浓度和纯度检测 |
| 1.2.2 测序结果 |
| 1.2.3 高分子脂质体及质粒-高分子脂质体复合物的表征分析 |
| 1.2.4 高分子脂质体的细胞毒性实验 |
| 1.2.5 高分子脂质体转染条件的优化 |
| 1.2.6 高分子脂质体转染效率的研究 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.2 基因治疗及RNA干扰的发现 |
| 1.3.3 siRNA的筛选 |
| 1.3.4 siRNA的合成 |
| 1.3.5 转染试剂的选择 |
| 1.3.6 阳离子脂质体转染机制及影响转染的因素分析 |
| 1.3.7 高分子脂质体的细胞毒性 |
| 1.4 小结 |
| 二、高分子脂质体转染siRNA抑制RPE分泌VEGF的研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 对象 |
| 2.1.2 主要方法 |
| 2.1.3 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 荧光显微镜下观察各组转染效果 |
| 2.2.2 ELISA法检测RPE细胞分泌VEGF的变化 |
| 2.2.3 免疫组织化学法检测VEGF的表达变化 |
| 2.2.4 Real-time PCR分析VEGF mRNA的变化 |
| 2.2.5 倒置显微镜下观察细胞状态 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 视网膜色素上皮细胞的特性 |
| 2.3.2 缺氧对VEGF表达和新生血管生成的影响 |
| 2.3.3 VEGF siRNA对细胞分泌VEGF的影响 |
| 2.3.4 非病毒载体的基因转染 |
| 2.4 小结 |
| 三、高分子脂质体介导转染VEGFsiRNA抑制鼠视网膜新生血管的实验研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 对象 |
| 3.1.2 主要方法 |
| 3.1.3 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 动物模型的建立 |
| 3.2.2 脂质体介导的质粒在小鼠视网膜中的表达 |
| 3.2.3 不同实验组视网膜血管形态学的变化 |
| 3.2.4 高氧诱导视网膜血管增生的定量结果 |
| 3.2.5 高分子脂质体携带质粒DNA穿膜能力评判 |
| 3.2.6 Westernblot检测不同实验组视网膜VEGF的表达变化 |
| 3.2.7 Real-time PCR检测不同组间VEGFmRNA的变化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 氧诱导视网膜新生血管动物模型的建立与鉴定 |
| 3.3.2 RNAi用于眼部新生血管性疾病的治疗 |
| 3.3.3 抑制眼部新生血管的基因转染方法 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| Reference |
| 致谢 |
（10）白内障患者诱导性多能干细胞（iPS）的建立及其定向分化的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 原代人晶体上皮细胞的体外培养 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 白内障患者诱导性多能干细胞的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 白内障患者诱导性多能干细胞的鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 白内障患者诱导性多能干细胞向晶体前体细胞的分化诱导 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 诱导多能干细胞(iPS)在眼科的研究与应用进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表情况 |
| 在读期间获奖情况 |
| 致谢 |
四、三种基因导入系统对视网膜色素上皮细胞转染效率的研究（论文参考文献）
- [1]干细胞外泌体miR-141对视网膜氧化应激损伤的保护作用及机制[D]. 由佳鑫. 吉林大学, 2021(01)
- [2]腺相关病毒在视觉系统神经示踪及眼科治疗中的应用进展[J]. 蔡丹瑞,沈吟. 医学综述, 2020(22)
- [3]新型Cas9/RecA基因编辑技术治疗视网膜色素变性[D]. 才源. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [4]蛋白组学分析吸烟对ARMS2/HTRA1高危型RPE细胞的影响及优化干细胞系建立[D]. 蔡斌翠. 天津医科大学, 2019
- [5]CRISPR/Cas9介导基因编辑制备FoxJ1缺失小鼠气道上皮细胞和遗传修饰雪貂模型[D]. 于淼. 宁夏大学, 2019(02)
- [6]肝细胞生长因子HGF通过Dll4/Notch信号通路调节RF/6A细胞的生物学功能[D]. 纪振宇. 武汉大学, 2018(03)
- [7]丝氨酸蛋白酶HtrA1对蓝光损伤人视网膜色素上皮细胞的影响及机制研究[D]. 余天. 武汉大学, 2017(06)
- [8]腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因抑制PVR的研究[D]. 袁志刚. 天津医科大学, 2012(01)
- [9]新型高分子脂质体优化转染VEGF siRNA对视网膜新生血管抑制的实验研究[D]. 高妍. 天津医科大学, 2012(01)
- [10]白内障患者诱导性多能干细胞（iPS）的建立及其定向分化的研究[D]. 邱晓頔. 复旦大学, 2012(04)