一、小鼠颌下腺表皮生长因子的制备及纯化（论文文献综述）
王傲晨[1]（2021）在《SCAP外泌体通过hsa-piR-15254抑制Th17分化治疗舍格伦综合征的实验研究》文中研究指明目的:舍格伦综合征（Sjogren’s syndrome,SS）是一种以唾液腺进行性分泌功能下降和淋巴细胞浸润为主要病理特征的慢性自身免疫性疾病,主要表现为口干、唾液腺及泪腺肿大,可累及或伴发全身多系统免疫性损害,严重影响患者的生活质量。T淋巴细胞大量浸润和功能异常是SS的重要病理机制,其中辅助性T细胞17（T helper 17,Th17）是一类具有促炎作用的T细胞亚群,在SS的发病和进展过程中起着重要作用。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）因其具有自我更新、多向分化潜能及免疫调节特性为SS提供了新的治疗方向。MSCs来源的外泌体（exosomes derived from MSCs,MSC-Exo）是MSCs分泌的一种纳米级别的膜性囊泡,具有和MSCs相似的免疫调节能力,对SS具有一定的疗效。根尖牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla,SCAP）分离提取于年轻恒牙根尖牙乳头,是神经嵴来源的成体干细胞群,体外扩增能力强,来源充足,获取无医源性创伤,尤其在调控T细胞分化中表现出独特的优势。SCAP来源的外泌体（exosomes derived from SCAP,SCAP-Exo）对SS的治疗效果和作用机制尚不清楚。MSC-Exo中的非编码RNA被认为是其发挥功能的主要物质,其中PIWI-interactingRNA（piRNA）是新发现的一类内源性非编码小RNA,可通过靶向结合mRNA的3’UTR区并诱导其降解,进而调控细胞表型与功能,在自身免疫性疾病的发病和T细胞的分化中均具有重要作用。本实验应用SS小鼠模型,通过尾静脉注射SCAP-Exo,观察其对SS小鼠唾液分泌、颌下腺淋巴细胞浸润水平以及外周血和脾脏内Th17细胞比例的影响;并通过体外实验探究SCAP-Exo及其piRNA对Th17分化的调控作用,为牙源性MSC-Exo应用于SS治疗提供理论基础。研究方法:1.分离提取SCAP,采用流式细胞术、成骨和成脂分化实验对其进行鉴定。采用超高速离心法提取SCAP-Exo,通过纳米颗粒跟踪技术和透射电镜对SCAP-Exo的形态及粒径进行分析;Western blot检测外泌体特异性标记蛋白Alix、CD9、CD63及细胞内质网特异性蛋白Calnexin的表达。2.以NOD/Ltj小鼠作为SS动物模型,检测唾液分泌水平并通过HE染色观察颌下腺淋巴细胞浸润程度,对SS小鼠进行鉴定;尾静脉注射SCAP-Exo,检测唾液分泌水平,ELISA检测血清中IL-17A表达水平,流式细胞术检测脾脏及外周血中Th17亚群比例,HE染色观察颌下腺淋巴细胞浸润程度,免疫荧光染色观察颌下腺Th17细胞浸润程度。3.免疫磁珠法分离外周血中CD4+T细胞,并构建CD4+T细胞向Th17分化的诱导体系,分别加入不同浓度的SCAP-Exo（20,40μg/m L）,流式细胞术检测Th17细胞比例,ELISA检测细胞上清液中IL-17A表达水平,qRT-PCR检测Th17相关基因IL-17A、IL-21、RORγt的mRNA表达水平。4.以骨髓间充质干细胞来源的外泌体（exosomes derived from bone marrow MSCs,BMMSC-Exo）为对照组,对SCAP-Exo和BMMSC-Exo中的piRNA进行高通量测序,统计、分析piRNA表达谱,并对SCAP-Exo中表达量前四十的piRNA进行靶基因预测和生物信息学分析,筛选与Th17分化相关的piRNA。通过数据分析,选取hsa-piR-15254为目标piRNA,IL-6R为其候选靶基因。5.PKH67荧光标记SCAP-Exo,观察SCAP-Exo被CD4+T细胞胞吞情况;SCAP-Exo处理CD4+T细胞,qRT-PCR检测hsa-piR-15254表达水平;双荧光素酶报告基因活性检测hsa-piR-15254与IL-6R mRNA的靶向结合性;构建hsa-piR-15254 mimics及hsa-piR-15254 inhibitor,并加入CD4+T细胞向Th17分化的诱导体系,流式细胞术检测Th17细胞比例,ELISA检测细胞上清液中IL-17A表达水平,qRT-PCR检测IL-6R、IL-17A、IL-21、RORγt的mRNA表达水平。6.应用SPSS 21.0统计软件,两两比较采用方差分析（LSD-t检验）,颌下腺病理评分分级采用秩和检验,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.SCAP阳性表达间充质干细胞表面标记物CD73、CD90及CD105,不表达造血干细胞表面标记物CD31、CD34、CD45;成脂诱导4周后,可见细胞内脂滴形成;成骨诱导4周后可见矿化结节形成。超高速离心法能够成功从SCAP培养上清中提取SCAP-Exo,粒径大小为30-150 nm,透射电镜下可见SCAP-Exo呈椭圆形杯状囊泡样结构,Western blot显示SCAP-Exo阳性表达Alix、CD9和CD63,而不表达细胞内质网特异性蛋白Calnexin。2.NOD/Ltj小鼠具备SS的病理特征,HE染色可见颌下腺内呈现明显的淋巴细胞浸润灶,唾液分泌量显着低于健康小鼠（P<0.01）。尾静脉注射SCAP-Exo后,SS小鼠唾液分泌水平得到显着改善;HE染色发现颌下腺淋巴细胞浸润团明显减少、缩小,甚至消失;免疫荧光染色发现颌下腺中Th17细胞浸润减少,流式细胞术检测脾脏及外周血中Th17细胞比例下降;ELISA检测血清中IL-17A表达水平降低,且差异均具有统计学意义（P<0.01）。3.免疫磁珠法分离的外周血中CD4+T细胞纯度可达90%以上;20μg/m L、40μg/m L的SCAP-Exo均能抑制CD4+T细胞向Th17分化,细胞上清液中IL-17A浓度及Th17相关基因RORγt、IL-17A、IL-21的mRNA表达水平显着下调;且40μg/m L的SCAP-Exo抑制效果更为明显（P<0.05）。4.高通量测序发现SCAP-Exo中piRNA表达丰富,共发现593种piRNA表达;表达量前四十的piRNA的靶基因与Th17细胞分化相关信号通路呈显着富集关系;其中,hsa-piR-15254在SCAP-Exo中高表达,并且可能靶向抑制Th17细胞分化通路的关键信号IL-6R。故选取hsa-piR-15254作为研究SCAP-Exo调控CD4+T细胞向Th17分化机制的目标piRNA。5.外泌体示踪实验发现荧光标记的SCAP-Exo能够被CD4+T细胞胞吞,并上调CD4+T细胞中hsa-piR-15254的表达;双荧光素酶报告基因检测证实hsa-piR-15254与Th17分化的关键信号IL-6R的mRNA存在靶向结合作用;SCAP-Exo中高表达的hsa-piR-15254可通过靶向结合IL-6R抑制CD4+T细胞向Th17分化,细胞上清液中IL-17A浓度（P<0.05）及Th17相关基因RORγt、IL-17A、IL-21的mRNA表达水平下调（P<0.05）。结论:SCAP-Exo能够改善SS小鼠唾液分泌,减少颌下腺淋巴细胞浸润,降低颌下腺、脾脏以及外周血内Th17细胞亚群比例与血清中IL-17A表达水平;SCAP-Exo能够被CD4+T细胞胞吞并转运hsa-piR-15254,靶向调控IL-6R的表达,抑制CD4+T细胞向Th17分化及Th17相关基因和蛋白表达水平,进而发挥免疫调控作用。
王金阳[2]（2020）在《小鼠和人Leg1的结构和功能探究》文中研究表明家畜的健康生长以及饲料营养的充分消化吸收和利用是提高家畜生产效率的关键之一。唾液腺可以分泌多种类型的生长因子、消化酶以及消化辅助因子,同时,利用转基因技术可以在唾液腺中表达有助于动物生长和营养消化的目的蛋白,因此,研究唾液腺蛋白的表达调控和功能有望应用于畜牧生产。Leg1（Liver-enriched gene 1）是一个在多种脊椎动物间保守存在的分泌蛋白。本实验室之前的研究率先对小鼠中的Leg1蛋白（MLEG1）展开研究。我们发现,在小鼠中的MLEG1可能是一种新的脂肪代谢调节因子,它在唾液腺表达并分泌到唾液中,能够耐受胃液和肠液等消化液的降解进入血液循环到达肝脏并对肝脏的功能进行调控,主要对一些脂肪合成转录因子的表达进行调节。然而,目前关于Leg1蛋白的转录后修饰、结构和功能域等研究甚少,对人体内的Leg1蛋白（HLEG1）研究尚处空白,这给我们对研究Leg1的功能研究和应用带来了极大挑战。本论文在小鼠中MLEG1的功能研究基础上对小鼠和人中Leg1蛋白开展进一步研究。首先我们对小鼠中MLEG1的化学修饰及修饰与功能的关系进行了研究,其次我们使用冷冻电镜手段对MLEG1的蛋白结构进行了探索,最后我们探究了人中HLEG1的表达,HLEG1的修饰及HLEG1蛋白与人类健康可能存在的关系。本论文研究发现MLEG1在第171、196和257三个天冬酰胺位点有N-糖基化修饰,在119、123两个丝氨酸位点有O糖基化修饰,两种糖基化修饰互相影响。我们还发现在第117位天冬酰胺上存在一种未知的化学修饰,这种化学修饰依赖于第119位丝氨酸而存在,且能被糖苷酶PNGaseF识别切割。此外,我们通过冷冻电镜手段初步分析了带有糖基化修饰的MLEG1蛋白结构,为确认结构与功能的关系奠定了基础。本论文也开展了人中HLEG1的修饰与功能研究,共收集了 621例人类唾液样品测定其中HLEG1丰度,分析唾液样品中HLEG1丰度与多种生理指标的关联性,试图从唾液中开发一种新的标记因子对人体健康进行监控。我们的研究结果有助于今后揭示人唾液蛋白HLEG1的功能及其潜在的信号传导途径。综上所述,本论文对Leg1在小鼠和人中的化学修饰和功能进行了深度扩展,确认了两者的糖基化修饰,展开了 MLEG1蛋白的冷冻电镜研究,开启了在人唾液中HLEG1丰度作为新标记因子的研究,为以后MLEG1与HLEG1功能的研究打下坚实基础。此外,鉴于leg1基因在唾液腺相对特异高表达的特性,在家畜育种过程中可以根据生产需求利用leg1基因的启动子构建唾液特异性表达目的基因的转基因动物,这可能有助于我们对农业动物进行种质改良,进而达到提高生产效率,降低环境污染等目的。
孔维平[3]（2020）在《低氧预处理人羊膜间充质干细胞对放射性损伤鼠涎腺上皮细胞修复作用的研究》文中提出目的:研究低氧预处理人羊膜间充质干细胞是否对鼠放射性损伤涎腺上皮细胞具有保护及功能修复作用。方法:（1）3天大的SD大鼠新生鼠取其双侧下颌下腺腺体组织,利用酶消化法分离下颌下腺的细胞,胰蛋白酶差速消化法和差速贴壁法纯化原代细胞;（2）下颌下腺细胞传至P2时,使用免疫组织化学法对细胞的角蛋白7（CK-7）进行鉴定;（3）遵义医科大学组织工程实验室提供P3人羊膜间充质干细胞,并行流式细胞仪行细胞表型鉴定;（4）实验分为4组;空白对照组（颌下腺上皮细胞未行放射处理组）、5Gy放射对照组（颌下腺上皮细胞行5Gy放射处理但不和hAMSCs共培养组）、低氧共培养组（低氧预处理hAMSCs和颌下腺上皮细胞5Gy放射后共培养7天组）、常氧共培养组（hAMSCs和颌下腺上皮细胞5Gy放射后共培养处理7天组）;（5）利用电子直线加速器对P3代大鼠下颌下腺上皮细胞行5Gy放射处理;（6）按既定分组共培养7天后,分别收集每组细胞上清液,使用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定各组下颌下腺上皮细胞唾液淀粉酶α1（AMY1）的含量;CCK-8（Cell Counting Kit-8）技术检测各组细胞的增殖活性;Annexin V-FITC/PI流式细胞技术对各组细胞的凋亡进行检测;应用Quantitative real-time-PCR检测各组细胞AQP5m RNA的表达量。结果:（1）P2大鼠下颌下腺上皮细胞生长形态均一,呈铺路石样排列、贴壁生长,鼠下颌下腺细胞CK7呈阳性表达,证明该细胞为上皮来源。（2）P3 hAMSCs生长形态较为均一,细胞呈长梭形、漩涡状并且贴壁生长。流式细胞仪鉴定示:hAMSCs高表达CD44、CD73、CD90和CD105,低表达CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR。（3）按既定分组共培养7天后行细胞功能的相应检查,唾液α-淀粉酶含量测定:空白对照组明显高于共培养组,5Gy放射对照组含量最低（P<0.05）,低氧共培养组较常氧共培养组淀粉酶含量有升高趋势,但是差异不具有统计学意义。（4）细胞增殖活性cck-8示:空白对照组的细胞增殖活性比共培养组高,5Gy放射对照组最低,低氧预处理组比常氧组高（P<0.05）。（5）流式细胞仪检测细胞凋亡示:空白对照组凋亡最低,5Gy放射对照组最高（P<0.05）,低氧共培养组较常氧共培养组有升高趋势,但是差异不具有统计学意义。（6）Quantitative real-time-PCR检测各组细胞AQP5m RNA示:空白对照组的表达量是最高的,5Gy放射对照组表达量是最低的,共培养组居中,组间差异均具有统计学意义（P<0.05）,低氧预处理hAMSCs后共培养组较常氧共培养组有升高趋势,但是差异不具有统计学意义。结论:hAMSCs共培养对放射性损伤颌下腺上皮细胞具有具有保护及功能修复作用;低氧预处理hAMSCs共培养对放射性损伤颌下腺上皮细胞的保护及功能修复作用较常氧hAMSCs共培养组有提高趋势。
姚静宜[4]（2020）在《鸡胚表皮生长因子（gEGF）粗提物对肉仔鸡的作用效果研究》文中认为本课题以振宁黄鸡鸡胚和1日龄振宁黄鸡肉仔鸡为研究对象,首先测定孵化过程鸡胚gEGF含量变化,在此基础上,开展鸡胚gEGF粗提物对振宁黄鸡肉仔鸡生长性能、血清生化指标、免疫、抗氧化能力和肠道结构功能的影响研究。试验选取120个振宁黄鸡受精蛋进行孵化,每天选取6个正常发育鸡胚测定其gEGF含量;根据鸡胚gEGF测定结果确定其含量最高日龄鸡胚,以此日龄鸡胚为对象提取制备gEGF粗提物。饲养试验选取1500羽体重相近的1日龄振宁黄鸡母鸡,随机分为5组,每组6个重复,每个重复50羽。对照组饲喂玉米-豆粕型无抗基础饲粮,试验组分别饲喂添加4、8、16和32 ng/kg鸡胚gEGF的试验饲粮,试验期30d。试验结束时每个重复随机挑选2羽肉仔鸡,共60羽进行屠宰取样。主要试验结果如下:1、鸡胚gEGF含量测定结果表明,1-5日龄鸡胚内gEGF含量随日龄增加显着上升,5日龄达到最高值,为5592.60pg/g鸡胚;与5日龄相比,6-20日龄鸡胚gEGF含量显着下降。2、饲养试验结果表明,与对照组相比,添加4和16 ng/kg鸡胚gEGF组平均日增重提高了 5.24%（P<0.05）和4.57%（P<0.05）,平均日采食量提高了 6.35%和 5.93%（P<0.05）。3、血清生化指标结果表明,与对照组相比,各试验组血清UA浓度分别降低了 18.61%（P<0.05）、16.18%（P<0.05）、29.54%（P<0.05）和 16.18%（P<0.05）;8和16 ng/kg鸡胚gEGF组血清AKP浓度分别增加了 98.84%（P<0.05）和 219.54%（P<0.05）;4、8 和 16 ng/kg 鸡胚 gEGF 组血清 GOT 浓度分别降低了 40.11%（P<0.05）、44.50%（P<0.05）和 41.06%（P<0.05）。4、抗氧化指标结果表明,与对照组相比,试验组肝脏MDA水平分别下降了 30.56%（P<0.05）、48.61%（P<0.05）、51.39%（P<0.05）和 47.22%（P<0.05）;4、8和16 ng/kg鸡胚gEGF组肝脏CAT活性分别提高了 48.51%（P<0.05）、58.10%（P<0.05）和 34.68%（P<0.05）;16 和 32ng/kg 鸡胚 gEGF 组血清 CAT 活性分别提高了 140.35%（P<0.05）和 116.23%（P<0.05）;4 ng/kg 鸡胚 gEGF 组肝脏 T-SOD 活性提高了 33.75%（P<0.05）;4 和 16ng/kg 鸡胚 gEGF组血清MDA水平分别下降了 21.36%（P<0.05）和20.71%（P<0.05）。5、血清免疫球蛋白指标结果表明,与对照组相比,8和16 ng/kg鸡胚gEGF组血清 IgA 浓度分别升高了 29.89%（P<0.05）和 39.84%（P<0.05）;4 和 8 ng/kg鸡胚 gEGF 组血清 IgM 浓度分别提高了 18.44%（P<0.05）和 18.58%（P<0.05）。6、肠道结构指标结果表明,（1）与对照组相比,试验组空肠绒隐比分别提高了 27.76%（P<0.05）、53.31%（P<0.05）、72.08%（P<0.05）和 35.17%（P<0.05）;其中 8 和 16 ng/kg 鸡胚gEGF组空肠隐窝深度分别降低了 34.48%（P<0.05）和34.84%（P<0.05）;（2）与对照组相比,2和16 ng/kg鸡胚gEGF组回肠隐窝深度分别降低了29.29%（P<0.05）和 44.99%（P<0.05）;16 ng/kg 鸡胚 gEGF 组回肠绒隐比提高了 45.66%（P<0.05）;（3）与对照组相比,4、8和16 ng/kg鸡胚gEGF组空肠相对长度分别提高了 21.62%（P<0.05）、26.51%（P<0.05）和 37.89%（P<0.05）;各试验组回肠相对长度分别提高了 27.65%（P<0.05）、31.01%（P<0.05）、38.37%（P<0.05）和 29.50%（P<0.05）。7、肠道消化酶结果显示,与对照组相比,4、8和16ng/kg鸡胚gEGF组十二指肠淀粉酶活性提高了 13.37%（P<0.05）、20.70%（P<0.05）和35.65%（P<0.05）;8和16ng/kg鸡胚gEGF组空肠胰蛋白酶活性分别提高了 45.03%（P<0.05）和56.51%（P<0.05）;16和32ng/kg鸡胚gEGF组空肠脂肪酶活性均提高了 60.43%（P<0.05）;4、8和16 ng/kg鸡胚gEGF组胰腺淀粉酶活性分别提高了 60.47%（P<0.05）、97.67%（P<0.05）和 127.91%（P<0.05）;4、8 和 16ng/kg鸡胚gEGF组胰腺胰蛋白酶活性分别提高了 80.15%（P<0.05）、62.06%（P<0.05）和99.96%（P<0.05）;4 ng/kg鸡胚gEGF组胰腺脂肪酶活性提高了 60.87%（P<0.05）。8、器官指数结果表明,与对照组相比,各试验组法氏囊指数提高了 23.38%、23.88%（P<0.05）、28.11%（P<0.05）和 38.06%（P<0.05）;32ng/kg 鸡胚 gEGF组胸腺指数、脾脏指数和十二指肠指数分别提高了 27.47%（P<0.05）、36.32%（P<0.05）和 21.98%（P<0.05）;16ng/kg 鸡胚 gEGF 组空肠指数提高了 37.89%（P<0.05）;8、16和32 ng/kg鸡胚gEGF组回肠指数分别提高了 16.97%（P<0.05）、27.43%（P<0.05）和 24.04%（P<0.05）。综上所述,本试验测得振宁黄鸡鸡胚孵化过程中gEGF含量在第5日龄达到最大值,制备所得鸡胚gEGF粗提物能显着提高1-30日龄振宁黄鸡的生长性能,提高免疫性能和抗氧化能力,改善小肠结构功能。综合各项指标,在本试验条件下,1-30日龄振宁黄鸡饲粮中鸡胚gEGF最适添加量为4ng/kg。
廖莎[5]（2019）在《利用转基因猪唾液腺生物反应器制备人神经生长因子》文中研究表明神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）是一种能促进神经元细胞增殖和分化的蛋白。提取自小鼠唾液腺的鼠源神经生长因子（mouse NGF,m NGF）在我国已被批准作为药物用于治疗人神经退化及损伤类疾病。m NGF虽然与人神经生长因子（human NGF,h NGF）同源性很高,但它在人细胞中的生物活性显着低于h NGF,且其作为药物用于人类临床治疗仍然存在免疫原性问题。因此,如能高效低成本生产高活性的h NGF,将可用其来替代目前使用的m NGF药物。动物唾液腺天然高水平表达高活性的NGF,这表明动物唾液腺是NGF表达的一个理想组织。此外,动物唾液腺也是一种潜在的高效的生物反应器。本研究的目的是利用转基因猪唾液腺作生物反应器生产h NGF。本研究将携带绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）筛选标记基因的h NGF表达载体转染猪胎儿成纤维细胞,筛选获得转h NGF基因单细胞克隆团,将其作为供体细胞通过体细胞克隆法制备出4头原代转h NGF基因猪;EGFP表达观察,PCR和Southern blot分析都证明该4头原代转基因猪基因组整合了外源的EGFP和h NGF基因;酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）检测结果显示转基因猪唾液中分泌的h NGF浓度约达600-1200ng/m L;用含高浓度h NGF的转基因猪唾液处理培养的PC12细胞证明其具有促进类神经元细胞分化的活性;为了防止转基因猪表达的内源猪神经生长因子（pig NGF,p NGF）“污染”从唾液中纯化的h NGF,本研究还构建了11个靶向猪神经生长因子（p NGF）基因的CRISPR/Cas9系统表达载体,选出两个突变p NGF基因效率最高的载体,将其共转染从转h NGF基因猪耳组织分离培养的的成纤维细胞后,成功筛选得到5个p NGF基因被敲除的转h NGF基因单细胞克隆团。该5个单细胞克隆团在后续研究中可作为供体细胞用体细胞克隆法制备p NGF基因敲除的转h NGF基因猪。综上,本研究成功建立了一种利用转基因猪唾液腺作为生物反应器制备人类药物蛋白的新技术,并为制备h NGF蛋白提供了一种高效的新方法。
刘浩[6]（2012）在《IL-21在舍格伦综合征发病过程中的作用机制》文中认为舍格伦综合征是一种可以引起外分泌腺分泌功能障碍的慢性系统性自身免疫疾病。根据临床特征可以分为两种类型：原发性舍格伦综合征和继发性舍格伦综合征。原发性舍格伦综合征特点是干燥性角结膜炎和口干症；继发性舍格伦综合征是原发性的症状伴发其他部位的自身免疫疾病,例如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和硬皮病等。舍格伦综合征的发病率为0.5-3%,女性中多见（是男性患者人数的9倍）。舍格伦综合征的发病机制至今尚不清楚,多种因素与其发病相关,例如内分泌因素、遗传因素、神经系统紊乱等,但最关键的致病因素是免疫系统的异常。IL-21是一种具有多种功能的I型细胞因子,在淋巴细胞的发育、增殖和分化过程中,尤其在抗体产生和浆细胞成熟过程中发挥关键作用。同时,很多研究也证明IL-21参与了多种自身免疫性疾病的发展过程,例如感染性肠病、风湿性关节炎、糖尿病、系统性红斑狼疮等,所以IL-21也被当做自身免疫性疾病治疗中的一种关键因子和治疗靶位。但IL-21在舍格伦综合征的作用尚不清楚,IL-21在舍格伦综合征发病中的作用和具体机制值得深入研究。因此,为了搞清IL-21在舍格伦综合征发病过程中的作用及其机制,我们选用了常用的舍格伦综合征模型动物NOD小鼠作为研究对象,通过在NOD小鼠中阻断IL-21信号通路,观察IL-21对NOD小鼠舍格伦综合征样症状的影响,并进一步优化NOD小鼠体内IL-21的干扰手段后,对IL-21在舍格伦综合征发病过程中的具体机制进行深入的研究。第一部分：在NOD小鼠体内阻断IL-21信号对舍格伦综合征发病的影响目的：使用融合蛋白IL-21R.Fc竞争性阻断IL-21与IL-21受体的结合,抑制NOD小鼠体内IL-21信号通路,检测NOD小鼠舍格伦综合征症状的变化,从而研究IL-21对舍格伦综合征发病的影响。方法：利用分子克隆技术以小鼠cDNA为模版分别PCR扩增IL-21受体胞外区片段和小鼠IgG2a的Fc片段,其中Fc片段的235、3]8、320和322为氨基酸进行诱导定点突变,以减少Fc受体结合活性和补体激活能力。然后将IL-21受体胞外区片段和Fc段基因插入质粒pcDNA3.1+构建成融合蛋白IL-21R.Fc的真核表达质粒pcDNA3.1-IL-21R.Fc。（?）勾建好的质粒用脂质体瞬时转染CHO细胞进行表达,收集培养上清和细胞裂解液利用亲和层析法对融合蛋白进行纯化,并进行SDS-PAGE电泳检验。将纯化的融合蛋白IL-21R.Fc通过尾静脉注射作用于NOD小鼠体内,定期检测唾液流速和颌下腺HE染色病理切片,对NOD小鼠的唾液分泌功能和颌下腺炎症浸润情况进行评价。结果：质粒pcDNA3.1-IL-21R.Fc构建成功,转染CHO细胞后成功表达并纯化得到融合蛋白IL-21R.Fc。通过融合蛋白IL-21R.Fc在NOD小鼠体内对IL-21信号的抑制作用,缓解了NOD小鼠的舍格伦综合征症状。唾液分泌功能障碍的进展减慢,颌下腺中的淋巴细胞浸润也得到了缓解。结论：IL-21信号在NOD小鼠的舍格伦综合征发病过程中发挥了重要的致病作用。对IL-21信号的阻断和抑制可能作为舍格伦综合征的一种有效治疗手段。第二部分：在NOD小鼠颌下腺局部抑制IL-21表达对舍格伦综合征的影响机制目的：使用表达IL-21shRNA的慢病毒表达载体通过颌下腺导管逆行灌注,在NOD小鼠颌下腺中长期抑制IL-21的表达,观察对NOD小鼠舍格伦综合征的影响,并对IL-21的作用机制进行研究分析。方法：通过IL-21shRNA的慢病毒载体逆行灌注NOD小鼠颌下腺,检查慢病毒对IL-21表达的抑制效果,定期检测唾液流速和颌下腺淋巴浸润情况。利用实时定量PCR对辅助T淋巴细胞相关细胞因子mRNA水平进行检测,研究IL-21抑制对NOD小鼠颌下腺中各种细胞因子的影响。利用流式细胞术和免疫组织化学法对NOD细胞中的CD4+CXCR5+Tfh细胞进行检测,观察IL-21抑制对Tfh细胞的影响。结果：IL-21shRNA的慢病毒表达载体明显抑制了IL-21在NOD小鼠颌下腺中的表达,并缓解了NOD小鼠的唾液分泌功能障碍和颌下腺淋巴浸润的进展。通过对NOD小鼠颌下腺中多种细胞因子的表达进行的实时定量PCR检测,发现IL-21的抑制对Tfh细胞相关的CXCR5和BCL-6有明显的抑制作用。NOD小鼠颌下腺中CD4+CXCR5+Tfh细胞占CD4+T淋巴细胞的比率在IL-21的表达受到抑制后得到明显降低,免疫组织化学法也发现颌下腺中CXCR5+细胞随着IL-21的抑制而减少。结论：在NOD小鼠颌下腺中局部抑制IL-21缓解了颌下腺的分泌功能障碍和淋巴细胞浸润的进展,延缓了舍格伦综合征在NOD小鼠颌下腺中的发展。IL-21的抑制主要通过影响Tfh细胞的分化发育,从而影响了生发中心的形成和自身反应性的浆细胞的成熟。综上所述,本课题证实了IL-21在舍格伦综合征发病过程中的重要致病作用,并且.验证了局部抑制IL-21在治疗舍格伦综合征中的有效性。根据实验数据我们发现IL-21通过影响Tfh细胞的分化发育,影响了颌下腺中生发中心的形成和自身反应性的浆细胞的成熟,从而导致了舍格伦综合征的发展。进一步探索IL-21的干预手段对舍格伦综合征的治疗有着重要的意义。
袁庆丰[7]（2007）在《外源性EGF促细胞增殖作用的信号转导机制和安全性研究及EGF药源开发》文中指出表皮生长因子（epidermal growth factor,缩写EGF）,是一强有力的细胞分裂因子,主要由颌下腺管细胞分泌。EGF对上皮细胞有促增殖作用,外源性EGF在临床中的应用开始于创伤治疗方面:如体表创伤、溃疡,角膜损伤等。由于人体大多数的EGF存在于消化道,远远高于循环中的EGF浓度,因此,EGF对消化道黏膜有效的保护作用使外源性EGF用于消化道疾病治疗成为了一个研究热点。研究同时也发现EGF和EGF受体（EGFR）拮抗剂可以影响肿瘤的发生、发展和消退,因此在临床中EGF的应用由于它潜在的安全性问题而受到了制约。由于EGF与EGFR激活及其信号转导通路十分复杂,病理生理功能多样,而Bcl-2、p53基因蛋白表达异常与肿瘤发生、发展有关,故迫切需要进一步研究它们在基础研究和临床实践中的地位。本实验首先检测不同浓度EGF在不同时间段对人胚胎羊膜细胞FL的促增殖作用,进一步检测不同浓度EGF与激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的时效关系以及对Bcl-2、p53蛋白表达的影响,为整体动物实验提供EGF应用的理论依据和实验数据。目前在临床中已经被采用的EGF外用材料主要来源于基因工程合成或小鼠颌下腺提取,价格十分昂贵,而且来源非常有限,这是制约EGF应用于临床的另一个重要原因。如果不能解决这个问题,即使研究阐明了EGF治疗的信号转导机制并证明其在临床实践中的积极意义,也无法赋予这项研究的现实的理论意义和应用价值。这是使得基础研究的成果具有应用可行性的最基本条件。联系我国目前的实际情况,如能简便,价廉地从家畜腺体提取到有生物学活性的EGF将是一件利国利民的好事。而同时我国每年又有大量的牲畜颌下腺被废弃,因此原材料来源丰富且成本低廉,并且作为重要的经济动物,羊类制品为人类接受程度高,这些都为EGF广阔的应用前景提供了最基本的保障。本论文的内容分以下两个部分:第一部分:外源性EGF促FL细胞增殖作用的信号转导机制及其安全性评价研究目的探讨EGF促FL细胞增殖时激活Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路时间-剂量-效应关系及对Bcl-2、p53蛋白表达的影响。材料与方法1.MTT法检测细胞增殖:细胞以2×108/L的密度接种于96孔板上,每孔100μ1。待细胞贴璧生长后换含不同浓度rhEGF（0.1、1、10、30、60μg/L）的无血清培养基继续培养,对照孔以生理盐水代替rhEGF。观察细胞生长形态学变化并分别在第1、2、3、4、5 d取样;或换含rhEGF（10μg/L）+不同浓度PD98059（25、50、75μmol/L）的MEM培养基100μ1,继续培养48 h。取样后每孔加入MTT 20μ1,孵育4 h后弃上清,每孔加150μ1 DMSO,振荡10 min,于酶标仪490 nm波长下测定各孔的吸光度A值。细胞增殖率=（实验组A值-对照组A值）/对照组A值×100%。2.Western蛋白印迹法检测Ras/Raf/MEK/ERK通路及Bcl-2、p53蛋白水平:待细胞贴璧生长后换用rhEGF终浓度为1、10、60μg/L无血清的MEM培养基继续培养:测定MAPK通路抑制剂PD98059的影响则分别加入终浓度为25,50,75μmol/L的PD98059,预处理1 h。实验开始后根据需要在不同时段用胰酶消化,收集细胞并加细胞裂解液,取上清液,Bradford法测蛋白浓度。每孔加50μg的蛋白样品电泳,电泳结束后转PVDF膜,将转有蛋白的膜置于5%BSA封闭,经一抗和HRP标记的二抗处理后,在暗室,取ECL发光试剂A、B液各1 ml,混合后覆盖于膜上1.5 min,最后用X光胶片进行曝光、显影及定影。结果1.FL细胞经培养48小时后,生理盐水对照组基本以多边形居多,而加入rhEGF后细胞以长条纺锤形居多。2.第1-5天中,1-60μg/L浓度组促细胞增殖率明显增高（P＜0.01）。rhEGF浓度10μg/L第3天时达到最高（42.4%,P＜0.01）,第4、5天后1-60μg/L浓度组促细胞增殖率开始下降,但仍高于对照组（P＜0.01）。3.各浓度PD98059可明显抑制EGF促FL细胞增殖作用（P＜0.01）,且随着剂量的加大其抑制作用愈明显。4.不同浓度rhEGF刺激30 min后p-Raf、p-ERK1/2蛋白诱导表达灰度分析结果示rhEGF 1-60μg/L浓度组p-Raf、p-ERK1/2蛋白较对照组明显升高（P＜0.05）,尤以10μg/L浓度组的作用最强。而非磷酸化ERK 1/2的表达无明显变化。5.rhEGF浓度10μg/L刺激FL细胞后测定连续时间段（0 min,5 min,30 min,1h,2 h）p-Raf、p-ERK1/2蛋白诱导表达结果示刺激第5 min-2 h各时间段p-Raf、p-ERK1/2活性表达呈峰型曲线,其中第5 min时p-Raf、p-ERK1/2活性最高（P＜0.01）,随后各时间段p-Raf、p-ERK1/2活性开始下降。2 h后p-Raf表达的水平即明显下降到刺激前的水平,与对照组无明显差别（P＞0.05）:而2 h后p-ERK1/2表达的水平甚至低于刺激前的水平（P＜0.05）。6.与对照组比较,灰度分析结果示各浓度组PD98059（25,50,75μmol/L）可明显抑制rhEGF促p-ERK1/2蛋白诱导表达（P＜0.01）。且PD98059抑制p-ERK1/2蛋白的表达有剂量依赖性,随着PD98059剂量的加大,抑制p-ERK1/2蛋白表达的作用增强。7.与对照组比较,受不同浓度rhEGF刺激1 h后Bcl-2蛋白表达灰度分析结果示1-60μg/L浓度组Bcl-2蛋白表达较对照组明显增高（P＜0.05）;rhEGF 1-60μg/L浓度组p53蛋白明显下降（P＜0.01）。其中rhEGF 1μg/L浓度组的作用最弱,10μg/L浓度组的最强,两组之间比较有显着差异（P＜0.01）。8.以rhEGF 10μg/L的刺激浓度观测0 min,30 min,1 h,2 h,4 h五个时间段的Bcl-2蛋白诱导表达结果示30 min-4 h时间段的表达呈峰型曲线,以1h时间段的表达最高（P＜0.01）,随后开始下降。与rhEGF 10μg/L的浓度刺激后p-ERK1/2蛋白的表达水平比较,各时间段Bcl-2与p-ERK1/2的峰型变化曲线基本一致。结论EGF促FL细胞增殖、激活Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路及对Bcl-2、p53蛋白的表达有明显的剂量和时间依赖性作用。EGF浓度10μg/L是最强的刺激浓度,FL细胞对此浓度EGF的刺激具有自适应控制作用。1μg/L浓度的EGF可能是既发挥生理效应又较为安全的用量。第二部分:羊颌下腺表皮生长因子提取、纯化及生物活性鉴定的研究目的从山羊颌下腺分离、纯化具有生物学活性的EGF。方法1.羊EGF的提取、纯化:首先进行EGF的粗分离,称取山羊颌下腺（新鲜或冷冻）,解冻后剪去结缔组织,用剪刀剪成小块,用搅拌机搅碎,然后放入匀浆器匀浆,按比例加入冰醋酸（HAC）,操作在4℃冰浴中进行。50 000×g,离心30 min,抽取上清液。进行DEAE Sphacel阴离子交换柱分离,收集洗脱液,UV-280nm检测图分析吸光度,选出的管数做ELISA实验。并以0.2 M醋酸铵和EGF标准品做为阴性、阳性对照,以检测EGF活性成分。不加硫酸（在652nm处的读数）及加酸后（在450nm处读数）的结果分析。读数高、和EGF标准品读数接近为有EGF活性组份的可能,将这些组份合并后进行透析脱去盐分（透析袋分子量为3 500）,透析过夜。将透析好的组份分别用甘油（丙三醇）或聚乙二醇（分子量20 000）进行浓缩以除去水分。透析浓缩后的组份再次进行ELISA实验。将含有EGF成分的浓缩液过分子筛色谱（Sephadex G50）柱层析,根据层析图所示,选取对应的收集管再次进行ELISA实验,步骤同前,结果吸光度值高的几管与层析图中的一个峰所对应,因此该峰就是含有EGF的活性峰。2.对提取、纯化的羊EGF进行生物活性检测2.1 MTT法测定不同浓度羊EGF对人胚胎羊膜细胞FL的促增殖作用。2.2流式细胞术检测羊EGF促细胞增殖时细胞周期变化。3.纯化的山羊颌下腺EGF行SDS-PAGE电泳观测其可见的分子量条带位置。结果1.48小时后贴璧生长的FL细胞逐渐以多边形居多,而加入EGF后细胞以长条纺锤形居多。2.MTT法促增殖实验:结果显示不同浓度羊颌下腺EGF组（稀释倍数:1:100、1:500、1:1000）、rhEGF（10μg/L）组对FL细胞的促增殖率分别为20.90%、39.43%、24.90%和40.60%。与对照组比较,羊颌下腺分离的EGF可明显促进FL细胞的生长（P＜0.01）,以稀释1:500倍的羊EGF作用效果最强,其促FL细胞增殖率与人重组EGF比较无明显差异（P＞0.05）。3.流式细胞术:根据细胞实验中确立的最佳羊EGF稀释浓度观测流式细胞术中羊EGF对细胞周期的影响,与对照组相比较,结果显示作用48 h后,G0/G1期细胞百分比由71.1±1.9减少至60.3±2.2（P＜0.01）,S期细胞百分比由18.8±1.4增高至25.8±1.1（P＜0.01）,纯化的山羊颌下腺EGF显着刺激细胞由G0/G1期进入S期,使分布在S期的细胞数增加。3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:电泳结果显示在分子量6 kD处,可见明显的条带。结论从山羊颌下腺分离得到的蛋白质经鉴定为EGF,该EGF能明显促进FL细胞生长、显着提高细胞的S期细胞分数,为具有生物学活性的EGF。羊颌下腺可能成为外源性EGF的药源。
周雯[8]（2004）在《羊颌下腺表皮生长因子的分离、纯化对胃肠黏膜炎性疾病的治疗作用及其机制探讨》文中进行了进一步梳理EGF为生长因子家族中的主要成员，主要由颌下腺腺管细胞分泌。研究表明EGF有促进体表创伤愈合的确切疗效，因此从一开始EGF主要被用于烧伤，体表溃疡等大面积创口的治疗，已有外用凝胶剂收入药典。以后的研究发现外源性的EGF能促进角膜上皮细胞的增生，相应的EGF滴眼液亦被开发出来。进一步深入研究发现EGF在体内消化道有最高的浓度，可能用其治疗胃肠道疾病。但EGF在基础研究方面仍存在着许多另人不解的问题如EGF／EGFR作用的信号传递过程。在临床作用的研究上也存在大量有待进行的工作如对萎缩性胃炎的促增殖作用研究有望用于治疗萎缩性胃炎。对肠黏膜的促增殖作用有望用于治疗炎症性肠病如溃疡性结肠炎等。开展对EGF的研究有着重大意义和巨大的经济价值。另一方面EGF的药用开发目前普遍存在着投资大、消费高和收率低等缺陷，使其不能完全产业化。生产EGF现有三种方法：化学合成法，其合成的产物的纯度及产率度都无法满足工业化生产要求；基因工程法，投资大，其制成的EGF价格昂贵；生物提取法，主要从小鼠颌下腺提取，但小鼠颌下腺产率低，来源有限。因此探索新的药源对开发生产EGF有着巨大的经济价值。本研究结合EGF基础和临床研究探索从羊颌下腺制备、纯化EGF，在溃疡性结肠炎及萎缩性胃炎大鼠动物模型上应用羊颌下腺分离的EGF进行治疗，同时研究EGF作用机制及探讨EGF调控基因表达的信号传导途径。 浙江大学博士学位论文 第一部分山羊领下腺EGF的分离、纯化及鉴定 表皮生长因子（Ep 1 dermal Growth Factor EGF）是由53个氨基酸组成的小分子多肤类生长因子，是一种强有力的细胞分裂促进因子。近年来国内外开展了许多表皮生长因子临床药用和保健作用的研究。目前EGF的药用研究己进入了二次研发阶段，主要集中研究其消化道效应。尽管EGF的临床用途广泛，但由于其价格昂贵而限制了其在临床的应用，而导致 EGF价格昂贵的主要原因就是现有EGF提取的工艺复杂，产量少，成本高，现有EGF的提取工艺主要有两种（l）由小鼠领下腺提取（国内）:产率0.06毫克/只，提取1克需要小鼠16667只，不但成本高，且可能造成潜在的环境污染。（2）基因工程制备（国外）:工艺流程复杂，投资巨大，所需环境指标苛刻，目前国内开展困难。 因此研究开发廉价、效高的药用EGF以适应临床需要有重要意义。1.目的从山羊领下腺分离、纯化具有生物学活性的EGF。2.方法2.1 EGF的粗分离称取家畜领下腺（新鲜或冻干粉）按比例加入HAC（4C）匀浆，离心两次后合并两次上清液，用3mol/L的NH10H调PH至6.5，加NaCL至0.4二，)1/L静置过夜，离心15000转/分钟，20分钟。用ZOInln。1/LtriS.HCL PH5.56缓冲液悬浮。供色谱分析。2.2分子筛色谱称取20克SephadexG15干粉，用PhamaCiaKX16装柱器装成300*16毫米色谱柱。色谱柱用10个床体积的PH5.56，20Inlnol/LtriS.HCL溶液平衡。将前述抽提悬浮液5毫升注入平衡好的SephadexG巧色谱柱，收集活性洗脱峰。浙江大学博士学位论文2.3 DEAE阴离子交换色谱分离量取180毫升DEAE Sephadaeel填料，用KX16/26装柱器（PhamaCia公司），一次性装入KX26/250空柱，接上Pslo泵，流量控制在sml/L。色谱条件:A液:20InM TriS.HCI PHS.56。B液:20InM TriS.HCL PHS.56含IM NaCIJ。检测波长:280nm。活性组分洗脱条件:15%B。将第一次洗脱的活性峰过柱，以EIJISA法检测活性，收集活性峰。2.4 ELISA法检测生物活性:将待测样品80闪于5倍浓度包被液20闪混合包被到EL工SA反应条中，37℃2小时，4℃过夜。次日用2%脱脂奶粉PBST(磷酸盐一Tween一20缓冲液37℃封闭30分钟。加入SIGMA的兔抗人的EGF抗体，IOOul/孔。（抗体原液作1:1000稀释）37oC，1.5小时。PBS洗涤3次，每次3分钟，加入酶标羊抗兔IgGIOO。1/孔37℃反应1小时。PBS洗涤3次，每次3分钟，加入邻苯二胺一双氧水底物缓冲液，100 ul/孔，37℃反应20分钟。每孔加入SOu12M硫酸终止反应，读取OD49Onm。2.5生物学活性的鉴定（1） MTT法测定EGF活性:取小鼠肾细胞作原代培养，其贴壁细胞用胰酶消化分散，用含10%小牛血清的1640培养基，于37℃，50k二氧化碳培养箱内培养48小时，收集细胞，用Hanks液洗涤，用新鲜培养基稀释至细胞数5X 10’个/ml。取96孔板，每孔加细胞液150/ul、待测样品IOOul，每样品作5个复孔。一组仅加HankS液10Oul作空白对照。37℃、5%二氧化碳条件下培养12小时后，每孔加MTT（smg/m1）15ul继续培养4小时，最后加异丙醇100。1终止反应，在酶标仪上57Onm波长下测吸光度A值，按下式计算生长促进率:生长促进率=（Ai一Ao）/（Ao）100%Ai为各测定孔的A值;Ao为空白对照的A值。（3）新生小鼠睁眼萌齿实验观察组小鼠每天皮下注射EGF170pg/1 00pl/只，对 浙江大学博士学位论文照组每天皮下注射同体积的生理盐水，每天观察睁眼及萌齿情况。3.实验结果3.1 EGF含量的测定:领下腺冻干粉143.摊，活性组份洗脱峰体积为SOml，根据2 8 onm及2 6 Onm测定的
韩笑宁,王笑海,何威[9]（2003）在《孕期四氯二苯对二恶英处理对子鼠颌下腺表皮生长因子和表皮生长因子受体的影响》文中认为目的 研究孕期四氯二苯对二英 （TCDD）处理对子鼠颌下腺表皮生长因子 （EGF）和表皮生长因子受体 （EGFR）的影响。 方法 孕 15d大鼠给予TCDD（5 μg kg）灌胃 1次 ,采用免疫组织化学方法 ,对不同发育阶段的子鼠颌下腺进行了观察。 结果 在PND32 ,PND4 9d ,TCDD组颌下腺EGF和EGFR的免疫反应阳性产物比对照组丰富 ,有显着性差异。 结论 孕期TCDD暴露促进了青春期和青春前期子鼠颌下腺EGF的生成和EGFR的表达。
虞玲华[10]（2003）在《纯化的羊表皮生长因子治疗炎症性肠病的实验研究》文中研究指明炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease，IBD），是一组病因不明的慢性肠道炎症性疾病，目前还没有针对性的特殊治疗。因此寻找新的疗效佳、副作用小的治疗IBD的药物显得尤为必要。有大量研究表明在IBD存在着免疫调节的缺陷，包括肠粘膜失去对肠腔的保护能力或是对肠粘膜损伤后的不适当的修复，其中有大量的炎症因子的介入，而表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）就参与了其中的修复过程，为此人们已用EGF实验性应用于IBD的治疗，并已取得了一定的疗效。EGF具有保护胃肠粘膜等作用，其机制主要为EGF有促有丝分裂，抑制及细胞保护，增加粘膜DNA，RNA和蛋白质的含量，刺激组织的生长和修复，EGF通过激活他的受体控制肠细胞的增生。其对消化道疾病的治疗作用已越来越受到人们的重视。EGF在基础理论和临床医学等方面都有重大研究意义和巨大的经济价值，但在生产上目前普遍存在着投资大、和收益率低等缺陷，使其不能完全产业化。本研究国内首次用来源较丰富的山羊颌下腺制备、纯化EGF，并在成功建立的稳定的IBD大鼠动物模型的基础上，应用山羊颌下腺EGF灌肠进行治疗研究，观察山羊颌下腺EGF对IBD大鼠肠粘膜病变的治疗作用并探讨可能的机制，为该产品的产业化及进一步临床治疗作基础研究。 材料与方法 1．山羊颌下腺冻干粉经HAC抽提、Sephadex G15凝胶层析、DEAE Sphacel层析柱，再经SDS-PAGE电泳分析分子量。ELISA法、MTT法及小鼠睁眼、萌齿试验进行羊EGF生物学活性测定。 2．健康、性成熟、一级质量标准的SD大鼠，雄性，体重250g～280g，由浙江大学医学院动物实验中心提供。采用乙酸造模法，大鼠禁食24小时后7％乙酸2ml用自制聚乙烯灌肠器（直径约2mm）灌肠，深度为距肛缘8cm，倒提大鼠准确定时15秒后，用灌肠器以同一深度生理盐水5ml冲洗一次，24小时后成模。 浙江大学硕士学位论文 3．随机分为 3组，即单纯造模组、生理盐水治疗对照组及 EGF治疗组，每组 10只。 单独造模组，造模后不灌肠饲养7天。生理盐水治疗对照组在造模成型后每日晨起 空腹给与生理盐水Zml每日灌肠，疗程7无。EGF治疗组，在造模成型后每日晨起 空腹用纯化鉴定后的羊EGF270pg／次／只，化入生理盐水至Zml灌肠，疗程7天。 4．所有实验动物在疗程7天后处死，破腹暴露全肠，在距肛scm处离断，沿肠系膜剪 开并用生理盐水冲洗干狰后，将肠粘膜平铺于泡沫板上，取出肠段肉眼观察肠粘膜 的病理改变，记算粘膜损伤指数，并数码相机摄片，然后立即用 10％的中性甲醛溶 液固定，送浙大医学院病理室，石蜡包埋，每份蜡块制成厚度 5 u m的切片 HE染 色，镜下评价粘膜损伤指数。 5．另取大鼠肠组织300mg测髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）值。肠组织称 重后按50mg（组织）八刀ml比例加入HTAB溶液，匀浆30s，然后冷冻离心15min， 取上清液 0．lml加 O－dianisidine溶液（含 0．0005％H2O2）2．gml，进行比色测定。MPO 活性单位山)定义为 25 ’C时每分钟分解… mol过氧化物的量。 6．观察大鼠在饲养过程中的精神状态，活动情况及肠标本大体观和镜下观。 7．统计学处理：上述数据均用x土S表示，采用完全随机设计成组资料的方差分析法 （One－Way ANOVA）。 结果 1．山羊颌下腺制成 EGF的得率为口刀67mg／g腺体。 2．经ELISA法、MTT法、小鼠萌齿和睁眼试验、SDS－PAGE电泳图鉴定其为EGF。 3．EGF治疗组大鼠一般情况较模型组和生理盐水组有明显好转。一肋肋上 4．模型组大鼠有严重的充血水肿、溃疡多而大、糜烂出血点；EGF治疗组大鼠结肠粘 膜大体改变有个别小溃疡、充血水肿、糜烂，经统计学处理较模型组有明显好转 （P＜0刀1）；较生理盐水治疗组有好转（p＜0．05）。 5．EGF治疗组镜下病理改变可见溃疡修复，如溃疡边缘上皮修复、肉芽组织形成等， 经统计学处理较模型组有明显好转（P＜o．01）；较生理盐水组有好转（P＜0刀5）。 6．EGF 治疗组较模型组及生理盐水组对MPO值的增高均有明显的抑制作用 （P＜0刀1）。 2 浙江大学硕士学位论文 结论1．山羊颌下腺可分离、提纯丰富的EGF。2．羊EGF对乙酸性IBD动物模型有很好的治疗作用。3．对山羊颌下腺EGF采?
二、小鼠颌下腺表皮生长因子的制备及纯化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠颌下腺表皮生长因子的制备及纯化（论文提纲范文）
（1）SCAP外泌体通过hsa-piR-15254抑制Th17分化治疗舍格伦综合征的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 SCAP外泌体抑制Th17分化治疗舍格伦综合征的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人SCAP原代细胞分离培养与鉴定 |
| 2.2.2 SCAP-Exo的分离提取与鉴定 |
| 2.2.3 SS动物模型的建立 |
| 2.2.4 SCAP-Exo对 SS小鼠唾液流率的影响 |
| 2.2.5 外周血、脾脏及颌下腺的采集 |
| 2.2.6 SCAP-Exo对 SS小鼠外周血血清中IL-17A表达水平的影响 |
| 2.2.7 SCAP-Exo对 SS小鼠外周血中Th17 比例的影响 |
| 2.2.8 SCAP-Exo对 SS小鼠脾脏中Th17 比例的影响 |
| 2.2.9 SCAP-Exo对 SS小鼠颌下腺的组织学改变 |
| 2.2.10 SCAP-Exo对 SS小鼠颌下腺中Th17 细胞浸润的影响 |
| 2.2.11 人外周血CD4~+T细胞的分离培养与鉴定 |
| 2.2.12 构建人CD4~+T细胞向Th17 分化的诱导体系 |
| 2.2.13 SCAP-Exo对 Th17 细胞相关蛋白、基因表达水平的影响 |
| 2.2.14 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 人SCAP原代培养与鉴定 |
| 3.2 SCAP-Exo的鉴定 |
| 3.3 SS小鼠模型建立 |
| 3.4 SCAP-Exo改善SS小鼠唾液分泌量 |
| 3.5 SCAP-Exo降低SS小鼠外周血Th17/CD4~+T比例及IL-17A表达 |
| 3.6 SCAP-Exo降低SS小鼠脾脏中Th |
| 3.7 SCAP-Exo降低SS小鼠颌下腺淋巴细胞浸润水平 |
| 3.8 SCAP-Exo降低SS小鼠颌下腺Th17 细胞浸润水平 |
| 3.9 人外周血CD4~+T细胞的分选纯化 |
| 3.10 CD4~+T细胞向Th17 分化诱导体系的构建 |
| 3.11 SCAP-Exo抑制CD4~+T细胞向Th17 分化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 SCAP外泌体中piRNA的高通量测序及生物信息学分析和验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原代细胞的培养与鉴定 |
| 2.2.2 SCAP-Exo和 BMMSC-Exo的提取与鉴定 |
| 2.2.3 SCAP-Exo和 BMMSC-Exo的高通量测序 |
| 2.2.4 目标piRNA的筛选与验证 |
| 2.2.5 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 BMMSCs的鉴定 |
| 3.2 BMMSC-Exo的鉴定 |
| 3.3 SCAP-Exo和 BMMSC-Exo小 RNA文库数据质检 |
| 3.4 小RNA分类注释结果 |
| 3.5 SCAP-Exo中 piRNA表达谱分析 |
| 3.6 生物信息学分析 |
| 3.7 目标piRNA的筛选与验证 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 SCAP外泌体传递hsa-piR-15254 抑制Th17 分化的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人SCAP原代细胞分离培养与鉴定 |
| 2.2.2 SCAP-Exo的分离提取与鉴定 |
| 2.2.3 人外周血CD4~+T细胞的分离培养与鉴定 |
| 2.2.4 免疫荧光染色观察SCAP-Exo进入CD4~+T细胞 |
| 2.2.5 SCAP-Exo对 CD4~+T细胞hsa-piR-15254 表达水平的影响 |
| 2.2.6 双荧光素酶报告基因验证hsa-piR-15254 的靶基因为IL-6R |
| 2.2.7 检测CD4~+T细胞转染hsa-piR-15254 mimics/inhibitor有效率 |
| 2.2.8 qRT-PCR验证hsa-piR-15254对IL-6R表达的调控作用 |
| 2.2.9 hsa-piR-15254对CD4~+T细胞向Th17 分化的调控作用 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 SCAP-Exo能够被CD4~+T细胞胞吞并上调hsa-piR-15254 表达 |
| 3.2 双荧光素酶报告基因验证hsa-piR-15254 的靶基因为IL-6R |
| 3.3 CD4~+T细胞转染hsa-piR-15254 mimics和 inhibitor效率 |
| 3.4 hsa-piR-15254 抑制CD4~+T细胞IL-6R表达 |
| 3.5 hsa-piR-15254 抑制CD4~+T细胞向Th17 分化及IL-17A分泌 |
| 3.6 hsa-piR-15254 抑制Th17 相关基因表达水平 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 对本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞外泌体通过调节免疫促进组织再生的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）小鼠和人Leg1的结构和功能探究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 唾液腺的结构与功能研究 |
| 1.1.1 唾液腺的结构 |
| 1.1.2 唾液腺的发育 |
| 1.1.3 唾液腺作为靶器官表达目的蛋白及其在畜牧业中的潜在应用 |
| 1.2 唾液的组成与功能 |
| 1.2.1 唾液的功能 |
| 1.2.2 唾液组学研究 |
| 1.2.3 唾液的临床诊断应用 |
| 1.3 肝脏与代谢 |
| 1.3.1 肝脏的结构 |
| 1.3.2 肝脏与脂肪合成代谢 |
| 1.4 Akt信号通路 |
| 1.5 Leg1的研究进展 |
| 1.5.1 Leg1在斑马鱼中的发现和研究 |
| 1.5.2 在小鼠中Leg1同源物的研究 |
| 1.5.3 在其他物种中Leg1的研究 |
| 1.6 单颗粒冷冻电镜技术 |
| 1.6.1 冷冻样品制备 |
| 1.6.2 透射电子显微镜及图像收集 |
| 1.6.3 图像数据处理和三维结构重构 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 小鼠 |
| 2.1.1 小鼠品系及饲养 |
| 2.1.2 小鼠唾液收集 |
| 2.2 细胞系实验 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.3 大肠杆菌实验 |
| 2.3.1 大肠杆菌菌株 |
| 2.3.2 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.3.3 菌液冻存 |
| 2.3.4 菌落PCR |
| 2.4 DNA相关实验方法 |
| 2.4.1 基因克隆实验 |
| 2.4.1.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.4.1.2 点突变或短片段插入与删除 |
| 2.4.1.3 PCR及DNA酶切产物的纯化 |
| 2.4.2 酶切与连接 |
| 2.4.3 同源重组 |
| 2.4.4 大肠杆菌质粒抽提 |
| 2.4.5 小鼠基因型鉴定 |
| 2.5 RNA相关实验方法 |
| 2.5.1 总RNA提取 |
| 2.5.2 RNA逆转录 |
| 2.5.3 荧光定量PCR |
| 2.6 蛋白质相关实验方法 |
| 2.6.1 细胞组分和唾液蛋白提取 |
| 2.6.1.1 细胞总蛋白的提取 |
| 2.6.1.2 唾液蛋白的提取 |
| 2.6.2 蛋白的检测:免疫印迹(Western Blot)和斑点杂交(Dot Blot) |
| 2.6.2.1 SDS-PAGE蛋白胶的配制 |
| 2.6.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳和转膜 |
| 2.6.2.3 抗体孵育及曝光 |
| 2.6.3 蛋白Dot Blot操作过程及检测 |
| 2.6.4 蛋白质的浓缩 |
| 2.6.5 抗体的制备与检测 |
| 2.6.5.1 抗原蛋白的原核表达 |
| 2.6.5.2 多抗血清的筛选与检测 |
| 2.6.5.3 单抗的筛选与检测 |
| 2.6.6 糖苷酶处理 |
| 2.7 昆虫细胞表达系统及蛋白纯化 |
| 2.7.1 载体的构建 |
| 2.7.2 杆状病毒的制备 |
| 2.7.2.1 蓝白斑筛选与Bacmid的提取 |
| 2.7.2.2 病毒的获取和扩增 |
| 2.7.3 SF9昆虫细胞蛋白的纯化 |
| 2.8 柱层析分离小鼠唾液腺蛋白 |
| 2.9 化学试剂及培养基配方 |
| 2.10 本课题相关引物序列 |
| 第三章 MLEG1存在N糖基化和O糖基化修饰 |
| 3.1 MLEG1存在糖基化修饰 |
| 3.2 MLEG1第171,196,257位的天冬酰胺为N-糖基化修饰位点 |
| 3.3 糖基化的缺失影响MLEG1功能 |
| 3.4 MLEG1第119,123位的丝氨酸为O-糖基化修饰位点 |
| 3.5 MLEG1的119位的丝氨酸影响第117位的N-糖基化修饰 |
| 3.6 小结与讨论 |
| 第四章 MLEG1蛋白结构分析 |
| 4.1 MLEG1的表达和纯化 |
| 4.2 MLEG1蛋白样品负染检查 |
| 4.3 MLEG1的冷冻电镜样品检查 |
| 4.4 Titan Krios 300kV电子显微镜数据处理 |
| 4.5 冷冻样品条件优化 |
| 4.6 小结与讨论 |
| 第五章 HLEG1在人唾液表达且有糖基化修饰 |
| 5.1 HLEG1 RNA表达数据库分析 |
| 5.2 HLEG1蛋白数据库分析 |
| 5.3 HLEG1结构分析 |
| 5.4 HLEG1蛋白抗体的制备 |
| 5.5 HLEG1蛋白抗体的检测 |
| 5.6 HLEG1存在N糖基化修饰 |
| 5.7 HLEG1第24位和69位的天冬酰胺为N-糖基化修饰位点 |
| 5.8 小结与讨论 |
| 第六章 HLEG1可上调HepG2细胞中Akt磷酸化 |
| 6.1 293T细胞表达的HLEG1能诱导Akt的磷酸化 |
| 6.2 293T细胞表达的HLEG1能够诱导EGFR的磷酸化 |
| 6.3 HLEG1与人BMI的关系 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第七章 在leg1a突变体中进行基因补偿效应研究 |
| 第八章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（3）低氧预处理人羊膜间充质干细胞对放射性损伤鼠涎腺上皮细胞修复作用的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（4）鸡胚表皮生长因子（gEGF）粗提物对肉仔鸡的作用效果研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 抗生素 |
| 1.2 EGF概述 |
| 1.3 EGF的生物学功能 |
| 1.4 EGF的作用机制 |
| 1.5 EGF在动物营养中的研究进展 |
| 1.6 EGF的制备 |
| 1.7 本研究目的和意义 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.4 数据处理 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 不同孵化日龄鸡胚gEGF的含量 |
| 3.2 鸡胚gEGF粗提物对肉仔鸡生产性能的影响 |
| 3.3 鸡胚gEGF粗提物对肉仔鸡血清生化指标的影响 |
| 3.4 鸡胚gEGF粗提物对肉仔鸡抗氧化能力的影响 |
| 3.5 鸡胚gEGF粗提物对肉仔鸡免疫性能的影响 |
| 3.6 鸡胚gEGF粗提物对肉仔鸡小肠绒毛形态的影响 |
| 3.7 鸡胚gEGF粗提物对肉仔鸡消化酶活性的影响 |
| 3.8 鸡胚gEGF粗提物对肉仔鸡器官指数的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 不同孵化日龄鸡胚gEGF含量 |
| 4.2 鸡胚gEGF粗提物对肉仔鸡生产性能的影响 |
| 4.3 鸡胚gEGF粗提物对肉仔鸡血清生化指标的影响 |
| 4.4 鸡胚gEGF粗提物对肉仔鸡抗氧化能力的影响 |
| 4.5 鸡胚gEGF粗提物对肉仔鸡免疫性能的影响 |
| 4.6 鸡胚gEGF粗提物对肉仔鸡肠道结构功能的影响 |
| 4.7 鸡胚gEGF粗提物对肉仔鸡消化酶活性的影响 |
| 5 论文结论与创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）利用转基因猪唾液腺生物反应器制备人神经生长因子（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩略词 |
| 1 前言 |
| 1.1 神经生长因子简介 |
| 1.1.1 神经生长因子的分子结构特征 |
| 1.1.2 神经生长因子的生理作用 |
| 1.1.3 神经生长因子的治疗作用 |
| 1.2 鼠神经生长因子药物的开发及市场销售情况 |
| 1.2.1 神经生长因子的药物开发 |
| 1.2.2 神经生长因子的市场销售情况 |
| 1.3 人神经生长因子药物的开发前景 |
| 1.3.1 人神经生长因子较鼠神经生长因子的优势 |
| 1.3.2 人神经生长因子的制备 |
| 1.4 利用转基因动物唾液腺作生物反应器制备人神经生长因子的可行性 |
| 1.4.1 唾液腺生物反应器较乳腺生物反应器的优势 |
| 1.4.2 猪唾液腺较小鼠唾液腺生物反应器制备人神经生长因子的优势 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 技术路线 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 试验动物 |
| 2.2.2 菌种、质粒和细胞株 |
| 2.2.3 主要试剂及耗材 |
| 2.2.4 主要培养基和试剂的配制 |
| 2.2.5 主要仪器设备 |
| 2.2.6 结果统计与分析软件 |
| 2.3 转hNGF基因细胞克隆团筛选 |
| 2.4 体细胞克隆法制备转hNGF基因猪 |
| 2.4.1 核供体细胞准备 |
| 2.4.2 克隆胚胎制备及胚胎移植 |
| 2.5 原代转hNGF基因猪的检测与分析 |
| 2.5.1 观察绿色荧光表达情况 |
| 2.5.2 PCR和 Southern Blot检测hNGF基因在原代转基因猪基因组中的整合情况 |
| 2.5.3 反向PCR验证hNGF基因在原代转基因猪基因组中的整合位点 |
| 2.5.4 ELISA法检测转hNGF基因猪唾液中hNGF和 pNGF蛋白浓度 |
| 2.5.5 PC12 细胞培养法检测转hNGF基因猪唾液中hNGF蛋白活性 |
| 2.6 分离培养原代转hNGF基因猪成纤维细胞 |
| 2.7 靶向pNGF基因的sg RNA设计及相应CRISPR/Cas9 系统表达载体构建 |
| 2.7.1 靶向pNGF基因的sg RNA设计 |
| 2.7.2 靶向pNGF基因CRISPR/Cas9 系统表达载体构建 |
| 2.8 靶向pNGF基因的CRISPR/Cas9 系统表达载体筛选 |
| 2.9 pNGF基因敲除的转hNGF基因细胞团筛选 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转hNGF基因的猪体细胞克隆团筛选 |
| 3.2 体细胞克隆法制备原代转hNGF基因猪 |
| 3.3 原代转hNGF基因猪的检测与分析 |
| 3.3.1 原代转基因猪绿色荧光表达情况 |
| 3.3.2 hNGF基因在原代转基因猪基因组中的整合情况 |
| 3.3.3 hNGF基因在5号原代转基因猪基因组中的整合位点 |
| 3.3.4 原代转基因猪唾液中的hNGF和 pNGF蛋白浓度 |
| 3.3.5 原代转hNGF基因猪唾液中分泌的hNGF蛋白的活性鉴定 |
| 3.4 原代转hNGF基因猪成纤维细胞的分离培养 |
| 3.5 靶向pNGF基因的CRISPR/Cas9 系统表达载体的构建 |
| 3.6 靶向pNGF基因的CRISPR/Cas9 系统表达载体的筛选 |
| 3.7 pNGF基因敲除的转hNGF基因细胞克隆团的筛选 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 单克隆细胞筛选中的问题 |
| 4.2 体细胞克隆法制备hNGF基因猪的效率 |
| 4.3 转hNGF基因猪的鉴定、检测分析 |
| 4.4 pNGF基因敲除的单细胞克隆团筛选 |
| 4.5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（6）IL-21在舍格伦综合征发病过程中的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 在NOD小鼠体内阻断IL-21信号对舍格伦综合征发病的影响 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 在NOD小鼠颌下腺局部抑制IL-21表达对舍格伦综合征的影响机制 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 附英文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）外源性EGF促细胞增殖作用的信号转导机制和安全性研究及EGF药源开发（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景 |
| 第一部分：外源性EGF促细胞增殖作用的信号转导机制及其安全性研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 羊颌下腺表皮生长因子的提取、纯化及活性鉴定 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
（8）羊颌下腺表皮生长因子的分离、纯化对胃肠黏膜炎性疾病的治疗作用及其机制探讨（论文提纲范文）
| 一. 前言 |
| 二. 中文摘要 |
| 三. 英文摘要 |
| 四. 第一部分 山羊颌下腺表皮生长因子的分离，纯化及鉴定 |
| 五. 第二部分 山羊颌下腺分离的表皮生长因子对大鼠萎缩性胃炎的治疗作用 |
| 六. 第三部分 山羊颌下腺分离的表皮生长因子治疗溃疡性结肠炎的实验研究 |
| 七. 第四部分 表皮生长因子上调AGS细胞胃泌素基因表达及信号传导途径 |
| 八. 综述 |
（9）孕期四氯二苯对二恶英处理对子鼠颌下腺表皮生长因子和表皮生长因子受体的影响（论文提纲范文）
| 材料和方法 |
| 1. 标本制备 |
| 2. 免疫组织化学 |
| 3. 免疫反应产物的定量分析 |
| 结果和讨论 |
| 1. 大鼠颌下腺内EGF和EGFR的分布 |
| 2. TCDD对EGF及EGFR的影响 |
| 3. 免疫组织化学的图像分析 |
（10）纯化的羊表皮生长因子治疗炎症性肠病的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述1 |
| 综述2 |
| 致谢 |
四、小鼠颌下腺表皮生长因子的制备及纯化（论文参考文献）
- [1]SCAP外泌体通过hsa-piR-15254抑制Th17分化治疗舍格伦综合征的实验研究[D]. 王傲晨. 中国医科大学, 2021(02)
- [2]小鼠和人Leg1的结构和功能探究[D]. 王金阳. 浙江大学, 2020(01)
- [3]低氧预处理人羊膜间充质干细胞对放射性损伤鼠涎腺上皮细胞修复作用的研究[D]. 孔维平. 遵义医科大学, 2020
- [4]鸡胚表皮生长因子（gEGF）粗提物对肉仔鸡的作用效果研究[D]. 姚静宜. 浙江大学, 2020(01)
- [5]利用转基因猪唾液腺生物反应器制备人神经生长因子[D]. 廖莎. 华南农业大学, 2019(02)
- [6]IL-21在舍格伦综合征发病过程中的作用机制[D]. 刘浩. 山东大学, 2012(05)
- [7]外源性EGF促细胞增殖作用的信号转导机制和安全性研究及EGF药源开发[D]. 袁庆丰. 浙江大学, 2007(09)
- [8]羊颌下腺表皮生长因子的分离、纯化对胃肠黏膜炎性疾病的治疗作用及其机制探讨[D]. 周雯. 浙江大学, 2004(03)
- [9]孕期四氯二苯对二恶英处理对子鼠颌下腺表皮生长因子和表皮生长因子受体的影响[J]. 韩笑宁,王笑海,何威. 解剖学报, 2003(02)
- [10]纯化的羊表皮生长因子治疗炎症性肠病的实验研究[D]. 虞玲华. 浙江大学, 2003(03)