一、基于smad7基因为靶序列的RNA干涉作用研究（论文文献综述）
李昊[1]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中提出肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
彭文舫[2]（2015）在《Sulfolobus islandicus CRISPR-Cas病毒防御功能的遗传学分析》文中研究指明许多细菌和大多数的古菌基因组均编码称作CRISPR-Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat-CRISPR-associated）的获得性免疫系统来抵御病毒或质粒的侵害。CRISPR-Cas系统被分为3个主要类型,I型,II型和III型,又被进一步划分为11个亚型。Sulfolobus islandicus Rey15A编码一个I-A亚型（Cascade）和两个III-B亚型（Cmr-α和Cmr-β）CRISPR-Cas干涉系统,本研究项目开始以前,这些系统中的cas基因的功能未被解析,而且,当时已研究过的Cmr系统被证实在体外切割RNA,但它们的体内RNA切割活性并未被证实。本研究的以S.islandicus Rey15A为研究材料,解析了I-A亚型系统中每个Cas蛋白在CRISPR介导的DNA干涉中的功能,另外,明确地证实了Cmr系统的体内RNA干涉活性。为了分析S.islandicus Rey5A I-A亚型系统中单个cas基因在入侵物免疫过程中的功能,我们构建了S.islandicus Rey5A I-A亚型系统中单个cas基因以及除I-A亚型系统外的其它几个cas基因座的缺失株。对每个缺失株在pre-cr RNA加工及质粒干涉方面的表型进行分析后,结果说明,Cas7,Cas5,Cas6和Cas3为I-A亚型系统介导的DNA干涉所必需的蛋白成分,然而,Csa5及其它几个CRISPR-Cas系统均不参与此过程。Cas6被证实为此菌株中唯一一个负责pre-cr RNA加工的酶,同时Cas7,Cas5和Cas3也介入此过程。Cas7和Cas5分别稳定pre-cr RNA加工中间产物和成熟cr RNA;缺少Cas3后加工中间产物大量积累,但其中涉及的原理目前未知。S.islandicus Rey15A Cmr系统介导的的体内RNA干涉活性的确定是通过构建一个RNA干涉试验来实现的。RNA干涉试验的原理是在质粒上表达一个人工CRISPR（artificial CRISPR;所得到质粒称为p AC质粒）,该人工CRISPR含有一个来源于β-糖苷酶编码基因lac S的spacer,因此,从p AC上表达出来的cr RNA能够介导内源CRISPR-Cmr系统对lac S信使RNA进行干涉,而干涉效果可以通过检测p AC转化子细胞提取物中残留的β-糖苷酶活性来进行评估。在不同的Cmr基因座缺失株中检测RNA干涉活性结果显示,只有两个Cmr基因座均缺失的突变株失去了RNA干涉能力,说明每个Cmr系统均参与了体内RNA干涉。在spacer的不同位点引入突变并用来构建p AC质粒,通过检测这些突变对RNA干涉活性的影响,一个位于cr RNA 3’端的3 nt长的序列被确定为对RNA干涉活性至关重要。对p AC转化子中未被切割的lac S信使RNA的量用实时定量PCR进行评估的结果进一步证实了Cmr介导的体内RNA切割活性。3’-RACE结果显示,lac S信使RNA中的剪切位点被定位在S1 protospacer序列内,结果还表明,Cmr-α利用尺标原理在测定的（间隔6 nt）位点对RNA进行切割,而Cmr-β则利用序列特异性原理在类似UA（UA,UG或UU）位点切割protospacer RNA。
廖芳芳[3]（2012）在《AAN中Smad7泛素化及调节TGF-β1信号通路相关因子表达的研究》文中提出目的：筛选泛素连接酶Arkadia和泛素羧基末端水解酶-5（也叫UCH37）的高效小干扰RNA（small interference RNA, siRNA）,并构建其表达载体,探讨马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephropathy,AAN）中Smad7蛋白对TGF-β1/Smads信号通路中关键因子Smad2、Smad3和TβRI表达的影响。方法：将一系列不同浓度比例的LipofectaminTM2000与对照组siRNA的混合物转染入小鼠肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cells, RTECs）中,通过观察绿色荧光的表达量及Real-Time PCR反应优化转染条件。分别转染Arkadia和UCH37siRNA, Real-Time PCR检测其mRNA表达抑制率。分别构建Arkadia和UCH37的表达载体pGPU6/GFP/Neo,并进行酶切及测序鉴定；利用Arkadia表达载体,采用Real-Time PCR和CCK-8法筛选出质粒DNA与LipofectaminTM2000的最佳转染比例和时间；然后将两表达载体转染入AAN模型的RTECs中,Real-Time PCR和Western blot检测Smad2、Smad3、TβRI和Smad7等的表达变化。结果：荧光表达和Real-Time PCR结果显示,30pmol siRNA:1.5μL LipofectamineTM2000为最佳转染条件。Real-Time PCR结果表明,Arkadia-1490, UCH37-721的干扰效果最明显。酶切及测序结果证实,载体的插入序列完全止确。从Real-Time PCR和CCK-8结果可看出表达载体的转染效率呈一定的剂量和时间依赖性,当质粒DNA:LipofectamineTM2000比例为0.66μg：2μL、转染时间为24h时,对Arkadia mRNA表达的抑制最明显并且对细胞的毒性最小。Real-Time PCR和Western blot结果提示,转染入pGPU6/GFP/Neo-Arkadia载体后,与AAI组相比,vimentin、 α-SMA、Smad2、Smad3和TβRI的表达下降,而CK18和Smad7表达上升：当转染入pGPU6/GFP/Neo-UCH37载体后,结果与之相反。结论：Arkadia-1490和UCH37-721分别为Arkadia和UCH37基因的最佳干扰片段,并成功构建了表达载体pGPU6/GFP/Neo-Arkadia和pGPU6/GFP/Neo-UCH37;在AAN中Smad7可降低Smad2和Smad3的表达同时增加TβRI的降解。
郭洪亮[4]（2011）在《siRNA-smad3对缺血性脑损伤ActA/smads信号转导通路的影响》文中指出信号转导通路变化规律及其内在机制在疾病发生、发展过程中的研究已成为目前研究热点。随着对缺血性脑损伤研究的不断深入,发现细胞信号转导通路在其病理及病理生理过程中起着重要作用。激活素A,作为一种信号蛋白以及信号转导通路中细胞外的第一信使,具有广泛的生物学作用。在神经系统中,激活素A被认为是一种神经保护因子而存在,在缺血性脑损伤中,激活素A的神经保护作用以及其下游smad3介导的ActA/Smads转导通路变化规律及其机制尚不明确。本实验通过体外试验,以激活素A及ActA/Smads转导通路中关键位点为研究靶点进行干预,以期对上述问题进行更深入探讨。为明确ActA对神经元缺血缺氧损伤的作用及其对ActA/Smads转导通路的影响,本实验选取大鼠PC12细胞系,应用鼠神经生长因子（NGF）刺激使之分化为神经元样细胞,行形态学及细胞化学鉴定,并进一步在体外建立PC 12细胞氧糖剥夺（OGD）模型。在此基础上,观察外源性激活素A对PC12细胞OGD损伤的影响,检测ActA/smads通路上ActRⅡA、smad3和smad4等关键位点及下游凋亡调控基因caspase3的表达变化,结果显示：外源性激活素A预刺激后,对OGD损伤的PC12细胞较OGD6h组凋亡率明显降低,ActA/smads通路中的ActRⅡA、smad3和smad4 mRNA表达明显升高,而caspase3的mRNA的表达较OGD组显着降低。证实外源性ActA干预可激活ActA/smads信号转导通路,使凋亡调控基因caspase3表达下调,其对神经缺血缺氧损伤有保护作用。为进一步研究ActA/smads信号转导通路对神经元缺血缺氧损伤的保护作用及其机制,本实验选取smad3为干预靶点,应用RNAi技术,在成功构建dsRNA-smad3重组质粒的基础上,在smad3水平阻断ActA/smads信号通路的转导,检测ActA/smads通路上ActRⅡA、smad3和smad4的关键位点以及凋亡的关键调控基因caspase3mRNA及蛋白的表达情况；应用MTT、Hoechst33324染色法、AO/EB双染法观察阻断通路后细胞活力、凋亡的变化。结果显示,smad3水平阻断ActA/smads信号通路后,ActRⅡA、smad3和smad4的关键位点的mRNA及蛋白表达均明显下调,caspase3的蛋白表达较未阻断信号组比较明显升高；阻断ActA/smads信号通路后与未行信号阻断比较,细胞活力明显降低,凋亡率明显升高。以上结果表明,ActA可能通过激活ActA/smads信号转导通路对神经元缺血缺氧损伤起保护作用smad3可能为调控ActA/smads信号转导通路的关键蛋白,其表达直接影响该通路的信号转导；该通路激活后可能通过下调caspase3发挥抗凋亡作用。
代蓉[5]（2011）在《组织特异沉默BMP4基因转基因小鼠模型的构建及表达分析》文中认为角蛋白是一个多基因家族,不同的角蛋白表达呈现表达的组织和时空特异性。因此,利用不同的角蛋白启动子可以实现外源基因在特定组织和特定发育时期的表达。为了探讨某一基因在皮肤和毛囊生长发育及在疾病发生中的作用机制,常选择角蛋白启动子实现外源基因在皮肤和毛囊组织里特异表达。为制备在皮肤和毛囊组织里特异表达外源基因的转基因动物,首先需要选择组织特异表达的启动子。为此,本实验从人血中提取基因组,克隆得到在皮肤和毛囊组织中特异表达的人K14和K5启动子。瞬时转染体外培养不同类型的细胞,利用萤光素酶检测系统,分析这两个启动子的启动活性及组织特异性。结果表明,两个启动子在选择的细胞系中都有表达,但以小鼠皮肤来源的细胞系里的活性最强。其中K14启动子在小鼠皮肤细胞系中活性远高于其它细胞系（P<0.01）,K5启动子的活性也比较高（P<0.05）。为充分利用角蛋白启动子,明确其表达特点,使之更好地应用于外源基因的定位表达提供一定的参考依据。RNAi （RNA interference, RNAi）是继基因打靶技术后的一种高效的研究基因功能的方法。细胞学实验和小鼠模型的研究结果表明,PolⅡ型启动子可以实现组织特异的RNA干扰,从而为鉴定基因在特定组织中的功能及作用机理提供了一个强有力的研究方法。为了能将这种方法用于转基因绵羊生产,探讨基因与绵羊毛囊发育的关系及其作用机制等,本研究利用PolⅡ型CMV启动子和毛囊组织特异表达的人角蛋白14（K14）的启动子驱动EGFP-shRNA融合转录本的生成,从而实现敲低目的基因的表达。体外基因表达沉默效率分析（pEGFP-Cl-shRNA和psiCHECK-BMP4双质粒共转染Hela细胞）结果表明,6个干扰序列均能有效地抑制BMP4基因的表达,抑制效率达到60%以上；体内表达沉默分析（只转染pEGFP-K14-shRNA质粒转染小鼠皮肤细胞系JB6-C41）的实验结果与体外分析结果相似,除3#序列外,其余干扰序列对BMP4基因的抑制效率都在60%以上,其中5#序列的效率达到80%以上。siRNA诱导的目标基因沉默中mRNA和蛋白水平的下降显着正相关。结果表明,设计构建的由PolⅡ型启动子K14驱动EGFP-shRNA融合转录本的形成,从而实现RNAi的研究方法是可行的,利用这种方法可以实现在特定细胞中敲低目的基因的表达水平。为在大家畜特别是绵羊中应用RNAi的方法分析目的基因在毛囊发育、对不同类型毛囊生长发育的诱导和调节等作用机理的研究提供一个参考方法。RNAi是一种行之有效的基因沉默的新方法,越来越广泛地应用于基因功能的研究、疾病的治疗以及新型疫苗的研制等领域。本研究通过原核显微注射干扰载体的方法制备转基因小鼠。选用皮肤组织特异表达的人源角蛋白14（K14）基因启动子（2000bp）作为表达载体启动子,成功地驱动融合表达载体EGFP-shRNA进行干扰片段前体的转录,进而生成成熟的干扰片段,靶向小鼠BMP4基因使其发生沉默。所得到的转基因小鼠及其杂交后代经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明外源基因准确无误地整合到小鼠基因组。Northern杂交结果证明小干扰RNA在皮肤组织中有较高水平的表达,在肺和肠组织中有较低水平的表达。研究结果表明：利用PolⅡ型（K14）启动子驱动shRNA融合转录本的表达,在特定组织高表达siRNA,从而达到抑制特定组织目的基因表达的技术路线是可行的。在取E18.5的转基因小鼠皮肤组织做组织切片并用BMP4抗体杂交后发现,阳性小鼠表达BMP4小干扰RNA的皮肤局部出现毛囊增多的现象,初步确定该基因受到抑制后,毛囊在胚胎期的发生被激活,从而产生更多的毛囊。我们的研究结果表明,利用polⅡ型启动子K14融合表达mRNA的方法实现体内小干扰RNA的表达是可行的,为利用K14启动子进行毛囊相关基因干扰研究积累了基础数据,也为制备组织特异抑制基因表达的转基因大家畜提供了一个参考方法。
王伟[6]（2010）在《BMP/Smad信号通路对猪卵泡颗粒细胞的影响》文中进行了进一步梳理繁殖力是影响养猪业生产的最重要因素之一,是决定养猪业效益高低的主要限制因素。繁殖力的高低取决于母体卵巢卵泡的生长发育,因为卵泡发育决定了排卵数,是影响繁殖力的关键因素。掌握母猪卵泡发育规律及其影响因素有利于进一步提高母猪繁殖能力,提高猪生产的经济效益。哺乳动物卵泡发育是十分复杂的过程,主要包括：原始卵泡的募集、腔前卵泡的发育、有腔卵泡的选择和生长及卵泡的成熟或闭锁。随着后基因组信息学的发展,人们发现卵泡的生长发育是一个高度协调的、非独立生理生化过程,受多种相同或者不同的细胞内、外因子及信号通路的影响和控制。卵泡颗粒细胞是卵泡中最重要的体细胞,它对卵母细胞成熟、卵泡发育有至关重要的作用。伴随着哺乳动物卵泡生长和发育,颗粒细胞体积增大、数量增多及逐步分化和成熟。BMPs （bone morphogenetic proteins, BMPs）属于TGF-p超家族成员,近几年,研究人员对BMPs在繁殖上的作用进行了广泛的研究,包括卵泡的生长发育、颗粒细胞和膜细胞的增殖与凋亡、类固醇激素的合成、卵母细胞成熟、排卵和黄体化等。但BMP/Smad信号通路在猪卵泡颗粒细胞中具体作用及机制目前尚未见报道。因此,深入研究BMP/Smad信号通路在卵泡发育过程颗粒细胞中的作用及其调控机制,可以为哺乳动物繁殖性状的选育提供可能的理论基础,在提高家畜繁殖性能方面有重要意义。本研究以猪卵泡颗粒细胞（GCs）为实验材料,采用real time RT-PCR方法检测BMP/Smad信号通路中关键因子（受体和下游信号分子）在猪卵泡不同发育时期的颗粒细胞中的表达水平；利用免疫组织化学方法就BMP/Smad信号通路核心下游信号分子—Smad4,在猪卵巢中的细胞定位进行研究；用RNAi方法敲减Smad4,以阻抑BMP/Smad信号通路,利用MTT、流式细胞术、CLIA、real time RT-PCR等方法检测阻抑该信号通路对猪卵泡颗粒细胞的作用及其分子机制；在阻抑通路的基础上,额外添加FSH,利用MTT、流式细胞术、CLIA、real time RT-PCR等方法检测阻抑该信号通路对FSH影响猪卵泡颗粒细胞的作用的影响；用BMP配体（BMP-6）激活BMP/Smad信号通路,用RNAi方法敲减Smad4,以阻抑该通路,分别利用MTT、流式细胞术、CLIA等方法检测两种条件下体外培养的猪卵泡颗粒细胞的存活率、细胞周期、类固醇激素分泌水平等,并采用高通量基因芯片技术,对阻抑信号通路和阻抑后激活信号通路的猪卵泡颗粒细胞之间的差异表达基因进行比较研究,主要研究结果如下：1用real time RT-PCR法检测不同发育时期猪卵泡颗粒细胞中BMP/Smad信号通路的关键因子（BMP受体和Smads）表达情况,结果表明：BMP受体和Smads在猪卵泡颗粒细胞中均有表达,并且ActR1A和BMPR2 mRNA在大卵泡颗粒细胞中的表达量显着高于小卵泡（P<0.05）。BMPR1A、ActR2、Smad1、Smad5和Smad8在卵泡发育过程中的表达有增加趋势,但差异不显着。相反,BMPR1B、Smad4和Smad7的表达有一定程度的下降。这表明BMP/Smad信号通路关键因子在猪卵泡发育阶段特异性表达,在卵泡颗粒细胞生长与分化过程中起重要的调控作用。2用免疫组织化学方法检测Smad4在猪卵巢组织中的定位与表达,结果显示,Smad4在猪卵泡的多个发育阶段的细胞中均有表达。在原始卵泡中和初级卵泡中,Smad4在卵母细胞的细胞质中表达,而在颗粒细胞中没有表达；在腔前卵泡中,Smad4蛋白在卵母细胞和颗粒细胞中均有表达,在有腔卵泡中,Smad4蛋白主要被定位到颗粒细胞和卵泡内膜细胞中,而卵母细胞中表达较弱。3为了研究BMP/Smad信号通路在猪卵泡颗粒细胞中的作用,本研究从猪卵巢卵泡（3-5mm）内分离颗粒细胞（pGCs）进行体外培养。基于Smad4在该通路中的核心地位,采用RNAi技术“沉默”猪Smad4基因,阻抑BMP/Smad信号通路,以检测阻抑该通路对猪卵泡颗粒细胞生长和类固醇激素分泌的影响。结果表明：采用的RNAi技术成功的“敲减”猪Smad4基因,在mRNA水平该基因被下调89%,蛋白水平被下调56.6%。建立了BMP/Smad信号通路阻抑的细胞模型。阻抑该通路能显着抑制细胞的增殖,增加G1期细胞的百分含量,减少S期的细胞,并能显着下调细胞增殖标志因子Cyclin D2和CDK4的mRNA表达。阻抑该通路能显着增加颗粒细胞的凋亡比率,下调Bcl-2的表达,但不影响Bax的表达。阻抑该通路能显着抑制雌二醇的分泌,并下调P450arom mRNA的表达,表明BMP/Smad信号通路在猪卵泡颗粒细胞中有重要的调控作用。4为研究BMP/Smad信号通路对FSH诱导猪卵泡颗粒细胞的影响,本研究在阻抑BMP/Smad信号通路的细胞中添加FSH。用MTT法检测细胞增殖情况、流式细胞法检测细胞周期变化、CLIA方法检测雌二醇和孕酮的分泌以及real time RT-PCR检测相关基因的mRNA表达。结果表明：阻抑信号通路下调FSH受体的表达,阻抑信号通路使FSH促进细胞增殖的作用减弱,阻抑信号通路能显着增加G1期的细胞比率,即使添加FSH；阻抑通路能降低Cyclin D2的表达,且能抑制FSH促进其表达；阻抑信号通路能抑制CDK4的表达,即使添加FSH；阻抑信号通路能降低FSH诱导细胞分泌雌二醇的能力,但对孕酮没有影响。阻抑信号通路能减少P450arom的表达,并且降低FSH对其表达的影响；阻抑信号通路抑制FSH对P450scc表达的影响。5为研究BMP/Smad信号通路对猪卵泡颗粒细胞的影响,基于Smad4在该通路中的核心地位,采用RNAi技术“沉默”猪Smad4基因,阻抑BMP/Smad信号通路,另一方面,添加BMP配体（BMP-6）激活该通路,分别观察阻抑和/或激活BMP/Smad信号通路对细胞生物学特性的影响。结果表明：阻抑通路显着抑制细胞的增殖,增加G1期的细胞,减少S期细胞；激活通路则促进细胞生长,减少G1期细胞,增加S期细胞,阻抑信号通路能抑制雌二醇的合成,对孕酮没有显着影响,激活该通路抑制两种类固醇激素的分泌。在阻抑通路与阻抑后再激活通路的不同处理组细胞中筛选到37个差异表达探针,上调基因25个,下调基因12个。结合GO分析,37个基因中24个基因可以在生物过程中找到注释,23个基因在分子功能中找到注释,13个基因在细胞组成中找到注释。
李兵,曾令兵[7]（2009）在《RNA干涉技术及其在水产科学中的应用》文中提出介绍了RNA干涉的作用机制和特点,从抑制水生动物病毒、研究水生动物基因功能等方面综述了RNA干涉技术近年在水产科学领域中的应用。
阮井玲[8]（2008）在《猪Smad3、MyoD及GDF-8基因调控网络的研究》文中指出哺乳动物骨骼肌的生成具有十分复杂的机理,生肌转录因子Smad3、生肌调节因子MyoD、抑肌素基因GDF-8等生肌因子在骨骼肌生成中均起到重要作用,对Smad3、MyoD和GDF-8三个基因调控网络的研究对骨骼肌生成机理及猪育种研究具有十分重要的意义。抑肌素GDF-8（又名Myostatin,MSTN）基因是TGF-β超家族的一员,是肌肉生长的负调控因子。GDF-8分泌到胞外后,与细胞膜上的受体发生相互作用,通过三种Smad蛋白的介导将信号转入细胞核,作用于靶基因的调控区。Smad3对细胞生长的作用是双向的,既有促进,也有抑制,具体机制目前尚未完全清楚。MyoD基因对生肌发生起重要调节作用,可促使某些细胞向骨骼肌细胞分化。鉴于这三个基因在猪骨骼肌卫星细胞分化调控过程中的重要作用,本研究建立了猪骨骼肌卫星细胞系,利用RNAi技术和基因过量表达技术,以Smad3、MyoD和GDF-8基因为靶基因,研究三个基因对骨骼肌卫星细胞增殖的调控作用以及基因间的网络关系。主要研究结果如下:（1）根据Genbank上登录号为NM214137的猪Smad3基因CDS序列设计一对引物S3,以猪骨骼肌cDNA为模板,成功扩增出1278bp基因片段。与真核表达载体pcDNA3.1+连接后经测序以及PCR鉴定证实为目的片段。（2）建立了稳定的猪骨骼肌卫星细胞体外培养体系,并从细胞形态、核型分析等方面对猪骨骼肌卫星细胞进行了鉴定。（3）RNA干扰条件优化以及最佳干扰序列的筛选:利用RT-PCR方法,检测了Smad3、MyoD和GDF-8在体外培养的五个世代猪骨骼肌卫星细胞中的表达情况,发现三个基因的表达量均在第一、二代较高,与第三、四、五世代差异显着（P<0.05）;成功地构建了带有荧光标记基因的表达载体psiSTRIKTM hMGFP,最佳转染体系DNA: Lipofectamine:Plus的比例为2:5:10;转染后的48h检测转染效率最高;针对Smad3基因的mRNA序列,分别在不同区域设计了三对特异性干扰序列,对其干扰效果进行比较,统计结果表明,三对特异性干扰序列均能显着降低Smad3基因的表达水平（P<0.05）,其中第三对干扰序列干扰效果好于其它两对,非特异性序列并未引起GDF-8基因mRNA的表达下降（P>0.05）。（4）利用RNAi技术,研究了干扰Smad3、MyoD与GDF-8基因对猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响,其中干扰Smad3基因对骨骼肌卫星细胞的增殖有促进作用（P<0.05）,干扰MyoD组细胞的增殖能力未受到影响（P>0.05）,而干扰GDF-8组细胞的增殖能力显着提高（P<0.05）。（5）利用RNAi技术,抑制了猪骨骼肌卫星细胞中Smad3、MyoD与GDF-8基因的表达。检测结果表明:Smad3基因表达下调后,MyoD基因的表达量显着升高（P<0.05）,GDF-8基因的表达受到明显的抑制（P<0.05）;MyoD基因表达下调后GDF-8基因表达显着降低（P<0.05）,Smad3基因的表达量无显着变化（P>0.05）;在干扰GDF-8基因使其表达下调后,MyoD表达量显着升高（P<0.05）,Smad3基因的表达量明显下降（P<0.05）。（6）利用基因过量表达技术,在猪骨骼肌卫星细胞中使Smad3基因超表达。检测结表明,过量表达Smad3基因处理组细胞的增殖能力与对照组相比明显降低（P<0.05）;Smad3基因的表达上调后,MyoD基因的表达量随之下降,且显着低于正常细胞组（P<0.05）,同时GDF-8基因的表达显着升高（P<0.01）。（7）综合研究成果,猪骨骼肌卫星细胞中Smad3、MyoD和GDF-8三基因的表达具有相关性,并初步绘制了Smad3、MyoD与GDF-8三个基因的调控网络图。
郑嵘[9]（2008）在《利用RNA干涉技术研究Smad2和Smad3在鼠成纤维细胞TGF-β信号通路中的不同作用》文中研究指明RNA干扰（RNA interference,RNAi）是由双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）介导的一种特异性基因表达沉默,是一种古老但在进化上又高度保守的基因表达调节机制。关于RNAi的基础研究和应用研究迅速成为21世纪初生命科学的热点之一,在人、小鼠及其他哺乳动物中,RNAi已广泛应用于基因功能验证、信号转导和基因治疗等领域的研究。由于哺乳动物缺乏体内siRNA介导的沉默放大效应,利用DNA载体在细胞内稳定转录出siRNAs,并维持长时间抑制效果的方法已被证明是行之有效的。转化生长因子β（TGF-β,transforming growth factors beta）,在细胞生长、发育、分化和物质代谢等方面均有极其重要的作用,而Smads蛋白是目前所知的唯一的TGF-β受体胞内激酶底物,在TGF-β信号转导中起着关键的作用。本研究通过构建RNAi的DNA表达载体,特异地、有效地抑制TGF-β/Smads信号通路中通路特异性Smads—Smad2和Smad3基因在NIH/3T3小鼠成纤维细胞中的表达,分别在mRNA水平和蛋白质水平研究Smad2和Smad3的不同作用和相互关系及在TGF-β信号转导过程中所处的地位。具体研究结果如下:1.确定了外源TGF-β1诱导NIH/3T3细胞中Smads蛋白表达的最佳浓度和时间。通过设置添加TGF-β1处理的不同浓度梯度和时间梯度,利用半定量RT-PCR和Western-blottting分析方法确定诱导Smads蛋白达到最高表达量的浓度和时间分别为5μg/L和3小时,并发现Smad3的表达对TGF-β1的刺激尤为敏感,从0.5小时起一直持续高效表达。2.构建了靶基因的shRNA DNA表达载体。按照siRNA的设计规则,针对Smad2和Smad3基因分别设计了5条21bp的siRNA序列,合成了10条62-64bp的双链DNA寡核苷酸序列,并将它们分别插入到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen质粒载体中,获得了包括阳性和阴性对照的12个shRNA的DNA表达质粒,并经酶切和测序验证。3.建立了一套比较有效的RNAi的技术体系。将所获得12个RNAi表达质粒利用脂质体介导的方法分别转染NIH/3T3小鼠成纤维细胞,提取转染细胞的总RNA和总蛋白质,采用半定量RT-PCR和Western-blotting方法分析了siRNA抑制效果,获得了两个特异地、有效地抑制Smad2和Smad3表达的RNAi表达质粒。分析这两个有效的siRNA序列发现,正义链第10位的碱基在设计中具有重要的作用,当第10位为U时,抑制效率最高,其次是C,最后是A/G。4.分析了Smad2和Smad3在TGF-β信号转导过程中的不同作用。在mRNA水平和蛋白质水平分别检测了Smad2-depleption细胞、Smad3-depleption细胞和Smad2+3-deoleption细胞中Smad2、Smad3和Smad4的表达,发现在Smad2-depleption细胞中Smad3和Smad4的表达提高,而在Smad3-depleption细胞中Smad2的表达没有发生改变,Smad4的表达降低。表明TGF-β信号在NIH/3T3细胞转导过程中,Smad3起到关键的调节作用。5.建立了混合RNAi表达质粒有效地抑制靶基因表达的方法。分别针对于Smad2和Smad3 mRNA序列不同区段的4个shRNA表达质粒等比例混合,构成Smad2-RNAi池和Smad3-RNAi池,利用脂质体将RNAi混合质粒共同导入NIH/3T3细胞中,经半定量RT-PCR和Western-blotting方法分析,发现RNAi池抑制Smad2或Smad3表达的效果要明显高于单一的RNAi表达质粒。表明针对靶基因mRNA序列不同区段的混合RNAi表达质粒可以提高RNAi的抑制效果,为有效利用RNAi表达载体研究基因的功能提供了一个新的策略。
徐化学[10]（2007）在《水稻功能候选基因RNA干涉载体的构建及其应用》文中认为RNA干涉（RNA interference，RNAi）技术是通过双链RNA的介导特异性地降解相应序列的mRNA，从而导致转录后水平的基因沉默。该技术已被广泛应用于植物基因功能研究。与其他技术相比，RNA干涉技术具有特异性强、沉默效率高等优点。本文应用Gateway技术进行水稻功能候选基因RNA干涉表达载体的构建，并进行遗传转化研究。Gateway技术是通过多重载体，高效构建目标基因及任何DNA片段克隆载体和表达载体。该技术以λ噬菌体的位点特异性重组体系为基础，两端具有位点的DNA片段或目标基因可以非常容易地被重组克隆到含同源重组位点的载体上。本文采用Gateway技术体系，以水稻细胞程序性死亡相关功能候选基因OsCDC5、OsDAD1、OsPDCD5为目的基因，从中选取目标区段进行RNA干涉表达载体的构建，经过attB-PCR扩增、BP反应、LR反应后，成功构建了三个水稻功能候选基因的RNA干涉双元表达载体，为大规模构建水稻功能候选基因RNAi载体打下了基础。构建完成的载体通过农杆菌介导法转化籼稻IR64，经过共培养、筛选培养、预分化培养、分化培养等获得122株转基因植株。同时在转基因过程中对籼稻IR64愈伤组织诱导、分化以及农杆菌转化水稻的各个参数进行优化。
二、基于smad7基因为靶序列的RNA干涉作用研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基于smad7基因为靶序列的RNA干涉作用研究（论文提纲范文）
（1）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）Sulfolobus islandicus CRISPR-Cas病毒防御功能的遗传学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 CRISPR-Cas免疫系统的发现及其功能 |
| 1.2 CRISPR-Cas系统多样性及其分类 |
| 1.3 CRISPR-Cas系统介导的病毒防御原理 |
| 1.3.1 新spacer的获取 |
| 1.3.2 CRISPR RNA加工 |
| 1.3.3 Ⅰ型Cascade介导依赖PAM识别的DNA干涉 |
| 1.3.4 Ⅱ型和Ⅲ-A亚型CRISPR-Cas系统介导的DNA干涉简介 |
| 1.3.5 Ⅲ-B亚型Cmr系统介导RNA干涉 |
| 1.4 S islandicus Rey15A中CRISPR-Cas干涉系统 |
| 1.5 本研究目的 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 分子生物学实验材料 |
| 2.1.3 Sulfolous细胞培养 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Sulfolobus感受态制备及电转化 |
| 2.2.2 cas敲除质粒及cas缺失株的构建 |
| 2.2.3 cas互补质粒,DNA、RNA干涉质粒构建 |
| 2.2.4 Sulfolobus总RNA提取及Northern分析 |
| 2.2.5 cDNA合成,qPCR及RACE |
| 2.2.6 β-糖苷酶试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 I-A亚型系统中Cas蛋白在pre-crRNA加工及PAM依赖型DNA干涉中功能的遗传学鉴定 |
| 3.1.1 cas缺失株的构建 |
| 3.1.2 对Cascis,Cmr-α和Cmr-β是否参与pre-crRNA加工和DNA干涉的确定 |
| 3.1.3 S islandicus Rey15A I-A亚型CRISPR-Cas系统中Cas6,Cas7,Cas5和Csa5蛋白功能分析 |
| 3.1.4 Cas3(解旋酶-核酸酶)在pre-crRNA加工及DNA干涉过程中的功能分析 |
| 3.2 Ⅲ-B亚型Cmr系统介导的RNA干涉的体内分析 |
| 3.2.1 S.islandicus内源CRISPR系统介导的RNA干涉活性研究 |
| 3.2.2 pAC质粒表达的crRNA对S.islandicus Rey15A中靶基因表达高效抑制作用的鉴定 |
| 3.2.3 S1 crRNA 3’端一个3nt序列对Cmr介导的体内RNA干涉重要性的确定 |
| 3.2.4 S.islandicus中Ⅲ-B亚型Cmr系统介导的基因沉默分析 |
| 3.2.5 S.islandicus Cmr系统执行的RNA剪切特征的分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于S.islandicus I-A亚型Cascade的组装 |
| 4.2 关于S.islandicus CRISPR-Cmr系统介导的干涉复合体对靶RNA的识别 |
| 4.3 关于6亚基Cmr复合体组装样式和靶RNA切割特征 |
| 4.4 Cmr-α与Cmr-β能否相互转化? |
| 4.5 CRISPR-Cas系统的应用前景 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1-本研究所用引物 |
| 附录2-Sulfobus培养基基础盐及维他命溶液配方 |
| 博士期间研究成果 |
| 致谢 |
（3）AAN中Smad7泛素化及调节TGF-β1信号通路相关因子表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 缩写词表 |
| 第一章 概述 |
| 1.1 研究目的与意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 不同浓度比例转染混合物的细胞转染率 |
| 3.2 细胞的形态学观察 |
| 3.3 不同位点SIRNA对ARKADIA和UCH37 MRNA表达的影响 |
| 3.4 表达载体PGPU6/GF/PNEO-ARKADIA和PGPU6/GFP/NEO-UCH37的构建 |
| 3.5 质粒DNA和脂质体最佳转染比例和时间的检测 |
| 3.6 表达载体转染后CK18、VIMENTIN和A-SMA MRNA的表达变化 |
| 3.7 表达载体转染后SMAD2、SMAD3和TBRI MRNA和蛋白的表达变化 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 ARKADIA和UCH37表达载体的构建 |
| 4.2 表达载体转染条件的优化 |
| 4.3 SMAD7对TGF-B1信号通路中关键因子表达的影响 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）siRNA-smad3对缺血性脑损伤ActA/smads信号转导通路的影响（论文提纲范文）
| 提要 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 文献综述 |
| 一、激活素A/Smads信号传导系统研究进展 |
| 二、RNAi技术研究进展 |
| 第三章 PC12细胞转化为神经元样细胞的培养、鉴定及氧糖剥夺模型的制备 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第四章 激活素A对OGD后PC12细胞凋亡及对smads信号转导通路的影响 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第五章 RNAi沉默PC12细胞Smad3基因表达方法的建立 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第六章 SiRNA-Smad3对ActA/Smads信号转导通路的影响 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第七章 SiRNA-Smad3对OGD后PC12细胞凋亡的影响 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第八章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表论文及其他成果 |
| 致谢 |
（5）组织特异沉默BMP4基因转基因小鼠模型的构建及表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1、毛囊 |
| 1.1 毛囊的形态结构 |
| 1.2 毛囊的形态发生 |
| 1.3 调节毛囊形态发生的基因和信号通路 |
| 1.4 毛发的周期循环 |
| 1.5 毛囊类型与毛性状 |
| 2 毛发角蛋白 |
| 2.1 角蛋白中间丝蛋白(IF) |
| 2.2 角蛋白关联蛋白(KAPs) |
| 2.3 角蛋白基因在毛囊中的表达 |
| 2.4 角蛋白基因表达的调控 |
| 3 角蛋白启动子 |
| 3.1 角蛋白14(K14)启动子 |
| 3.2 角蛋白5(K5)启动子 |
| 3.3 外皮蛋白启动子(Involucrin) |
| 4 RNA干涉 |
| 4.1 RNA干涉的分子机制 |
| 4.2 RNA干涉实现的技术路线 |
| 4.3 RNA干涉技术的应用 |
| 第二章 角蛋白启动子克隆及活性检测 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验流程 |
| 4 实验结果 |
| 3 结论 |
| 4 讨论 |
| 第三章 BMP4基因RNAi有效靶点的筛选 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 RNAi转基因小鼠制备及分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 生化试剂、药品和酶 |
| 1.4 试剂的配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 1.6 分析工具软件及网址 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 转基因小鼠的制备 |
| 2.2 鼠尾基因组的提取 |
| 2.3 转基因小鼠PCR鉴定 |
| 2.4 Southern杂交 |
| 2.5 Northern blot |
| 3 实验结果 |
| 3.1 转基因小鼠制备 |
| 3.2 转基因小鼠PCR鉴定 |
| 3.3 转基因小鼠Southern杂交鉴定 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 关于表达载体的分析和选择 |
| 4.2 Southern杂交 |
| 4.3 组织特异RNAi |
| 4.4 转基因小鼠 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）BMP/Smad信号通路对猪卵泡颗粒细胞的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 卵泡发育 |
| 1 卵泡发育过程 |
| 2 卵泡闭锁 |
| 3 卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡 |
| 4 颗粒细胞与卵泡发育 |
| 第二章 BMP/Smad信号通路在卵泡发育过程中的作用 |
| 1 BMP/Smad信号通路概述 |
| 2 Smad4研究进展 |
| 2.1 Smad4的结构和功能 |
| 2.2 Smads对靶基因的调节 |
| 2.3 Smad4在TGF-β信号通路中的作用 |
| 3 BMP/Smad信号通路在卵泡发育过程中发挥重要作用 |
| 第三章 研究基因表达调控及信号转导的方法 |
| 1 RNAi技术 |
| 1.1 RNAi的发现和发展 |
| 1.2 RNAi的作用机制 |
| 1.3 作用特点 |
| 1.4 RNAi应用 |
| 2 基因芯片 |
| 2.1 基因芯片的特点 |
| 2.2 基因芯片应用 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第四章 BMP/Smad信号通路关键因子在猪卵泡颗粒细胞中的表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 Smad4在猪卵泡不同发育时期的表达定位 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 猪卵巢组织形态学分析 |
| 2.2 Smad4在猪不同发育时期卵泡中的表达定位 |
| 2.3 Smad4在猪不同发育时期卵泡颗粒细胞中的表达变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 阻抑BMP/Smad信号通路对猪卵泡颗粒细胞生长与分化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 siRNA转染GCs的鉴定及效率分析 |
| 2.2 通过RNAi的方法抑制Smad4的表达 |
| 2.3 阻抑BMP/Smad信号通路对细胞生长的影响 |
| 2.4 阻抑BMP/Smad信号通路对细胞周期的影响 |
| 2.5 阻抑BMP/Smad信号通路对细胞周期相关因子的影响 |
| 2.6 阻抑BMP/Smad信号通路对细胞凋亡的影响 |
| 2.7 阻抑BMP/Smad信号通路对细胞凋亡相关基因的表达的影响 |
| 2.8 阻抑BMP/Smad信号通路对细胞分泌雌二醇和孕酮的影响 |
| 2.9 阻抑BMP/Smad信号通路对类固醇合成相关酶mRNA表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 阻抑BMP/Smad信号通路对FSH诱导猪卵泡颗粒细胞生长与分化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 阻抑BMP/Smad信号通路对FSH诱导的FSHR的影响 |
| 2.2 阻抑BMP/Smad信号通路对FSH诱导的细胞增殖的影响 |
| 2.3 阻抑BMP/Smad信号通路对FSH诱导的细胞周期的影响 |
| 2.4 阻抑BMP/Smad信号通路对FSH诱导的对细胞周期相关基因表达的影响 |
| 2.5 阻抑BMP/Smad信号通路对FSH诱导的细胞分泌雌二醇和孕酮的影响 |
| 2.6 阻抑BMP/Smad信号通路对FSH诱导的类固醇合成相关酶表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 BMP/Smad信号通路对猪卵泡颗粒细胞生物学行为的影响及可能的分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BMP/Smad信号通路对颗粒细胞细胞增殖的影响 |
| 2.2 BMP信号通路对颗粒细胞细胞周期的影响 |
| 2.3 BMP信号通路对细胞分泌类固醇激素的影响 |
| 2.4 总RNA提取及纯化 |
| 2.5 芯片杂交结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 附录一 主要溶液的配制 |
| 攻读博士期间发表及待发表的论文 |
（7）RNA干涉技术及其在水产科学中的应用（论文提纲范文）
| 1 RNA干涉技术 |
| 1.1 RNAi的发展过程 |
| 1.2 RNAi的作用机制 |
| 1.3 RNAi的特点 |
| 1.4 siRNA的制备 |
| 1.5 RNAi技术的应用 |
| 2 RNAi在抑制水产动物病毒复制方面的应用 |
| 2.1 抑制真鲷虹彩病毒 |
| 2.2 抑制对虾白斑综合症病毒 |
| 2.3 抑制蛙病毒 |
| 2.4 抑制草鱼呼肠孤病毒 |
| 3 RNAi在水产动物基因功能研究方面的应用 |
| 4 问题与展望 |
（8）猪Smad3、MyoD及GDF-8基因调控网络的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 骨骼肌卫星细胞 |
| 1.1.1 骨骼肌卫星细胞的发生 |
| 1.1.2 骨骼肌卫星细胞培养 |
| 1.2 SMADS 基因家族 |
| 1.2.1 Smads 基因家族的结构特点与功能 |
| 1.2.2 Smad3 基因结构与功能 |
| 1.3 生肌调节因子家族 |
| 1.3.1 MyoD 基因家族的结构特点与功能 |
| 1.3.2 MyoD 基因结构与功能 |
| 1.4 GDF-8 基因的结构与功能 |
| 1.5 RNA 干涉技术 |
| 1.5.1 RNA 干涉技术的发展 |
| 1.5.2 RNAi 的一般机制 |
| 1.5.3 siRNA 的设计原则 |
| 1.5.4 设计阴性对照 |
| 1.5.5 siRNA 的制备方法 |
| 1.5.6 siRNA 的转染 |
| 1.5.7 RNAi 效果检测 |
| 1.5.8 RNAi 技术的应用前景 |
| 1.6 基因过量表达技术 |
| 1.7 基因调控网络 |
| 1.8 本研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器设备 |
| 2.2.2 主要药品、试剂及配制 |
| 2.2.3 主要分析软件 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 引物的设计与合成 |
| 2.3.2 骨骼肌卫星细胞体外培养体系的建立 |
| 2.3.3 RNA 干扰 |
| 2.3.4 Smad3 基因过量表达 |
| 2.3.5 数据的统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 骨骼肌卫星细胞体系的建立 |
| 3.1.1 骨骼肌卫星细胞的分离、培养 |
| 3.1.2 骨骼肌卫星细胞的增殖 |
| 3.1.3 核型分析 |
| 3.2 SMAD3、MYOD 与GDF-8 在不同世代表达规律 |
| 3.2.1 RNA 的提取 |
| 3.2.2 Smad3 基因在细胞不同世代表达规律的研究 |
| 3.2.3 MyoD 基因在细胞不同世代表达规律的研究 |
| 3.2.4 GDF-8 基因在不同世代的表达规律 |
| 3.3 SMAD3、MYOD 与GDF-8 基因的RNAI 研究 |
| 3.3.1 Smad3 基因的RNAi 研究 |
| 3.3.2 MyoD 基因的RNAi 研究 |
| 3.3.3 GDF-8 基因的RNAi 研究 |
| 3.4 猪骨骼肌卫星细胞增殖转录调节因子SMAD3 基因的过量表达研究 |
| 3.4.1 Smad3 基因真核表达载体的构建 |
| 3.4.2 Smad3 基因过量表达效果检测 |
| 3.4.3 过量表达Smad3 基因对细胞增殖的影响 |
| 3.4.4 Smad3 基因表达上调后GDF-8 和MyoD 基因的表达情况 |
| 3.5 SMAD3、MYOD 与GDF-8 基因互作分析及调控网络关系 |
| 4 讨论 |
| 4.1 骨骼肌卫星细胞的体外培养 |
| 4.1.1 骨骼肌卫星细胞体外培养的增殖特性 |
| 4.1.2 骨骼肌卫星细胞生长曲线的绘制及核型分析 |
| 4.2 SHRNA 的设计与筛选 |
| 4.3 转染效率的影响因素 |
| 4.4 SMAD3、MYOD 与GDF-8 基因对猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响 |
| 4.4.1 干扰Smad3、MyoD 与GDF-8 基因对猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响 |
| 4.4.2 过量表达Smad3 基因对猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响 |
| 4.5 SMAD3、MYOD 与GDF-8 基因在猪骨骼肌卫星细胞增殖过程中的调控网络关系 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（9）利用RNA干涉技术研究Smad2和Smad3在鼠成纤维细胞TGF-β信号通路中的不同作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 基因功能的研究 |
| 1.1 生物信息学预测基因功能 |
| 1.1.1 同源性反应了进化关系 |
| 1.1.2 同源性分析可以给出整个基因或某一区段功能的信息 |
| 1.2 研究基因功能的方法 |
| 2 RNA干涉现象(RNAI,RNA INTERFERENCE) |
| 2.1 基因沉默 |
| 2.2 RNAi技术的发现 |
| 2.3 RNA干涉的机制和特点 |
| 2.3.1 RNA干涉技术中相关酶类或蛋白质以及基因 |
| 2.3.2 RNAi的作用机制 |
| 2.3.3 RNAi的特点 |
| 2.4 RNAi在哺乳动物中的研究 |
| 2.5 siRNA的获得 |
| 2.5.1 siRNA序列的设计 |
| 2.5.2 siRNA的合成 |
| 2.6 RNA干扰技术的应用及展望 |
| 2.6.1 高通量研究基因的功能 |
| 2.6.2 基因治疗 |
| 2.6.3 信号通路 |
| 2.6.4 局限性 |
| 3 TGF-B超家族与SMAD蛋白 |
| 3.1 TGF—β生物学效应 |
| 3.2 TGF—β信号传导通路 |
| 3.2.1 TGF—β受体 |
| 3.2.2 Smads蛋白 |
| 3.3 Smad介导TGF-β信号转导 |
| 3.4 Smads在脊椎动物中的功能 |
| 3.5 TGF-β/Smad2,3信号通路的研究进展 |
| 第二章 研究目的及意义 |
| 第三章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验所用细胞、菌株、质粒载体 |
| 1.2 主要试剂和试剂盒 |
| 1.3 常用缓冲液和试剂配置 |
| 1.4 质粒提取缓冲液 |
| 1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液 |
| 1.6 Western blot缓冲液 |
| 1.7 抗生素类 |
| 1.8 培养基 |
| 1.8.1 细菌培养基 |
| 1.8.2 细胞培养基 |
| 1.9 主要仪器和设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 DNA片段的回收 |
| 2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 2.4 连接产物转化 |
| 2.5 质粒DNA的提取 |
| 2.5.1 碱裂解法小量制备质粒 |
| 2.5.2 超纯质粒的提取 |
| 2.6 阳性克隆子的鉴定 |
| 2.6.1 酶切鉴定 |
| 2.6.2 序列测定 |
| 2.7 半定量RT-PCR反应 |
| 2.7.1 引物设计 |
| 2.7.2 细胞总RNA的提取 |
| 2.7.3 cDNA第一链合成 |
| 2.7.4 PCR反应 |
| 2.7.5 RT-PCR反应产物的检测 |
| 2.8 SDS-PAGE和Western-blot |
| 2.8.1 SDS-PAGE电泳 |
| 2.8.2 Western-blot分析 |
| 2.9 RNA interference方法的建立 |
| 2.9.1 siRNA的设计与合成 |
| 2.9.2 shRNA表达质粒的构建 |
| 2.9.3 脂质体介导的细胞转染 |
| 2.9.4 RNA干扰效果的分析 |
| 第四章 结果与分析 |
| 1 TGF-B1诱导SMADS蛋白的表达 |
| 1.1 TGF-β1浓度的确定 |
| 1.1.1 TGF-β1浓度梯度的设置 |
| 1.1.2半定量RT-PCR结果 |
| 1.2 TGF-β诱导时间的确定 |
| 1.2.1 TGF-β1诱导时间分组 |
| 1.2.2 半定量RT-PCR结果 |
| 1.3 Western-blotting验证 |
| 2 SHRNA表达质粒的构建 |
| 2.1 siRNA序列的设计 |
| 2.2 shRNA表达质粒的构建 |
| 2.3 线性RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen环化成载体质粒 |
| 3 SHRNA效果分析 |
| 3.1 shRNA表达质粒的转染 |
| 3.2 Smad2和Smad3的干扰效果 |
| 3.2.1 RT-PCR分析Smad2和Smad3的mRNA表达水平 |
| 3.2.2 Western-blotting分析Smad2/3的表达水平 |
| 3.2.3 RNAi有效时间的确定 |
| 3.2.4 在Smad2-depletion细胞和Smad3-depletion细胞中Smads蛋白之间的相互关系 |
| 4 SHRNA混合质粒干扰效果分析 |
| 4.1 Smad2-shRNA混合质粒干扰效果的RT-PCR分析 |
| 4.2 Smad2-shRNA混合质粒干扰效果的Western-blotting分析 |
| 4.3 Smad3-shRNA混合质粒干扰效果分析 |
| 第五章 讨论 |
| 1 关于基因的功能研究 |
| 2 关于小鼠成纤维细胞 |
| 3 关于RNAI技术体系 |
| 3.1 siRNA序列的设计 |
| 3.2 关于shRNA |
| 3.3 shRNAs导入方式 |
| 3.4 siRNA效应的持续时间 |
| 3.5 RNAi效应的分析方法 |
| 3.6 混合RNAi质粒 |
| 4 关于TGF-B信号通路 |
| 4.1 TGF-β1诱导时间和浓度 |
| 4.2 TGF-β1诱导Smads蛋白的表达 |
| 4.3 Smad2和Smad3的不同作用 |
| 4.4 关于Smad4 |
| 5 下步工作计划 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）水稻功能候选基因RNA干涉载体的构建及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物功能候选基因的分析策略 |
| 1.1.1 寻找功能候选基因 |
| 1.1.2 功能候选基因的验证 |
| 1.2 植物细胞程序化死亡相关功能候选基因 |
| 1.2.1 植物PCD研究概况 |
| 1.2.2 植物PCD的基本特征 |
| 1.2.3 植物PCD相关基因 |
| 1.2.4 水稻PCD相关基因 |
| 1.3 RNA干涉技术及其在基因功能研究中的应用 |
| 1.3.1 RNA干涉现象的发现过程 |
| 1.3.2 RNA干涉的分子机制 |
| 1.3.3 RNA干涉的特点 |
| 1.3.4 植物RNA干涉载体特征 |
| 1.3.5 应用Gateway技术构建RNA干涉载体 |
| 1.4 目的和意义 |
| 第二章 构建水稻功能候选基因的RNA干涉载体 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 水稻材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 RNA干涉区段选择及引物设计 |
| 2.1.4 TRIzol法提取籼稻IR64总RNA |
| 2.1.5 RT-PCR |
| 2.1.6 attB-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.1.7 纯化回收attB-PCR产物 |
| 2.1.8 BP反应 |
| 2.1.9 LR反应 |
| 2.1.10 表达克隆转化农杆菌LBA4404感受态细胞 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RNA干涉区段选择与PCR引物设计 |
| 2.2.2 水稻总RNA检测 |
| 2.2.3 attB-RCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.2.4 BP反应阳性克隆检测 |
| 2.2.5 表达克隆转化农杆菌LBA4404 |
| 第三章 RNA干涉载体对籼稻IR64的遗传转化 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料和试剂 |
| 3.1.2 农杆菌介导的水稻遗传转化 |
| 3.1.3 转化条件的优化 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 出愈率以及愈伤生长状态的研究 |
| 3.2.2 提高愈伤组织分化频率的研究 |
| 3.2.3 潮霉素筛选浓度的确定 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 RNA干涉载体的构建方法 |
| 4.2 影响RNA干涉效率的因素 |
| 4.3 应用Gateway技术构建RNA干涉载体注意事项 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ RNA干涉载体示意图 |
| 附录Ⅱ 水稻转化组织培养图片 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、基于smad7基因为靶序列的RNA干涉作用研究（论文参考文献）
- [1]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [2]Sulfolobus islandicus CRISPR-Cas病毒防御功能的遗传学分析[D]. 彭文舫. 华中农业大学, 2015(11)
- [3]AAN中Smad7泛素化及调节TGF-β1信号通路相关因子表达的研究[D]. 廖芳芳. 北京农学院, 2012(03)
- [4]siRNA-smad3对缺血性脑损伤ActA/smads信号转导通路的影响[D]. 郭洪亮. 吉林大学, 2011(10)
- [5]组织特异沉默BMP4基因转基因小鼠模型的构建及表达分析[D]. 代蓉. 石河子大学, 2011(04)
- [6]BMP/Smad信号通路对猪卵泡颗粒细胞的影响[D]. 王伟. 南京农业大学, 2010(06)
- [7]RNA干涉技术及其在水产科学中的应用[J]. 李兵,曾令兵. 长江大学学报(自然科学版)农学卷, 2009(02)
- [8]猪Smad3、MyoD及GDF-8基因调控网络的研究[D]. 阮井玲. 东北农业大学, 2008(03)
- [9]利用RNA干涉技术研究Smad2和Smad3在鼠成纤维细胞TGF-β信号通路中的不同作用[D]. 郑嵘. 华中农业大学, 2008(03)
- [10]水稻功能候选基因RNA干涉载体的构建及其应用[D]. 徐化学. 中国农业科学院, 2007(05)