一、造血干细胞转分化肝组织细胞的研究进展（论文文献综述）
李昕宇[1]（2021）在《小鼠Kupffer细胞的转分化研究》文中研究指明研究背景及目的:KCs是肝脏长期驻留的巨噬细胞,在慢性肝损伤期间KCs被激活并分泌促炎症和促纤维化细胞因子,作用于HSCs转分化形成肌成纤维细胞,最终产生胶原沉积,学术界广泛认可,HSCs是肝脏中胶原沉积的主要来源,也是肝纤维化病理过程的核心环节,而KCs除了能辅助HSCs参与纤维化以外,是否有其他途径产生胶原沉积尚未阐明。HSCs转分化成为肌成纤维细胞是肝纤维化的关键步骤,除了HSCs转分化以外,肝脏中还存在大量其他细胞转分化的现象,例如有实验研究证明了动物模型中肝细胞和胆管细胞相互转化。在肝外组织中的巨噬细胞,例如皮肤、心肌、肾脏等组织中巨噬细胞可更进一步转分化为纤维细胞并分泌胶原蛋白,和伤口损伤愈合修复密切相关。通过上述类比,提出KCs可以发生转分化的猜想,KCs转分化为类成纤维细胞后可能产生胶原沉积,甚至有可能参与肝组织损伤修复乃至肝纤维化形成。KCs的转分化理论提供了不同于传统纤维化理论着眼于HSCs的不同视角,把肝硬化的过程视为河流,HSCs的转分化可视作主干道,而KCs则可作为支流,提供了未来肝纤维化治疗的新思路和新靶点,同时给成纤维细胞提供了新的来源,完善了对肝纤维化的认识。材料和方法:首先本研究在两个不同的体外实验模型中进行平行实验:体外肝脏非实质细胞培养和精密肝切片培养。具体步骤如下:（1）构建特异性追踪KCs谱系的动物模型Emr1Cre+/-::Ribo Tag+/-的小鼠追踪KCs谱系。（2）分离KCs后进行体外培养。（3）使用精密肝切片培养技术进行精密肝片培养。（4）使用免疫荧光成像分析培养后的KCs表达的蛋白。（5）利用多聚体免疫共沉淀富集KCs,提取RNA,合成c DNA。（6）实时定量PCR（Fludigm）。其次在小鼠肝切片中进行胶原沉积研究,使用氯膦酸盐脂质体耗竭KCs,进行精密肝切片培养,对肝切片进行Masson三色染色和RT-PCR基因表达分析。最后使用IL1r敲除小鼠和Nlrp3基因敲除小鼠,使用精密肝切片培养技,实时定量PCR分析基因表达,使用LDH检测套盒定量分析肝片中细胞死亡情况。结果:（1）随着体外培养时间的推移,体外非实质细胞培养和精密肝切片培养两种模型中均发生:KCs的特征基因以及调控其表达的转录因子表达下调。（2）随着体外培养时间的推移,体外非实质细胞培养和精密肝切片培养两种模型中均发生:KCs中纤维化相关的基因以及调控其表达的转录因子表达上调。上述效应在非实质细胞培养和肝组织切片培养之间是高度一致的。（3）清除KCs后肝切片中胶原沉积减少。（4）Il-1r敲除小鼠的肝片中细胞死亡相关基因表达与对照组没有显着差异。（5）Nlrp3敲除小鼠肝片中细胞死亡相关基因表达与对照组没有显着差异。结论:KCs转分化在体外非实质细胞培养和精密肝切片培养两种模型中均有发生。KCs的转分化在体外培养中相对保守反应,转分化为类似成纤维细胞样的细胞,可以分泌胶原沉积相关蛋白。
潘益巧[2]（2021）在《“补肾化瘀法”基于SDF-1/CXCR4轴促进骨髓间充质干细胞移植治疗肝硬化的机制研究》文中研究说明目的:观察补肾化瘀法（济生肾气汤加三七粉、鳖甲）联合富马酸替诺福韦二吡呋酯片治疗阳虚血瘀证乙型肝炎肝硬化患者的临床疗效,并评价其安全性;并进一步观察补肾化瘀法联合骨髓间充质干细胞移植治疗对肝硬化大鼠作用的分子机制,探讨补肾化瘀法对促进干细胞迁移、归巢、改善肝功能、肝纤维化的中医理论依据与现代分子生物学机制的关联性。方法:（1）临床研究:将符合纳入标准的62例阳虚血瘀证乙型肝炎肝硬化患者,按数字随机表法随机分为观察组31例,对照组31例。其中对照组予富马酸替诺福韦二吡呋酯片治疗,观察组在对照组基础上联合补肾化瘀法（济生肾气汤加三七粉、鳖甲）治疗,疗程均为6个月。疗程结束后观察2组患者治疗前后临床症状积分、肝功能、肝纤四项、HBV-DNA、肝脏顺时弹性成像、肝脾B超的变化,评价补肾化瘀法治疗阳虚血瘀证乙肝肝硬化的临床疗效及安全性。（2）动物研究:将80只健康SPF级SD大鼠随机分出5只大鼠用于处死后取材骨髓间充质干细胞进行细胞培养,10只大鼠作为空白组,其余大鼠采用40%CCl4橄榄油溶液（CCl4:橄榄油为4:6）皮下注射8周制成肝硬化大鼠模型。造模成功后将其分为模型组、补肾化瘀方高、中、低剂量+BMSCs移植组、BMSCs移植组、补肾化瘀方（中剂量）组。BMSCs移植组经尾静脉注入BMSCs;补肾化瘀方组予补肾化瘀方中药中剂量灌胃;补肾化瘀方高、中、低剂量+BMSCs移植组分别予补肾化瘀方中药高、中、低剂量灌胃联合尾静脉移植BMSCs治疗。灌胃均为每日1次,BMSCs移植为每周1次,从第9周起,连续4周,12周末处死并采集血液及标本。高倍镜观察肝脏病理学形态;运用全自动生化分析仪测定各组大鼠肝功能（ALT、AST、ALB、TBIL）、肝纤维化四项（HA、LN、PC-III、IV-C）;ELISA法检测各组大鼠外周血GCSF、IL-6、HGF、SCF水平;Western blot法检测各组大鼠肝组织中SDF-l、CXCR4蛋白的表达。结果:（1）临床研究:治疗后,两组患者治疗后的中医证候积分、总积分、肝功能（ALT、AST、ALB、TBIL）、肝纤四项（HA、LN、PC-III、IV-C）、HBV-DNA、肝脏硬度、门静脉主干内径、脾脏厚度均较治疗前有显着改善,差异具有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比,观察组改善中医证候积分、总积分、肝功能（ALT、AST、ALB、TBIL）、肝纤四项（HA、LN、PC-III、IV-C）、肝脏硬度、门静脉主干内径、脾脏厚度程度优于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。但两组患者治疗后的HBV-DNA转阴率无显着统计学差异（P>0.05）。两组患者在观察过程中未出现明显不良反应。（2）动物研究:1)大鼠一般情况:空白组大鼠精神状态、活跃度及灵敏度良好,毛色光亮有色泽,进食及饮水量正常,二便正常;模型组大鼠在造模过程中逐渐出现精神萎靡,反应迟钝,活动度降低,毛色逐渐粗糙暗黄,进食及饮水量明显减少,大便溏,体重由增加逐渐变下降。经干预治疗4W后,BMSCs移植组、补肾化瘀方组、补肾化瘀方高、中、低剂量+BMSCs移植组大鼠的日常活动度、摄食情况、排便情况、精神状态、周身毛发光泽度、体重等方面较模型组均有不同程度改善。其中以补肾化瘀方高剂量+BMSCs移植组改善最优。2)各组大鼠肝组织HE染色变化:空白组:肝小叶结构正常,中央静脉呈放射状排列,无炎性坏死及纤维组织增生;模型组:其结构不完整,明显炎性细胞浸润,纤维组织增生明显,假小叶形成;与模型组比较,其中以补肾化瘀方高剂量+BMSCs移植组:假小叶结构明显减少基本消失,纤维组织少量增生,有肝细胞再生现象;补肾化瘀方中剂量+BMSCs移植组:纤维化程度中度减轻,可见肝样细胞再生现象,肝组织炎性坏死减少;补肾化瘀方低剂量+BMSCs移植组:纤维化程度轻度减轻,可见炎性浸润;BMSCs移植组:有纤维组织增生,可见假小叶及炎症浸润;补肾化瘀方组假小叶较模型组减少,炎症浸润稍减轻。3)各组大鼠肝功能、肝纤四项比较:与空白组相比,模型组肝功能（ALT、AST、TBIL）、肝纤四项（HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN）显着升高,ALB显着下降,均具有显着性差异（P<0.01）;与模型组相比,各治疗组肝功能（ALT、AST、TBIL）、肝纤四项（HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN）水平均有显着下降,ALB显着上升（P<0.01）;各治疗组之间比较,补肾化瘀方高剂量+BMSCs移植组治疗效果改善最明显（P<0.01）;补肾化瘀方中剂量+BMSCs移植组与补肾化瘀方低剂量+BMSCs移植组相互比较,疗效更显着（P<0.01）;补肾化瘀方低剂量+BMSCs移植组与BMSCs移植组比较治疗效果相当（P>0.05）;与补肾化瘀方组比较,BMSCs移植组治疗效果更佳（P<0.01）。4)各组大鼠G-CSF、HGF、SCF、IL-6比较:与空白组相比,模型组G-CSF、HGF、SCF水平显着下降,IL-6水平显着升高,差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组相比,各治疗组G-CSF、HGF、SCF水平显着升高,IL-6显着降低,统计均有显着性差异（P<0.01）;干预后,各治疗组之间比较,补肾化瘀方高剂量+BMSCs移植组治疗升高G-CSF、HGF、SCF及IL-6下降效果最明显（P<0.01）;补肾化瘀方中剂量+BMSCs移植组与补肾化瘀方低剂量+BMSCs移植组相比,效果更显着（P<0.01）;补肾化瘀方低剂量+BMSCs移植组与BMSCs移植组比较效果相当（P>0.05）;与补肾化瘀方组比较,BMSCs移植组升高G-CSF、HGF、SCF及下降IL-6效果更佳（P<0.01）。5)肝组织中SDF-l、CXCR4蛋白表达比较:模型组与空白组相比,肝组织中SDF-l、CXCR4蛋白下降明显（P<0.01）;各治疗组与模型组比较,2项指标上升明显（P<0.01）;各治疗组之间比较,高、中、低剂量+BMSCs移植组三者比较,补肾化瘀方高剂量+BMSCs移植组的上述指标较其余两组升高显着（P<0.01）;补肾化瘀方中剂量+BMSCs移植组与补肾化瘀方低剂量+BMSCs移植组相比,上述指标升高效果更显着（P<0.01或P<0.05）;补肾化瘀方低剂量+BMSCs移植组与BMSCs移植组比较治疗效果无显着差异（P>0.05）;与补肾化瘀方组比较,BMSCs移植组治升高更明显（P<0.01）。结论:应用补肾化瘀法联合富马酸替诺福韦二吡呋酯片治疗阳虚血瘀证乙肝肝硬化患者能显着改善其肝功能,减轻肝纤维化程度、门静脉高压以及脾肿大,有效缓解肝脏损伤,疗效确切,安全性良好。初步验证了肝硬化“阳虚为本、瘀血为标”病理特点,运用补肾化瘀法治疗肝硬化,丰富了中医治疗肝硬化的理论基础。BMSCs移植联合补肾化瘀法可以改善肝硬化大鼠的毛发、摄食、精神、活动度等症状或体征,并改善其肝功能、肝纤维化程度,减轻炎症反应,减少胶原蛋白的沉积,并可促进BMSCs的迁移、归巢,其机制可能是通过促进SCF、G-CSF、HGF的分泌,并基于SDF-l/CXCR4轴起作用。
宋晓静[3]（2021）在《hucMSCs来源的外泌体促进大鼠肝切除术后肝再生的机制研究》文中研究表明研究目的肝脏具有强的再生能力,但由于受年龄、肝硬化、性别、肝纤维化、病毒性肝炎、肝脏脂肪变性及术中缺血再灌注损伤等一系列因素的影响,肝切除术后围手术期肝脏的再生能力受到极大程度的挑战,严重制约了肝脏外科手术的安全性。随着基础及临床转化研究的进展,干细胞、干细胞来源的外泌体及其传输的各种非编码RNA在再生医学领域表现出惊人的潜力,逐渐受到广大学者的关注。本研究在前期研究的基础上,成功实现了人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs）的分离培养,并提取外泌体;经鉴定成功后,用以干预SD大鼠70%肝切除模型及肝脏缺血再灌注损伤模型,验证hucMSCs来源的外泌体促进大鼠部分肝切除术后的肝再生、减轻肝脏缺血再灌注损伤的能力;之后,利用大鼠BRL-3A细胞系结合模型动物在体内、体外通过细胞分子生物学技术阐释hucMSCs来源的外泌体miR-124促进肝细胞再生的分子机制。本研究拟利用miRNA芯片技术探索相关的功能性miRNA表达谱,进行验证,预测并筛选出下游靶蛋白,分析micro RNA表达调控对肝再生的影响,并进行机制研究,为临床肝切除术后的治疗的防治提供科学依据,并试图找出提示肝再生的关键因子,为临床治疗提供指导意见。研究方法本研究以hucMSCs为研究对象,首先在新鲜脐带组织中利用组织块培养法分离并培养出hucMSCs。采用电镜观察、流式细胞技术鉴定成功后,更换无血清低葡萄糖的LG-DMEM培养基提取细胞培养液,采用超速离心法提取外泌体,通过TEM、NAT系统进行外泌体形态学表征及粒径分析,并利用Western Blot检测外泌体表面CD63、CD9等表面标记蛋白。分别用70%大鼠肝切除模型及大鼠缺血再灌注损伤模型在体内验证hucMSCs来源的外泌体促进部分肝切除术后肝再生、减轻肝脏缺血再灌注损伤的作用。利用Target Scan、DIANA及miRDB等多种在线工具开展生物信息学靶基因的相关预测,预测miR-124的主要潜在靶点,通过大量的反复对比和验证,依靠预测结果来推测实验目标的内在原因,最后结合模型动物及大鼠BRL-3A细胞系,利用q PCR、Western Blot等方法判断预测准确性。揭示hucMSCs来源的外泌体miRNA调控肝再生的作用机制,分析靶miRNA的下游信号通路及潜在的相互作用网络,为临床扩大肝切除及活体肝移植提供科学的借鉴。研究结果1、镜下观察提取、培养得到的hucMSCs细胞呈梭形,纺锤状,细胞形态均匀。流式细胞技术对靶细胞进行定量分析和分选,显示CD73-FITC（99.49%）和CD105-PE（99.88%）呈现阳性表达;HLA-DR-PE和CD45-FITC表达呈现阴性,各自对应于0.26%和0.38%的表达率。2、超速离心所提取的hucMSCs来源的外泌体超微结构分析显示,主要为椭圆或者是圆形的外部特征,且尺寸不一,膜结构较为完整,其中还存在着一定量的低密度物质;纳米粒子跟踪分析系统显示其粒径大小分布在48-150nm之间;通过筛选外泌体相关的标志性蛋白CD9、CD63,证实了获取的hucMSCs来源的外泌体结果稳定、可靠。3、hucMSCs来源的外泌体可显着增加SD大鼠70%肝切除术后第2天、第3天的肝体比,测定数值在实验组（PH+Exo）、对照组（PH）之间差异明显（P<0.05）;hucMSCs来源的外泌体可以显着降低缺血再灌注损伤组第2天、第3天大鼠肝脏组织中SOD、MDA、IL-6等缺血再灌注相关的肝组织损伤指标水平,实验组（HIRI+Exo）与对照组（HIRI）之间差异明显（P<0.05）。4、采用Micro RNA微阵列分析发现经过hucMSCs来源的外泌体干预后实验组（PH+Exo组）较对照组（PH组）肝脏组织中miR-193a、miR-124和miR-93显着上调,而miR-204和miR-10a-5p呈下调趋势。采用q PCR方法分析了miR-193a、miR-204、miR-124、miR-365、miR-93、miR-16、miR-10a-5p、miR-32等在PH+Exo组与PH组中的相对表达情况,进一步发现miR-193a、miR-204、miR-124、miR-93和miR-10a-5p在两组中的表达存在差异,其中miR-124在两组中的表达存在显着差异（P<0.01）。通过q PCR分析miR-193a、miR-204、miR-124、miR-93和miR-10a-5p在hucMSCs来源的外泌体中的相对表达量,发现miR-193a、miR-124和miR-93在外泌体中高表达。5、通过三种生物信息学方面的靶基因预测工具（如Target Scan、DIANA及miRDB等）对miR-124所对应的潜在靶点进行在线预测,发现了6个常见靶点（Chtf8、Pasp、CHSYS、Adam9、Strbp和Foxg1）,通过q PCR、Western Blot、双荧光素酶报告分析系统等进一步证实Foxg1是miR-124的直接靶点。6、通过Western Blot分别检测各实验组（PH、PH+Exo、PH+antigomiR-124、PH+Exo+antigomiR-124、Sham、Sham+Exo、Sham+agomiRNA-124等）大鼠肝脏中Foxg1蛋白的表达,反复验证后发现调控miR-124的表达水平后可负向调节Foxg1的表达促进大鼠肝细胞增殖。结论1、本实验成功分选出hucMSCs及其来源的外泌体,并验证了所提取的外泌体的特性。2、实验获取的外泌体对实验大鼠在实施了肝切除手术之后的肝再生起到了良好的促进作用,且减轻了SOD、MDA、IL-6等缺血再灌注相关的肝组织损伤指标,具有一定肝损伤保护作用。3、采用Micro RNA微阵列技术鉴定出了在hucMSCs来源外泌体中差异表达并与肝脏生相关的miR-124,进一步证明了hucMSCs来源的外泌体miR-124对大鼠部分肝切除术后的肝再生有很大的促进作用,并有助于减轻肝细胞损伤。4、本研究发现转录因子Foxg1是miR-124的直接靶点,miR-124可对Foxg1表达进行靶向抑制,从而使实验大鼠体内的肝细胞实现快速增殖。
胡房晓[4]（2020）在《Hoxb5转分化来源的T细胞抗肿瘤及Hoxb5调控多能造血祖细胞功能的研究》文中认为在血液系统中,Hoxb5在造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSC）中表达量最高,在多能造血祖细胞（multipotent progenitor cells,MPP）中低表达或不表达,而在下游造血谱系特化的祖细胞和子代细胞中不表达。迄今,我们已经初步认识了 Hoxb5在血液系统中的一些功能,比如,Hoxb5可以标记具有长期造血功能的造血干细胞;在B细胞中过表达Hoxb5,可以使B细胞祖细胞转分化为T细胞。这说明Hoxb5在血液细胞命运决定中起着重要的作用。然而,Hoxb5在造血细胞层级中的表达模式及其对应的详细功能尚不清楚。本论文将深入研究Hoxb5将B细胞转分化为T细胞的抗肿瘤功能及Hoxb5对多能造血祖细胞造血功能的调控影响。第一章围绕Hoxb5将B细胞转分化为T细胞的发现,进一步研究了 Hoxb5驱动携带抗原特异性TCR的B细胞祖细胞（pro-pre-B）转分化为抗原特异性TCR-T细胞的功能。首先利用OT1（针对OVA抗原的MHC-I限制性的TCR）转基因小鼠的pro-pre-B（OT1 pro-pre-B）细胞作为起始细胞,将其感染Hoxb5逆转录病毒后移植到Rag1-/-小鼠中。移植四周后,在受体鼠（OT1-iT-Rag1-/-）中检测到了表达TCRVα2和TCRVβ5（OT1-TCR）的T细胞（OT1-iT）,并且这些T细胞带有BCR重链V（D）J重排印记,证明OT1-iT细胞确实来源于B细胞。进一步分离脾脏来源的OT1-iT细胞进行抗肿瘤实验以评估其功能,OT1-iT细胞和带有OVA的黑色素瘤细胞（B16F10-OVA）体外共培养时,OT1-iT细胞能够显着杀伤B16F10-OVA,且OT1-iT在激活状态时杀伤效果更加明显。更进一步,利用体内功能实验来验证再生OT1-iT细胞的抗肿瘤功能。体内功能实验采用两种模型:（i）对OT1-iT-Rag1-/-小鼠接种B16F10-OVA细胞,即首先在小鼠中再生OT1-iT细胞,然后再接种肿瘤细胞,发现OT1-iT细胞能够长时间地有效抑制肿瘤的发生;（ii）利用B16F10-OVA细胞构建肿瘤模型鼠,并通过OT1-iT细胞进行过继治疗,发现OT1-iT细胞能够显着抑制肿瘤的生长,并且展现出肿瘤杀伤能力。除了上述OT1转基因小鼠的B细胞转分化获得功能性的OT1-iT细胞外,作者还分离了野生型小鼠的pro-pre-B细胞进行转分化实验。结果表明,野生型小鼠pro-pre-B细胞感染同时携带肿瘤相关TCR和Hoxb5表达元件OT1-Hoxb5的逆转录病毒后,同样可以获得有功能的OT1-iT细胞。当然,这种同时串联表达的方式获得的OT1-iT细胞效率要低于转基因技术,并且部分iT细胞内源的TCRa会与OT1的TCRb发生嵌合错配。除此之外,这种途径获得的OT1-iT细胞也能够杀伤肿瘤。至此,我们验证了利用Hoxb5和抗原特异性TCR能够将B细胞转分化为带有特异TCR的抗肿瘤T细胞。本研究提供了一种谱系转分化途径获得抗肿瘤特异性T细胞的技术思路。第二章研究了 Hoxb5改变多能造血祖细胞（MPP）的造血功能及机制。通过分选Hoxb5LSL/+ Mx1cre小鼠骨髓细胞中尚未启动Hoxb5转基因表达的MPP细胞（GFP-）,移植到受体鼠中后利用pIpC启动Hoxb5表达,发现在MPP中过表达Hoxb5后能够产生 GFP+Mac1+CD48+的 LSK 细胞（Mac1+CD48+SK）。分选 Mac1+CD48+SK 细胞进行移植实验表明,该细胞群可以保持长期重构造血能力,而且在系列受体鼠中依然能检测到GFP+Mac1+CD48+SK细胞,以及下游谱系定向的髓系祖细胞（MP）和淋系祖细胞（CLP）,说明Mac1+CD48+SK细胞不仅具有自我更新的能力,还保持了多能性祖细胞的特点。进一步对Mac1+CD48+SK细胞的转录组测序分析发现,Mac1+CD48+SK细胞DNA复制活跃并处于旺盛的细胞分裂状态,和胎肝期造血干祖细胞状态类似。然而过表达HOXB5后的人的脐带血来源的MPP细胞移植到B-NDG小鼠后却没有获得长期造血的功能,这可能是移植模型的骨髓微环境没有人源化的缺陷导致不能产生Mac1+CD48+SK样的细胞。因此,我们的研究证明Hoxb5能够改变MPP的细胞命运,使其获得自我更新的能力从而实现移植后长期造血的功能。因此,该发现提供了一个将造血祖细胞变为可长期造血的新型干细胞的新方法。
孟德萍[5]（2019）在《Kupffer细胞和肝窦内皮细胞促进肝脏造血及其机制研究》文中研究指明研究目的:在胚胎时期胎肝是主要的造血器官。出生后,骨髓成为主要的造血位点。在某些病理条件下,由于骨髓造血功能衰竭,肝脏等实质器官可以发生髓外造血,提示成年肝脏中含有造血干祖细胞,具有长期造血重建的能力。然而,对于成年肝脏造血的特点、肝脏造血干祖细胞的发育来源、肝脏造血微环境的组成以及肝脏微环境对肝脏造血的具体调节机制尚不清楚。在本研究中,我们首先采用造血干细胞最经典的标志lineage-sca-1+c-kit+（LSK,包含造血干细胞和多潜能祖细胞）,检测到成年小鼠肝脏中存在造血干祖细胞。进一步发现成年肝脏中存在一群与胚胎肝脏相似而不同于骨髓的CD45+lineage-mac-1+sca-1+（LMS）细胞。通过造血干细胞移植实验,我们观察到肝脏LSK细胞和LMS细胞均可分化为成熟的淋巴细胞和髓系细胞。与骨髓来源的造血干细胞相比,肝脏LSK细胞和LMS细胞更倾向于分化为T淋巴细胞。我们进一步探讨了肝脏微环境中促进肝脏造血和T淋巴细胞分化的因素。一方面,我们发现肝脏固有巨噬细胞Kupffer细胞可以促进成年肝脏LSK细胞向淋巴细胞和髓系细胞分化,且以T淋巴细胞和B淋巴细胞分化为主。通过共培养实验证实,阻断Kupffer细胞上的细胞间粘附分子-1（ICAM-1）,可降低LSK细胞的黏附、增殖和分化。这些结果提示Kupffer细胞在维持和促进成年小鼠肝脏造血方面具有重要作用。另一方面,我们进一步证实了成年肝脏造血干细胞具有一群不同于骨髓的具有造血功能的LMS细胞。肝窦内皮细胞作为肝脏造血微环境的重要组成部分,可以通过Notch信号促进肝脏LMS细胞的分化,且以T淋巴细胞分化占优势。这些发现为了解肝脏髓外造血及其意义提供了重要的见解,为肝脏驻留免疫细胞的发育分化及肝脏疾病{如肝炎、非酒精性脂肪肝（NAFLD）和肝细胞癌（HCC）}的治疗等提供了一定的启示。研究方法:1.通过流式细胞术检测并比较了不同器官中肝脏造血干祖细胞（LSK和LMS）的比例。2.通过甲基纤维素半固体培养实验分析了肝脏造血干祖细胞的集落形成能力。3.采用多色流式细胞术分选肝脏或骨髓的造血干祖细胞,将CD45.2+小鼠的肝脏或骨髓造血干祖细胞与CD45.1+小鼠的骨髓单个核细胞混合,通过尾静脉注射到致死量照射的CD45.1+的小鼠体内,在不同时间点检测受者小鼠外周血中CD45.2+细胞、淋巴细胞及髓系细胞的比例,以确定成年肝脏造血干祖细胞的造血重建能力。4.通过LPS诱导的小鼠髓外造血模型来促进成年肝脏造血。5.采用氯磷酸二钠脂质体清除巨噬细胞和Kupffer细胞,观察清除Kupffer细胞之后对肝脏髓外造血的影响。6.通过ELISA方法检测Kupffer细胞分泌的造血生长因子及促炎因子的表达水平。7.采用共培养实验和流式细胞术在不同时间点检测肝脏造血干祖细胞向淋巴细胞和髓系细胞分化的情况。8.通过流式细胞术检测Kupffer细胞上ICAM-1和VCAM-1表达的变化及其相应配体LFA-1和VLA-4在肝脏LSK上表达的情况。9.在Kupffer细胞与LSK细胞共培养体系中加入ICAM-1阻断抗体,采用流式细胞术检测共培养体系中分化的淋巴细胞和髓系细胞的比例。10.通过实时荧光定量PCR检测了肝脏微环境造血调节因子及肝窦内皮细胞上Notch配体基因水平的表达情况。11.通过流式细胞术检测肝脏LMS细胞上Notch受体Notchl及Notch2的表达情况。12.通过流式细胞术检测了共培养体系中LMS细胞上Notch的活化形式NICD的表达情况。13.在肝窦内皮细胞和LMS细胞共培养体系中加入Notch信号抑制剂,通过流式细胞术观察肝脏LMS向淋巴细胞分化的情况。实验结果:1 Kupffer细胞促进肝脏造血机制研究1.1成年肝脏中含有造血干祖细胞通过流式细胞术检测并比较了不同发育阶段小鼠肝脏和骨髓中LSK细胞的比例。观察到成年肝脏中仍存在少量的LSK细胞。利用甲基纤维素半固体培养实验,发现虽然肝脏LSK细胞形成GM-CFU和M-CFU集落的数量明显低于骨髓,但是成年肝脏LSK细胞仍具有形成GM-CFU和M-CFU集落的能力。提示成年肝脏中存在具有造血功能的造血干祖细胞。1.2成年肝脏LSK细胞能够生成淋巴系和髓系细胞利用造血移植实验,观察到肝脏来源的LSK细胞能够重建致死量照射小鼠的淋巴细胞和髓系细胞,但是肝脏来源的LSK细胞的造血重建能力明显弱于骨髓。与骨髓相比,来源于肝脏的LSK细胞优先分化为T淋巴细胞,骨髓来源的LSK细胞主要以生成B淋巴细胞为主,产生较少的T淋巴细胞。并且发现肝脏来源的LSK细胞,主要是在肝脏中进一步分化为淋巴细胞和髓系细胞,却很少迁移到骨髓。然而,骨髓来源的LSK细胞可以同时迁移到骨髓和肝脏。1.3 Kupffer细胞促进LPS诱导的肝脏髓外造血连续3天给小鼠腹腔注射LPS建立髓外造血模型。采用流式细胞术检测肝脏中LSK细胞和长期造血干细胞（LT-HSC）的数量。发现与对照组相比,LPS处理组小鼠肝脏中LSK和LT-HSC细胞的绝对数显着增加。这提示LPS可以诱导肝脏髓外造血。利用氯磷酸二钠脂质体清除Kupffer细胞可明显削弱LPS诱导的肝脏LSK细胞和LT-HSC的数量增加。这说明Kupffer细胞在LPS诱导的肝脏髓外造血中发挥重要作用。1.4 Kupffer细胞促进肝脏造血干祖细胞分化为淋巴细胞和髓系细胞通过Kupffer细胞与LSK细胞共培养实验,观察到当只有培养基和SCF细胞因子的存在时肝脏LSK细胞不能分化为淋巴细胞和髓系细胞,只有当共培养体系中有Kupffer细胞的存在时肝脏LSK细胞才能分化为淋巴细胞和髓系细胞,如果在共培养体系中同时加入LPS可增强Kupffer细胞的这种促分化作用。这就提示Kupffer细胞可以促进肝脏造血干祖细胞的分化。1.5 Kupffer细胞促进肝脏造血干祖细胞的增殖利用LPS诱导的肝脏髓外造血模型,观察到与PBS对照组相比,LPS处理组增加肝脏Ki-67+LSK细胞的比例,而清除Kupffer细胞显着降低了 LPS处理组肝脏Ki-67+LSK细胞的比例。说明Kupffer细胞可以促进肝脏造血干祖细胞的增殖。1.6 Kupffer细胞通过ICAM-1/LFA-1相互作用促进LPS诱导的肝脏造血和淋巴细胞分化利用LPS诱导的肝脏髓外造血模型,采用流式细胞术检测了 Kupffer细胞表面黏附分子的表达。发现与对照组相比,LPS处理组ICAM-1的表达显着增加,但VCAM-1的表达没有改变。进一步检测了肝脏LSK细胞上ICAM-1和VCAM-1的相应配体LFA-1和VLA-4的表达情况。发现LPS处理之后肝脏LSK细胞上LFA-1的表达显着升高,而VLA-1的表达没有变化。在Kupffer细胞与LSK细胞共培养体系中,用抗体阻断ICAM-1与LFA的相互作用,无论是造血干祖细胞（LSK细胞和谱系阴性细胞）,还是分化的CD3+T细胞和CD19+B细胞数量都有所下降。提示Kupffer细胞可以通过ICAM-1/LFA-1相互作用促进LPS诱导的肝脏造血和淋巴细胞分化。2肝窦内皮细胞促进肝脏造血的机制研究2.1成年肝脏存在一群不同于骨髓的LMS细胞采用流式细胞术检测了胎肝、成年肝脏、脾脏及骨髓中LMS细胞的比例,并通过造血移植实验验证了胎肝LMS细胞的造血重建能力,观察到胎肝中确实存在LMS细胞并且具有造血功能,成年肝脏也存在较高比例的LMS细胞。但是,在脾脏和骨髓中几乎检测不到LMS细胞。提示LMS细胞可能仅存在于胎肝和成年肝脏,成年肝脏存在的LMS细胞可能来源于胚胎肝脏,而非骨髓。2.2成年肝脏中LMS细胞来自于胎肝给致死量照射小鼠分别转输胎肝和骨髓单个核细胞,在转输后第4周检测CD45.2+受体小鼠肝脏中供体来源的（CD45.1+）LMS细胞的生成情况。发现胎肝来源的单个核细胞在转输后4周能够在受体鼠肝脏中重建LMS细胞,但是骨髓来源的单个核细胞不能进行重建。进一步检测转输胎肝单个核细胞后受体鼠各个器官中LMS细胞重建情况,我们发现胎肝单个核细胞只能在肝脏中重建LMS细胞,而在骨髓、脾脏、外周血中几乎检测不到。这提示成年肝脏LMS细胞是来源于胎肝,而不是骨髓。2.3成年肝脏LMS细胞能够向淋巴系和髓系细胞分化给致死量照射小鼠转输成年肝脏LMS细胞,4周后能够在受体鼠外周血中检测到供体来源的CD45.1+LMS细胞,并且一直持续到第7周。进一步在受体鼠的肝脏、脾脏及骨髓中都观察到供体来源的CD45.1+的细胞,并且在受体肝脏中检测到供体来源的细胞可以分化发育为淋巴系（CD3+T、CD19+B、NK1.1+NK细胞）及CD11b+髓系细胞,但主要以CD3+T细胞为主。这说明成年肝脏LMS细胞能够向淋巴细胞和髓系细胞分化。2.4肝窦内皮细胞促进肝脏LMS细胞分化成淋巴细胞及髓系细胞通过肝窦内皮细胞与LMS细胞共培养实验,观察到肝窦内皮细胞能够促进LMS细胞分化成CD3+T、CD19+B、+NK1.1NK淋巴细胞和CD11b+髓系细胞,并且主要以生成CD3+T细胞为主。提示肝窦内皮细胞对LMS细胞的分化具有促进作用。2.5肝窦内皮细胞通过Notch信号促进了 LMS细胞向T细胞的分化将肝窦内皮细胞（LSEC）单独或肝窦内皮细胞和LMS细胞共培养（LSEC+LMS）,比较肝窦内皮Notch配体Jag1、Jag2、DLL1和DLL4基因表达水平。发现单独培养组和共培养组中肝窦内皮细胞都表达Jag1、Jag2、DLL1和DLL4,LSEC+LMS组与LSEC组相比DLL1的表达有所升高,Jag1和DLL4的表达没有差异,Jag2表达有降低的趋势。这就暗示肝窦内皮细胞有可能是通过Notch信号来促进了 LMS细胞向CD3+T细胞的分化。进一步检测LMS细胞上Notch受体Notch 1及Notch2的表达情况,发现LMS细胞表达一定比例的Notch 1及Notch2。随后我们检测了肝窦内皮细胞和LMS细胞共培养中分化的淋巴细胞的比例。我们观察到Notch抑制剂LY411575处理组与对照组相比,共培养体系中造血祖细胞Lin-细胞比例下降,分化的CD3+T细胞的比例下降,而CD19+B细胞的比例升高。这些表明肝窦内皮细胞是通过Notch信号促进了 LMS细胞向T细胞的分化。结论及意义:1.成年肝脏中存在LSK细胞和肝脏特有的不同于骨髓的LMS细胞。2.肝脏LSK细胞和LMS细胞具有向淋巴细胞和髓系细胞分化的能力,且以向T淋巴细胞分化占优势。3.本研究首次发现,在LPS诱导的肝脏髓外造血模型中,Kupffer细胞对LSK细胞的增殖具有促进作用。Kupffer细胞能够促进LSK细胞向淋巴细胞和髓系细胞的分化,且以向T和B淋巴细胞分化为主,LPS可增强Kupffer细胞的这种促分化作用。Kupffer细胞通过ICAM-1/LFA-1的相互作用促进LSK细胞在肝脏的驻留、增殖和分化。4.肝窦内皮细胞可以促进LMS细胞向淋巴细胞和髓系细胞的分化,主要以向T淋巴细胞分化为主,肝窦内皮细胞通过Notch信号促进LMS细胞向T淋巴细胞的分化。
葛超荣[6]（2019）在《造血干细胞通过转分化为肺组织细胞促进肺辐射损伤修复》文中指出目的:本文旨在探究造血干细胞（Hematopoietic stem cell,HSC）是否在机体放射性肺损伤中具有转分化修复作用。方法:（1）检测HSC移植是否促进放射性肺损伤的组织学修复:将C57小鼠的HSC移植至60Co γ射线致死剂量9 Gy照射的CD45.1小鼠中,移植后4个月,取未照射对照组、单独照射组（辐照后7天）、辐照后移植组小鼠肺组织做HE染色切片,观察病理变化情况,以及HSC移植对于辐射引起的肺组织的损伤修复情况。（2）检测HSC移植是否减轻放射性肺部炎症反应:将C57小鼠的HSC移植至60Co γ射线致死剂量9 Gy照射的CD45.1小鼠中,移植后4个月,取未照射对照组、单独照射组（照射后7天）、辐照后移植组小鼠肺组织,用Q-PCR检测肺组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、IL-13等的相对表达含量。（3）流式细胞仪检测受体小鼠肺组织细胞中供体来源细胞的比例:将雄性RosamT/mG小鼠的HSC移植至60Co γ射线致死剂量9 Gy照射的雌性CD45.1小鼠中,移植4个月后,取各组小鼠心、肝、肺、肾、小肠等组织,胶原蛋白酶/DNA酶消化为单细胞后,运用流式细胞仪检测各组小鼠组织细胞中供体来源细胞（红色荧光表达细胞）的比例。在排除其他类型细胞如造血类细胞、肺巨噬细胞、巨核细胞等可能引起假阳性结果的因素后,再次检测各组小鼠组织细胞中供体来源细胞的比例以及受体肺组织特异性细胞中供体来源细胞的比例。（4）PCR检测受体小鼠肺组织细胞中是否表达供体来源Y染色体上特异性基因Ddx3y:将雄性RosamT/mG小鼠的HSC移植至60Co γ射线致死剂量9 Gy照射的雌性CD45.1小鼠中,移植4个月后,分选受体肺组织上皮细胞、内皮细胞、除上皮、内皮细胞以外的细胞,提取DNA,PCR检测是否表达Ddx3y。（5）共聚焦及成像流式检测供体来源细胞和受体肺组织细胞的共表达情况:将雄性RosamT/mG小鼠的HSC移植至60Co γ射线致死剂量9 Gy照射的雌性CD45.1小鼠中,移植4个月后,运用共聚焦显微镜与成像流式细胞仪检测受体鼠肺组织中供体来源细胞的红色荧光与肺上皮细胞特异性标记物（包括Pan-keratin、T1-α、SP-C等肺上皮细胞特异性标记物）标记的蛋白共表达情况。结果:（1）移植HSC可挽救致死剂量照射小鼠的生命,辐照不移植组小鼠于辐照后8-12天左右死亡,而移植组小鼠3个月存活率达90%以上,并可长期存活。9 Gyγ射线照射的小鼠在辐射后7天的病理切片显示放射性肺炎表征,包括:肺泡腔变小、肺泡间隔增厚、炎症细胞浸润、支气管上皮细胞结构破坏和出血现象等。移植HSC可以减轻辐射所致的肺部炎症反应,大部分肺组织恢复正常,无出血,无炎症细胞浸润现象。（2）移植HSC可减轻致死剂量γ射线照射后小鼠肺部产生的炎症反应,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、IL-13表达水平与单独辐射组相比,在移植HSC后大幅度下降,炎症反应得到了缓解。（3）RosamT/mG小鼠的HSC移植至致死剂量照射的CD45.1小鼠4个月后,受体小鼠中,检测辐照移植组小鼠各个脏器中红色荧光（代表供体来源细胞）的比例发现,肺组织细胞中红色荧光细胞的比例最高（骨髓除外）,达22.79%左右。在排除其他类型细胞如造血类细胞、肺巨噬细胞、巨核细胞等可能引起假阳性结果的因素后,辐射移植组小鼠的肺细胞中红色荧光细胞的比例较其他组织相比依然最高,为3.37%左右,且在肺泡Ⅰ型、Ⅱ型细胞中检测到供体来源细胞。（4）移植HSC后,受体鼠肺组织上皮细胞、内皮细胞、除上皮、内皮细胞以外的细胞中表达供体来源的Y染色体上特异性基因Ddx3y。（5）共聚焦与成像流式细胞仪检测到受体鼠肺组织中肺上皮细胞特异性标记物（Pan-keratin、T1-α、SP-C）标记的蛋白与供体来源细胞红色荧光发生共表达。结论:（1）造血干细胞移植促进放射性肺损伤修复。（2）造血干细胞一定程度上通过转分化为肺组织细胞促进肺辐射损伤修复。
张嘉宁[7]（2018）在《多谱学联合分析在干细胞救治暴发性肝衰竭中的应用》文中进行了进一步梳理随着各类高通量分子谱学检测技术的日益成熟,多谱学联合分析的方法逐渐走进了越来越多研究者的视野。多谱学联合分析为复杂疾病的深入研究以及精准医学的推广普及提供了新线索和新思路。干细胞移植在多种高致死率疾病的临床治疗上具有良好的应用前景,然而我们对干细胞协助器官修复的具体应用机制仍知之甚少。暴发性肝衰竭是一类进展极快,死亡率极高的疾病。目前,原位肝移植是唯一有效的临床治疗手段。之前我们的合作实验室已建立了 D-半乳糖胺（D-Galactose,D-Gal）诱导的猪肝损模型,即暴发性肝衰竭（fulminanthepatic failure,FHF）大动物模型,并发现在疾病造模的同时,异种移植人源骨髓间充质干细胞能显着降低疾病猪模型的死亡率。本研究对干细胞救治暴发性肝衰竭猪的过程中所采集的多类分子谱学数据进行了定量和整合分析,并利用这些数据从各个生物学角度对干细胞在救治暴肝猪过程中所起到的类药物治疗的作用进行了描述。本研究首先明确了干细胞救治暴发性肝衰竭过程中干细胞的作用时间窗。本研究发现,干细胞移植组和暴肝对照组血清中的肝功能相关指标均在造模3天后显着上升,不过3天时干细胞移植组肝功能指标的上升程度有所稀释,且移植组的指标在7天时回到基线水平。和肝功能指标变化趋势一致,本研究在造模3天后观测到模型猪体内由暴发性肝衰竭所引起的细胞因子风暴,该细胞因子风暴在干细胞移植7天后被压制,此时猪体内的代谢稳态平衡也得到恢复。此外,本研究还明确了干细胞在体内增殖,转分化和旁分泌作用在肝脏修复过程所起到的贡献。整合分析发现干细胞移植7天后基本完成在体内的增殖和转分化,其中转分化的干细胞约占猪整体肝细胞总量的4.5%。本研究进一步对干细胞移植组和暴肝对照组的细胞因子风暴组分进行分析,发现两个实验组在该过程中对暴肝环境进行响应的细胞因子完全不同,表明干细胞在肝脏恢复过程中逆转了机体对暴肝的响应。最后,本研究对干细胞救治暴肝过程中协同表达的基因进行了功能分析,发现在干细胞介导的肝脏修复过程中Notch通路被激活。对D-Gal诱导的暴发性肝衰竭猪模型和大鼠模型仅注射Notch配体DLL4,不进行任何其它治疗,生存分析结果均显示模型生存率得到改善（猪,P = 0.0240;大鼠,P= 0.0453）。这一结果表明DLL4具有较高临床转化潜力。综上,本研究概括了干细胞的治疗时间窗以及干细胞转分化和旁分泌功能在救治器官急性损伤过程中的作用,为干细胞的临床转化应用提供基础。本研究从干细胞和宿主器官互作过程中分离出了 一条复杂的信号通路,揭示干细胞介导的DLL4-NOTCH激活促进了宿主肝脏的修复过程,为探索干细胞在其它情境下的作用机制提供了启发。
陈政[8]（2016）在《人生殖干细胞转分化为成熟肝细胞及其信号转导研究》文中进行了进一步梳理目的:肝细胞移植是遗传性和终末期肝脏疾病的有效治疗方法。但是,原代人类肝细胞来源匮乏、体外难于长期培养和保持功能等问题限制了其临床广泛应用。当前,胚胎干细胞（ES cells）、诱导多能干细胞（iPS cells）和间充质干细胞（MSCs）都能够诱导生成肝细胞。但是,伴随的一些问题限制了它们的临床实际应用,如:伦理学争议、致瘤性、病毒转入的安全性等。因此,寻找更理想、切实可用的肝细胞来源成为当前一个研究热点和迫切需要解决的科学问题。精原干细胞（SSCs）是睾丸内的一种成体干细胞,一旦离开睾丸生精微环境,精原干细胞就能够获得多能性,去分化生成类胚胎干细胞并相继分化为三胚层组织的各种细胞。小鼠精原干细胞在体外能够诱导转分化为成熟肝细胞,显示出其良好的潜在应用前景。然而,人精原干细胞尚没有相关的研究报道。由于人类和小鼠的精原干细胞具有明显的种系差异、细胞类型与生化表型,因此,本论文研究人精原干细胞在体外和体内诱导生成有功能的成熟肝细胞,为肝细胞移植治疗肝脏疾病提供新的细胞来源,并探讨人精原干细胞转分化为成熟肝细胞的信号转导机制。方法:首先采用两步酶消化、差速贴壁与免疫磁珠分选法（MACS）分离获得高纯度和活力的人精原干细胞。然后用添加生长因子和激素的条件培养基模拟体内胎肝发育的微环境体外诱导精原干细胞的转分化。在不同的转分化节点通过RT-PCR、免疫细胞化学和流式细胞术等方法进行其表型鉴定;然后,在功能水平上检测诱导生成的肝细胞是否具有与原代肝细胞相似的功能,包括白蛋白分泌、尿素合成、吲哚菁绿吞噬及排泄。并且,我们探讨β-CATENIN信号分子及相关转录因子是否参与了人精原干细胞转分化为成熟肝细胞。在体外实验结果基础上,我们再将诱导分化转向体内。用四氯化碳（CCl4）构建小鼠肝损伤模型,提供向肝转分化内环境;然后,用肝脏间质细胞提供向肝转分化的微环境（Niche）,人精原干细胞与小鼠肝脏间质细胞通过肾包膜移植,对转分化的细胞进行生化表型鉴定,并评估人精原干细胞移植对受体小鼠重要组织器官的安全性。结果:体外诱导转分化:我们运用MACS分离的细胞表达人类精原干细胞多种特异基因和蛋白标记,如:UCHL1、PLZF、GPR125和MAGEA4等,表明这些细胞在生化表型上为人精原干细胞。第一阶段经过约10天的条件培养基诱导培养,人精原干细胞逐渐失去原有精原干细胞的基因与蛋白的表达,在形态学上变为卵圆形,类似人肝干细胞形态;在转录和翻译水平检测到肝干细胞特异的基因和蛋白表达,包括CK7、CK19、CK8和CK18;流式细胞术发现80%的细胞共表达CK18和CK19;未检测到ES细胞标记物,如TRA1-60、SSEA3和TRA1-81的表达。结果表明,人精原干细胞未去分化生成类胚胎肝细胞,而是直接转分化为肝干细胞。我们进一步用条件培养基诱导肝干细胞向肝细胞分化。分化的细胞持续表达肝细胞特异性基因和蛋白标记,如ALB、AFP、CK18等,逐渐失去胆管细胞标记的表达,如CK19和CK7,显示肝干细胞特异分化为肝细胞,而不是胆上皮细胞。然后,运用HGF、OSM和Dex诱导肝细胞成熟,这些细胞表达CYP1A2、ALB和AAT等,同时具有原代肝细胞相似的功能,包括:白蛋白分泌、尿素合成和ICG吞噬及排泄。上述结果提示,人精原干细胞能在体外转分化为具有形态特征、生化表型和有功能的成熟肝细胞。在分子机制方面,我们发现,β-CATENIN/HNF4A/FOXA1/GATA4信号通路参与了人精原干细胞转分化为成熟肝细胞过程。体内诱导转分化:CCl4能有效地建立小鼠肝损伤模型。RT-PCR显示,分离的小鼠枯否细胞表达Desmin、Emr、v-wf和Acta2;免疫细胞化学检测肝星状细胞表达VIMENTIN和窦内皮细胞表达V-WF;以上结果表明,分离的细胞为小鼠肝脏间质细胞。GFP标记的人类精原干细胞系与小鼠肝脏间质细胞移植到肾包膜4周后,移植细胞生长良好,检测到自发绿色荧光的细胞同时表达肝细胞特异标记蛋白,包括:CK18、ALB、CYP1A2和AAT,同时,未检测到精原干细胞标记物GPR125和VASA的表达。Western blot也检测到ALB、AAT、CYP1A2、AFP、PCNA等蛋白的表达,未检测到GPR125蛋白表达;并且,精原干细胞的移植对受体小鼠重要组织器官,包括心、肾、脑、脾等,未检出明显病变。以上结果显示,人精原干细胞在体内转分化为肝细胞,并具有良好的安全性,具有广泛临床应用前景。结论:我们首次将人精原干细胞体外和体内诱导转分化为生化表型与有功能的成熟肝细胞,为肝细胞移植治疗肝脏疾病和药物筛选提供新的细胞来源;同时,我们揭示β-CATENIN/HNF4A/FOXA1/GATA4通路参与了转分化过程,为肝脏发育和精原干细胞的重编程提供新的分子机制。
刘建[9]（2014）在《骨髓源性侧群细胞的体外增殖及其向肝样细胞分化的实验研究》文中研究表明目的1．通过观察BMSP在体外培养条件下能否保持侧群细胞的特性，以探讨BMSP在体外扩增的可能性。2．观察在HGF定向诱导下大鼠BMSP转分化的情况，初步探讨HGF在大鼠BMSP转分化为肝样细胞中发挥的作用及机制。方法1．从大鼠的股骨和胫腓骨分离骨髓细胞并制备骨髓细胞悬液，通过流式细胞仪分选获取BMSP；用低糖DMEM﹢10％胎牛血清培养基培养BMSP。采用RT-PCR检测细胞中ABCG-2基因表达水平。2．在体外向BMSP中加入不同浓度的HGF诱导其向肝样细胞分化，并分别于第3、7、14、21天，通过RT-PCR、免疫印迹法等技术检测AFP、ALB等细胞表面标志物的表达情况。结果1．每只SD大鼠的双侧股骨和胫腓骨所制备的骨髓细胞悬液的细胞总数约2-10×108个，经分选可获得5-10×105个BMSP。2．BMSP在体外培养6小时后开始贴壁生长，细胞形态以长梭形为主。随着培养时间的延长,细胞生长曲线显示第7天细胞数量最多，以后进入平台期。第7天细胞按1:2传代培养，传代后细胞于24小时内完全贴壁，细胞传至第10代时，细胞增殖能力仍然很强。3．诱导分化实验表明：一定浓度的HGF具有明显的促进BMSP转分化为肝样细胞。RT-PCR检测显示：培养第3天的BMSP空白组及因子组未见AFP、ALB mRNA表达；AFP mRNA在第7天的因子组表达、ALB mRNA在因子组则不表达，空白组AFP、ALB mRNA均未表达；AFP mRNA在第14天的因子组表达减弱、ALB mRNA在第14天的因子组表达，空白组AFP、ALB mRNA均未表达；第21天因子组见AFP mRNA不表达、ALB mRNA表达减弱，空白组AFP、ALB mRNA均未表达。因子组与对照组相比有显着性差异，P0.05，有统计学意义。结论1．通过流式细胞仪分选获得BMSP在一定时间内可以在体外扩增并保持干细胞的特性，且传代的BMSP仍具有很强的自我更新和增殖能力。2．扩增的BMSP在HGF的诱导下可以逐渐向肝样细胞分化。
袁淑芳[10]（2013）在《骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性肝衰竭的作用研究》文中进行了进一步梳理目的：（1）对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行体外培养、鉴定。（2）对D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导的急性肝衰竭（ALF）大鼠给予尾静脉、门静脉二种途径注射同种异体移植大鼠BMSCs,探讨BMSCs移植治疗ALF的可能性、对比两种移植途径的疗效。（3）通过测定各组血清及肝组织中细胞因子的表达,探讨BMSCs移植治疗ALF的机制、了解BMSCs在肝内归巢的影响因素、探讨BMSCs移植对ALF血清和肝组织中细胞因子表达及肝细胞凋亡的影响及机制,为临床开展BMSCs移植治疗ALF、为临床提供可靠的ALF预后评估系统、实时准确地评价ALF的免疫状态、病情及预后并指导临床治疗提供依据。方法：（1）采用全骨髓贴壁法分离大鼠BMSCs,进行体外培养。采用DAPI标记BMSCs、细胞免疫荧光、流式细胞术进行BMSCs表型鉴定。（2）采用10%D-氨基半乳糖1-4g/kg/次、12小时一次和0.005%脂多糖20μg/kg,经腹腔注射制备大鼠ALF模型,观察造模后大鼠肝功能、肝组织病理损害程度。（3）通过尾静脉和门静脉注射的方式移植BMSCS。66只大鼠随机平均分为对照组、尾静脉移植、门静脉组。各途径组同种异体移植BMSCs,移植BMSCs数量为1.4×107个/kg,对照组给予等体积生理盐水腹腔注射。于移植后24h、72h、120h、168h收集血液样本和肝组织标本。检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）,比较BMSCs移植前后各组肝功能的改善情况。（4）用HE染色观察肝脏的病理学变化。用TUNEL法检测肝细胞凋亡。采用ELISA、RT-PCR方法测定各组血清及肝组织内CD163、IL-10的水平。用原位杂交、Western blot方法检测肝组织基质细胞衍化生长因子-1α （SDF-1α）蛋白的表达水平；用免疫荧光组织化学法、RT-PCR方法检测肝组织血管内皮生长因子VEGF蛋白的表达；采用免疫组化、Western blot方法检测肝组织Caspase-1、IL-18蛋白的表达水平。结果：（1）原代培养的大鼠BMSCs传代后,高表达CD29和CD90,不表达CDllb和CD45。用DAPI进行BMSCs标记,荧光显微镜下观察可见所有BMSCs均已标上蓝色荧光。（2）采用了D-氨基半乳糖模型（D-Gal）/脂多糖（LPS）诱导的大鼠ALF模型。模型建立后,组织HE染色出现典型急性肝损伤表现,肝衰竭对照组大鼠血清ALT. AST水平和肝细胞凋亡较BMSCs移植组明显升高,且有时间依赖性,这些结果支持了建模成功。（3）ALF对照组大鼠血清ALT、AST水平随病程逐渐升高,在移植后120h、168h,尾静脉、门静脉组移植组血清ALT、AST水平与对照组的差别均有统计学意义（P<0.01）,尾静脉与门静脉移植组之间血清ALT, AST水平的差别无统计学意义（P>0.05）。（4）BMSCs移植后168h,尾静脉与门静脉移植组大鼠肝组织均可见大量DAPI阳性标记的细胞,ALF模型对照组未见DAPIP日性标记的细胞。（5） BMSCs移植后120h、168h,尾静脉移植组、门静脉移植组的炎性细胞浸润明显减少,肝小叶结构逐渐恢复,汇管区可见胆管增生。尾静脉组移植组、门静脉移植组肝组织炎症改善情况与对照组相比有统计学意义（P<0.05）。尾静脉组移植组、门静脉移植组肝组织炎症改善情况的差别无统计学意义（P>0.05）。（6）在移植后120h、168h,与对照组相比BMSCs移植组肝细胞凋亡明显减轻（P<0.05）。BMSCs移植后120h尾静脉组、门静脉组细胞凋亡指数分别为22.00±16.84%、20.60±7.60%；移植后168h细胞凋亡指数分别为18.33±8.78%、12.67±8.78%,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。尾静脉和门静脉植组之间肝细胞凋亡改善情况无统计学差异（P>0.05）。（7）原位杂交、免疫荧光、Western blot结果显示：BMSCs移植组中SDF-1α、VEGF蛋白的表达水平随肝功能的好转逐渐逐渐升高,在移植后120h、168h与对照组相比有显着性差异（P<0.05）。尾静脉和门静脉植组之间肝组织SDF-1α、VEGF蛋白的表达水平无统计学差异（P>0.05）。相关分析发现肝组织中SDF-1α、VEGF两者表达水平呈正相关（P<0.05）。肝组织中SDF-1α、 VEGF蛋白的表达与肝细胞凋亡之间存在负相关,相关系数分别0.293、-0.274（P<0.05）。（8） ELISA及RT-PCR结果显示：ALF对照组大鼠血清及肝组织中CD163、IL-10的水平随时间的延长、肝功能的恶化而升高。BMSCs移植组血清及肝组织中CD163、IL-10的水平随肝功能的好转逐渐降低,在移植后120h、168h与实验组相比有显着差异（P<0.01）。门静脉与尾静脉移植组血清及肝组织中CD163、IL-10的水平之间的差别无统计学意义（P>0.05）。相关分析发现血清及肝组织中CD163、IL-10两者表达水平呈正相关（P<0.05）。CD163IL-10与ALT、AST之间均有明显的相关性（P<0.01）。（9）大鼠肝组织中Caspase-1、IL-18蛋白及蛋白的表达趋势一致,BMSCs移植后大鼠肝组织中Caspase-1和IL-18水平明显下降,在移植后120h、68h、BMSCs移植组中Caspase-1、IL-18蛋白的表达水平与对照组相比有显着差异（P<0.05）。门静脉组与尾静脉移植组之间Caspase-1、IL-18蛋白的表达差别无统计学意义（P>0.05）。尾静脉和门静脉植组之间Caspase-1、IL-18蛋白的表达无统计学差异（P>0.05）。相关分析发现Caspase-1、IL-18两者呈正相关（P<0.05）; Caspase-1、IL-18肝细胞凋亡之间均有明显的相关性（P<0.01）。结论：（1）采用全骨髓贴壁筛选法可以成功分离培养、扩增出高纯度大鼠BMSCs,并保持其原有的生物学特性。DAPI可成功标记BMSCs。（2）采用10%D-Gall.4g/kg/次,间隔12小时,共两次。联合0.005%LPS （10mg/支）20μg/kg、腹腔注射可成功建立大鼠ALF模型。该方法可靠、可重复性强、模型形成稳定、大鼠生存期较长,能满足本研究的需要。（3） BMSCs尾静脉、门静脉移植后,BMSCs可以归巢到ALF大鼠肝脏。（4） BMSCs移植能够促进ALF大鼠肝功能的恢复,减轻肝脏组织炎症坏死程度,BMSCs对ALF大鼠具有一定治疗作用。（5）尾静脉移植、门静脉移植途径均能有效改善ALF大鼠的肝功能、减轻肝脏病理损害程度。但二种途径相比差异无统计学意义。（6） BMSCs移植可减少ALF肝脏免疫炎症反应,抑制肝细胞凋亡。（7） BMSCs可以特异归巢至损伤肝脏,促进VEGF的分泌、并促进肝细胞增殖及肝脏血管再生、促进肝脏组织修复。（8） CD163. IL-10水平随肝组织炎症程度改善而下降,反映了肝功能的急剧恶化和疾病严重程度。BMSCs移植能降低CD163、IL-10水平,调节促炎与抗炎因子达到新的平衡。CD163、IL-10可作为早期评估患者肝移植预后观察的敏感血清标志蛋白的指标。（9）Caspase-1和IL-18在肝衰竭、肝细胞凋亡的发病过程中起重要作用。BMSCs移植能降低Caspase-1、IL-18水平。Caspase-1和IL-18可望成为急性肝衰竭的预测因子和未来的治疗靶点。
二、造血干细胞转分化肝组织细胞的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、造血干细胞转分化肝组织细胞的研究进展（论文提纲范文）
（1）小鼠Kupffer细胞的转分化研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写词对照表 |
| 前言 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝脏概述 |
| 1.2 肝脏纤维化 |
| 1.2.1 肝细胞的死亡与凋亡 |
| 1.2.2 肝纤维化发展 |
| 1.2.3 肝纤维化中肌成纤维细胞的组成 |
| 1.3 KCs在肝脏学中的研究进展 |
| 1.3.1 KCs的起源 |
| 1.3.2 KCs在肝脏结构中的定位 |
| 1.3.3 KCs的免疫作用 |
| 1.3.4 KCs的异质性 |
| 1.3.5 KCs的可塑性 |
| 1.3.6 KCs与肝脏疾病 |
| 1.4 细胞谱系追踪技术 |
| 1.4.1 细胞谱系追踪技术的基本原理 |
| 1.4.2 细胞谱系追踪的标记方法 |
| 1.4.3 细胞谱系追踪在肝脏研究中的应用 |
| 1.4.4 细胞谱系追踪的未来 |
| 1.6 细胞的转分化 |
| 1.6.1 细胞转分化概述 |
| 1.6.2 自然发生的转分化 |
| 1.6.3 实验性转分化 |
| 1.6.4 肝脏中的转分化 |
| 1.6.5 转分化应用于再生医学的优点和局限性 |
| 第2章 KCs在体外非实质细胞培养过程中的形态和表型变化研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 2.2.4 主要实验试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 非实质细胞分离 |
| 2.3.2 收集培养的非实质细胞 |
| 2.3.3 多聚体免疫共沉淀 |
| 2.3.4 RNA提取 |
| 2.3.5 基因表达分析 |
| 2.3.6 免疫荧光成像 |
| 2.3.7 统计学方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 精密肝切片培养实验过程中,KCs特征性基因表达下调 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 3.2.4 主要实验试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 在精密肝切片培养和体外非实质细胞培养实验中,KCs中纤维化相关基因表达分析研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 KCs在培养过程中转录因子基因表达研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 KCs与肝片中胶原沉积的初步探索研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 实验试剂 |
| 6.1.3 主要实验耗材与设备 |
| 6.1.4 主要实验试剂配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 KCs耗竭 |
| 6.2.2 肝片培养、基因分析等方法同前所述 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 本实验创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）“补肾化瘀法”基于SDF-1/CXCR4轴促进骨髓间充质干细胞移植治疗肝硬化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 临床观察 |
| 1 资料及方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.2.1 西医诊断标准 |
| 1.2.2 中医诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 病例剔除(脱落标准) |
| 1.6 病例终止标准 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 资料与方法 |
| 2.1.1 病例分组 |
| 2.1.2 治疗方案 |
| 2.2 观察指标 |
| 2.2.1 中医证候积分 |
| 2.2.2 实验室检测指标 |
| 2.2.3 影像学检查指标 |
| 2.2.4 安全性评估指标 |
| 2.3 临床疗效评价标准 |
| 2.3.1 总体疗效评价标准 |
| 2.3.2 安全性评价标准 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 一般资料 |
| 3.2 中医证候评分变化 |
| 3.3 两组治疗前后肝功能比较 |
| 3.4 两组治疗前后肝纤四项水平对比 |
| 3.5 两组治疗前后HBV-DNA阴转率对比情况 |
| 3.6 两组治疗前后肝脏硬度值、门静脉主干内径、脾脏厚度值变化 |
| 3.7 治疗后临床疗效评价 |
| 3.8 安全性评价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 西医对肝硬化的认识 |
| 4.2 中医对肝硬化的认识 |
| 4.3 补肾化瘀法治疗肝硬化 |
| 4.4 研究结果分析 |
| 4.4.1 总体疗效 |
| 4.4.2 中医证候积分 |
| 4.4.3 肝功能指标的影响 |
| 4.4.4 对肝纤四项、LSM的影响 |
| 4.4.5 对HBV-DNA的影响 |
| 4.4.6 肝脾超声指标的影响 |
| 4.4.7 安全性分析 |
| 5 问题与展望 |
| 6 结论 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 研究方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 肝硬化造模 |
| 1.3 实验分组 |
| 1.4 实验用药 |
| 1.5 BMSCs的分离、培养及标记 |
| 1.6 细胞移植与药物干预 |
| 1.7 标本采集 |
| 2 实验试剂与仪器 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 3 观测指标及方法 |
| 4 统计学方法 |
| 5 实验结果 |
| 5.1 镜下观察BMSCs的形态 |
| 5.2 大鼠一般情况 |
| 5.3 大鼠肝组织HE染色情况 |
| 5.4 各组大鼠肝功能比较 |
| 5.5 肝纤四项比较 |
| 5.6 大鼠细胞因子G-CSF、HGF、SCF、IL-6 比较 |
| 5.7 大鼠肝组织SDF-l、CXCR4 蛋白表达 |
| 6 讨论 |
| 6.1 BMSCs在体内的循环机制 |
| 6.2 补肾化瘀法与干细胞 |
| 6.3 补肾化瘀中药与骨髓间充质干细胞研究 |
| 6.4 骨髓间充质干细胞归巢的分子机制 |
| 6.5 补肾化瘀法联合BMSCs移植对肝硬化的影响 |
| 6.6 问题与展望 |
| 7 结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表或索引 |
| 综述 干细胞移植治疗肝硬化的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（3）hucMSCs来源的外泌体促进大鼠肝切除术后肝再生的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照缩略表 |
| 前言 |
| 一、研究意义 |
| 二、国内外研究现状分析 |
| 三、MSC-Exo在肝再生研究中的优势与不足 |
| 四、本研究拟解决的科学问题 |
| 第一章 hucMSCs的培养及其来源的外泌体的分离鉴定 |
| 引言 |
| 1.1 实验材料和器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 hucMSCs来源的外泌体促进大鼠肝脏切除术后肝再生及减轻肝脏缺血再灌注损伤的实验研究 |
| 引言 |
| 2.1 实验动物、试剂与耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 hucMSCs通过递送miR-124促进大鼠肝再生的作用及机制研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论及展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附表一 组织标本(外泌体干预组/对照组)miRNA微阵列结果 |
| 附表二 miRDB、DIANA tools、TargetScan 三个在线工具预测miR-124的潜在靶点结果 |
| 附表三 本研究中所使用的引物列表 |
| 综述 MSC-EVs在肝脏相关领域中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）Hoxb5转分化来源的T细胞抗肿瘤及Hoxb5调控多能造血祖细胞功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 过表达Hoxb5将小鼠B细胞转分化为肿瘤特异性T细胞的研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 肿瘤治疗方法的研究进展 |
| 1.1.2 治疗性免疫细胞来源的研究进展 |
| 1.2 实验材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 流式细胞分析分选所用单染补偿细胞制备 |
| 1.2.3 流式方法鉴定小鼠基因型 |
| 1.2.4 病毒包装实验 |
| 1.2.5 Pro-pre-B分离培养实验 |
| 1.2.6 Pro-pre-B感染Hoxb5逆转录病毒实验 |
| 1.2.7 Pro-pre-B移植实验 |
| 1.2.8 受体鼠分析实验 |
| 1.2.9 BCR重链重排实验 |
| 1.2.10 OT1-iT体外功能验证 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 分离OT1小鼠的pro-pre-B细胞感染Hoxb5逆转录病毒 |
| 1.3.2 表达Hoxb5的OT1 pro-pre-B可以转分化为OT1-iT |
| 1.3.3 OT1-iT体外杀伤表达OVA抗原的黑色素瘤细胞(B16F10-OVA) |
| 1.3.4 OT1-iT细胞体内抗肿瘤功能评估 |
| 1.3.5 OT1-Hoxb5逆转录病毒将pro-pre-B转分化为OT1-iT细胞 |
| 1.4 结果与讨论 |
| 第二章 转录因子Hoxb5在多能造血祖细胞(MPP)中的功能研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 维持机体长期造血功能的研究进展 |
| 2.1.2 造血干细胞(HSC)的研究进展 |
| 2.1.3 多能造血祖细胞(MPP)的研究进展 |
| 2.1.4 转录因子Hoxb5的研究进展 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 PCR方法鉴定小鼠基因型 |
| 2.2.3 流式细胞分析分选所用单染补偿细胞制备 |
| 2.2.4 qPCR方法鉴定Hoxb5~(LSL/+) Mx-1cre鼠中Hoxb5的表达 |
| 2.2.5 移植实验(一次/二次/三次移植) |
| 2.2.6 检测小鼠外周血,脾脏,骨髓中的供体细胞状态 |
| 2.2.7 受体鼠中供体祖细胞分析(Mac1~+CD48~+SK,CLP,MP) |
| 2.2.8 CD48~+Mac1~+SK细胞的RNA-seq |
| 2.2.9 脐血来源的MPP感染HOXB5的移植实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 在MPP中过表达Hoxb5后获得了长期造血的功能 |
| 2.3.2 在MPP中过表达Hoxb5后产生了Mac1~+CD48~+SK的细胞类型 |
| 2.3.3 Mac1~+CD48~+SK细胞能够支持长期造血 |
| 2.3.4 Mac1~+CD48~+SK细胞的转录组分析显示出细胞增殖的特点 |
| 2.3.5 人的脐带血来源的MPP过表达HOXB5后在B-NDG鼠中没有产生长期造血现象 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（5）Kupffer细胞和肝窦内皮细胞促进肝脏造血及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 第一部分: 造血干细胞及其造血微环境的研究进展(文献综述) |
| 1 造血干细胞定义 |
| 2 造血干细胞起源与发育 |
| 3 造血干细胞龛 |
| 3.1 成骨细胞 |
| 3.2 血管周围细胞 |
| 3.3 内皮细胞 |
| 3.4 巨噬细胞 |
| 3.5 脂肪细胞 |
| 3.6 巨核细胞 |
| 3.7 造血生长因子 |
| 3.8 造血调控的信号通路 |
| 4 髓外造血 |
| 4.1 髓外造血-脾脏 |
| 4.2 髓外造血-胎肝 |
| 4.3 髓外造血-成年肝脏 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分: Kupffer细胞促进肝脏造血及其机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料及试剂 |
| 1.2 相关试剂配制 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 成年肝脏中存在造血干祖细胞 |
| 2.2 成年肝脏中造血干祖细胞具有形成集落的能力 |
| 2.3 成年肝脏LSK细胞能够生成淋巴系和髓系细胞 |
| 2.4 Kupffer细胞促进LPS诱导的肝脏髓外造血 |
| 2.5 Kupffer细胞在体外可以促进肝脏造血干祖细胞分化为T和B淋巴细胞 |
| 2.6 Kupffer细胞促进肝脏造血干祖细胞的增殖 |
| 2.7 Kupffer细胞通过ICAM-1/LFA-1相互作用促进LPS诱导的肝脏造血和淋巴细胞分化 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分: 肝窦内皮细胞促进肝脏造血及其机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料及试剂 |
| 1.2 相关试剂配制 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 成年肝脏存在独特的lin~-mac-1~+sca-1~+细胞 |
| 2.2 成年肝脏LMS细胞来自于胎肝 |
| 2.3 成年肝脏LMS细胞能够生成淋巴系和髓系细胞 |
| 2.4 肝窦内皮细胞促进肝脏LMS细胞分化成淋巴细胞及髓系细胞 |
| 2.5 肝窦内皮细胞通过Notch信号促进了LMS细胞向T淋巴细胞的分化 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 论文创新点及意义 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读学位期间参加的学术会议及奖励 |
| 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
（6）造血干细胞通过转分化为肺组织细胞促进肺辐射损伤修复（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、材料 |
| 1、主要试剂 |
| 2、主要仪器 |
| 3、药物和试剂配制 |
| 4、实验所用动物 |
| 二、方法 |
| 1、小鼠全身~(60)Coγ射线致死剂量辐照 |
| 2、小鼠四肢骨全骨髓细胞的获取 |
| 3、小鼠脊椎骨全骨髓细胞的获取 |
| 4、小鼠骨髓单个核细胞的获取 |
| 5、小鼠骨髓造血干细胞分选 |
| 6、小鼠骨髓造血干细胞移植 |
| 7、小鼠基因型MTG鉴定 |
| 8、提取肺组织细胞基因组DNA并检测Y染色体上特异性基因Ddx3y |
| 9、小鼠肺组织提取RNA |
| 10、逆转录PCR |
| 11、小鼠肺组织细胞炎症因子检测 |
| 12、石蜡切片苏木素伊红(H&E)染色 |
| 13、小鼠各脏器细胞流式细胞术分析 |
| 14、小鼠肺组织冰冻切片免疫荧光染色 |
| 15、小鼠肺细胞成像流式 |
| 16、统计学分析 |
| 实验结果 |
| 一、移植造血干细胞可缓解致死剂量~(60)Co γ射线照射引起的小鼠肺损伤 |
| 二、移植造血干细胞可减轻致死剂量~(60)Coγ射线照射小鼠肺的炎症反应 |
| 三、移植造血干细胞后,受体小鼠肺组织细胞中检测出供体源细胞 |
| 四、移植造血干细胞后,受体小鼠肺组织中表达供体来源的Y染色体上特异性基因Ddx3y |
| 五、共聚焦与成像流式细胞仪检测出受体小鼠肺上皮细胞特异性蛋白与供体源细胞红色荧光共表达 |
| 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 综述: 造血干细胞转分化研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 附录 |
| 中英文缩略词汇表 |
| 致谢 |
（7）多谱学联合分析在干细胞救治暴发性肝衰竭中的应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写、术语表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 暴发性肝衰竭(Fulminant hepatic failure,FHF) |
| 1.1.1 临床病因 |
| 1.1.2 动物疾病模型 |
| 1.1.3 临床诊断及治疗手段 |
| 1.2 干细胞移植技术的应用 |
| 1.2.1 移植干细胞种类 |
| 1.2.2 间充质干细胞移植技术在器官修复中的应用 |
| 1.2.3 间充质干细胞移植技术在暴肝治疗中的应用 |
| 1.3 多谱学联合分析 |
| 1.3.1 多谱学联合分析在复杂疾病中的应用 |
| 1.4 本研究的主要内容及组织 |
| 2 干细胞治疗暴发性肝衰竭猪模型时间窗的确定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验模型的建立 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 人源骨髓间充质干细胞(hBMSCs)表型鉴定 |
| 2.4 生理水平治疗时间窗 |
| 2.5 分子水平治疗时间窗 |
| 2.5.1 生化指标变化监测 |
| 2.5.2 细胞因子丰度变化监测 |
| 2.5.3 代谢谱变化监测 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 干细胞在宿主体内转分化和旁分泌作用的评估 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 实验方法 |
| 3.1.2 生物信息学分析 |
| 3.2 转分化作用评估 |
| 3.3 旁分泌作用评估 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 多组学协同分析参与干细胞救治暴发性肝衰竭的生物途径 |
| 4.1 差异分子分析 |
| 4.2 基因集功能关联分析 |
| 4.3 候选基因筛选及验证 |
| 4.3.1 验证实验材料及方法 |
| 4.3.2 验证结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 结论和展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 讨论和展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（8）人生殖干细胞转分化为成熟肝细胞及其信号转导研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 绪论 |
| 第一章 人精原干细胞体外诱导转分化为成熟肝细胞及其信号转导研究 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.2.3 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 人精原干细胞的分离和鉴定 |
| 1.3.2 人精原干细胞诱导体外转分化为肝干细胞 |
| 1.3.3 人肝干细胞诱导分化为小肝细胞 |
| 1.3.4 小肝细胞分化为成熟的肝细胞 |
| 1.3.5 人精原干细胞来源的成熟肝细胞的功能分析 |
| 1.3.6 β-CATENIN/HNF4A/FOXA1/GATA4 信号通路参与了人精原干细胞诱导转分化为成熟肝细胞的过程 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 人精原干细胞体内诱导转分化为肝细胞 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 肝脏间质细胞的分离和鉴定 |
| 2.3.2 肝损伤模型的建立 |
| 2.3.3 人精原干细胞和肝间质细胞重组 |
| 2.3.4 人精原干细胞和肝间质细胞的肾包膜移植 |
| 2.3.5 移植4周后转化细胞的鉴定 |
| 2.3.6 人精原干细胞体内移植的安全性检测 |
| 2.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）骨髓源性侧群细胞的体外增殖及其向肝样细胞分化的实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 骨髓源性侧群细胞的分选、体外增殖培养及鉴定 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第二部分 骨髓源性侧群细胞向肝样细胞的定向诱导分化 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性肝衰竭的作用研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 国内外研究概况 |
| 第一部分 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
四、造血干细胞转分化肝组织细胞的研究进展（论文参考文献）
- [1]小鼠Kupffer细胞的转分化研究[D]. 李昕宇. 吉林大学, 2021(01)
- [2]“补肾化瘀法”基于SDF-1/CXCR4轴促进骨髓间充质干细胞移植治疗肝硬化的机制研究[D]. 潘益巧. 广西中医药大学, 2021(02)
- [3]hucMSCs来源的外泌体促进大鼠肝切除术后肝再生的机制研究[D]. 宋晓静. 兰州大学, 2021(09)
- [4]Hoxb5转分化来源的T细胞抗肿瘤及Hoxb5调控多能造血祖细胞功能的研究[D]. 胡房晓. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [5]Kupffer细胞和肝窦内皮细胞促进肝脏造血及其机制研究[D]. 孟德萍. 山东大学, 2019(02)
- [6]造血干细胞通过转分化为肺组织细胞促进肺辐射损伤修复[D]. 葛超荣. 苏州大学, 2019(06)
- [7]多谱学联合分析在干细胞救治暴发性肝衰竭中的应用[D]. 张嘉宁. 浙江大学, 2018(09)
- [8]人生殖干细胞转分化为成熟肝细胞及其信号转导研究[D]. 陈政. 上海交通大学, 2016(03)
- [9]骨髓源性侧群细胞的体外增殖及其向肝样细胞分化的实验研究[D]. 刘建. 遵义医学院, 2014(11)
- [10]骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性肝衰竭的作用研究[D]. 袁淑芳. 新疆医科大学, 2013(02)