一、c-Ha-ras转基因小鼠的构建与鉴定（论文文献综述）
刘苏苏,曹愿,杨艳伟,王辰飞,王三龙,范昌发[1]（2021）在《自建Tg.C57-ras V1.0小鼠模型与日本Tg.ras H2小鼠遗传学及其杂交1代生物学特性比较》文中研究说明目的比较自主建立的Tg. C57-ras小鼠与日本Tg. ras H2小鼠模型的遗传学及Tg. C57-ras转基因小鼠与BALB/c小鼠的杂交1代小鼠（简称CB6F1-NIFDC）与日本Tg. ras H2转基因小鼠模型杂交1代小鼠（简称CB6F1-CIEA）的生物学特性,为国内药物安全评价机构提供致癌性模型的多元化选择。方法对两种模型的遗传学及生物学特性进行比较,包括模型构建方法、转录水平、蛋白水平、生长曲线、血液生理数据等。结果遗传学特性:两种模型均采用转基因方法构建,转入c-Ha-ras基因序列无实质差异,拷贝数仅相差一个;两种模型的不同脏器在mRNA水平基因表达具有相似性;日本模型肺组织的蛋白水平稍高于自主建立模型,但无统计学差异。生物学特性:根据文献分析两种模型杂交1代的生长曲线有差异,但在致癌实验周期内两模型体质量差别不大;血液生理指标有部分差异。结论通过遗传学及生物学特性比较,自建模型可作为临床前药物致癌性评价的候选模型。
曹愿,岳秉飞,柳全明,范昌发[2]（2020）在《大小鼠模型命名方法与规则简介》文中指出近年来,随着生命科学以及生物医药工程技术的迅猛发展、基因编辑技术的突破,建立了越来越多的大小鼠模型动物,并广泛应用于基础研究中,如肿瘤学、传染病学、免疫等的研究。模型动物资源总量不断增加,模型动物命名不规范统一,给模型动物管理、国际交流和知识产权的保护带来一些困扰。本文以美国JAX实验室命名规则为基础,较详细的介绍了常见的模型动物（如大鼠、小鼠）的命名方法,并对不同类型模型的命名方法进行了举例说明,以期建立符合国际规范、便于国际交流的模型动物命名方法。
袁京生[3]（2019）在《干扰素调节因子-1下调P-糖蛋白的表达逆转胃癌化疗耐药的研究》文中研究说明目的:1.阐明干扰素调节因子-1（IRF-1）逆转胃癌化疗耐药的作用及其分子机制。2.明确临床胃癌组织标本中IRF-1和P-糖蛋白的表达情况,探讨IRF-1在胃癌化疗中的临床应用价值。方法:1.培养两株化疗耐药的胃癌细胞,检测耐药细胞株和亲本细胞株IRF-1的表达差异,分析其与胃癌耐药的相关性。2.通过调节IRF-1的表达,分析其对胃癌细胞化疗耐药性的影响以及对P-糖蛋白的调控作用。进一步利用染色质免疫共沉淀和荧光素酶报告基因等方法阐明IRF-1对P-糖蛋白的调控机制。3.利用IFN-γ诱导胃癌细胞IRF-1表达,探究其对P-糖蛋白表达的影响。4.利用已建立的四环素诱导IRF-1表达胃癌细胞系（MKN45/IRF-1）,采用6周BALB/c裸鼠建立胃癌动物模型,并分为IRF-1表达组（强力霉素诱导表达）和对照组,然后以上两组再分别注射化疗药（顺铂、5-氟尿嘧啶和阿霉素）,分析肿瘤生长和IRF-1的表达情况,进行IRF-1逆转胃癌化疗耐药的动物实验研究。5.收集胃癌组织标本以及相关的临床病理资料,并结合TCGA数据库胃癌基因表达谱数据,分析IRF-1表达和胃癌化疗耐药的临床相关性。结果:1.IRF-1在化疗耐药胃癌组织和化疗耐药胃癌细胞中均呈相对低表达。2.IRF-1调节胃癌细胞的化疗耐药:IRF-1过表达后,不同浓度的化疗药物（顺铂、5-氟尿嘧啶和阿霉素）处理胃癌细胞,细胞增殖受到抑制、凋亡增加;IRF-1敲低后,细胞增殖呈相反变化;并且IRF-1调节胃癌细胞化疗耐药性的作用与细胞内化疗药物浓度改变有关。3.IRF-1调节胃癌细胞中的P-糖蛋白表达:IRF-1过表达后,P-糖蛋白表达受到抑制;IRF-1敲低后,P-糖蛋白表达呈相反变化。进一步挽救实验证实P-糖蛋白在IRF-1表达逆转胃癌化疗耐药中发挥关键作用。4.IFN-γ抑制胃癌细胞中的P-糖蛋白表达:IFN-γ增加IRF-1表达,并且P-糖蛋白以剂量依赖性方式被抑制。IFN-γ处理后,化疗药物对细胞的抑制率显着增加,该结果与细胞膜上P-糖蛋白表达降低和细胞内药物浓度增加有关。5.IRF-1抑制P-糖蛋白启动子活性:染色质免疫共沉淀证实了 P-糖蛋白基因启动子上IRF-1的转录结合位点,荧光素酶检测技术进一步证明了 IRF-1的表达对P-糖蛋白基因启动子活性具有抑制作用。6.IRF-1表达升高在体内逆转胃癌的化疗耐药:腹腔注射化疗药（顺铂、5-氟尿嘧啶和阿霉素）后,IRF-1表达组中异种移植肿瘤的体积和重量在治疗后显着降低。免疫组织化学、Western-blotting和RT-RCR方法检测共同证实IRF-1表达组中P-糖蛋白表达显着低于对照组。7.统计分析临床病理资料和TCGA数据库资料均表明:IRF-1低表达与胃癌患者P-糖蛋白升高及不良预后相关,并且IRF-1是胃癌患者术后独立的预后因素。结论:1.IRF-1可以在体内和体外逆转胃癌的化疗耐药。2.IRF-1通过下调胃癌细胞P-糖蛋白的表达逆转化疗耐药。3.IRF-1介导了 IFN-γ对P-糖蛋白表达的抑制。4.IRF-1抑制P-糖蛋白的基因启动子活性,在转录水平抑制P-糖蛋白的表达。5.IRF-1与P-糖蛋白的表达呈负相关,并可作为胃癌患者独立的预后指标。
祁苗[4]（2019）在《AIM2通过抑制线粒体融合促进非小细胞肺癌生长增殖的作用及机制研究》文中认为背景及目的:在过去的几十年中,肺癌一直是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在中国其发病率和死亡率均呈现出快速增长的趋势。肺癌分为小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）,其中,NSCLC起源于支气管粘膜上皮,最为常见,约占肺癌患者的85%。肺癌发病隐匿,恶性程度高,大多数肺癌患者就诊时已是晚期。目前肺癌患者总体的5年生存率仍然低于20%,因此,有必要继续深入研究并探索与肺癌发生发展相关的分子靶点及其作用机制。线粒体是一种具有高度动态结构的细胞器,线粒体融合与分裂的动态变化精细调控了细胞的钙稳态、ATP产能和ROS生成等。线粒体融合与分裂的动态过程主要由一些大GTPases蛋白参与并严格调控,如参与调节线粒体内外膜融合的OPA1和MFN1/2以及参与调节线粒体分裂的DRP1及其受体蛋白Fis1、MFF、MiD49/51等。近年来,越来越多的证据表明,线粒体结构和功能异常与肺癌的发生发展密切相关,靶向调控线粒体动态平衡可以改变线粒体代谢及其胞内分布,从而达到肿瘤细胞治疗的目的。AIM2是干扰素诱导的HIN-200蛋白家族中的一员,是固有免疫系统的重要分子,引起炎症因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌;另外也可以诱导细胞焦亡（Pyroptosis）。除此之外,AIM2同样参与调控多种肿瘤的发生与发展,并表现出抑癌和促癌的双重作用。AIM2的免疫功能中已被人们熟知,但其在肿瘤中的作用机制仍然不明确,本研究中,旨在探索AIM2表达调控线粒体动态平衡进而促进NSCLC发生发展的作用及分子机制,为肺癌治疗提供新思路。方法与结果:一、AIM2通过炎症非依赖途径促进NSCLC细胞体内外生长增殖1.通过Oncomine、TCGA数据库分析得知,AIM2在NSCLC患者的组织样本中是高表达的;细胞层面上通过q-PCR和免疫印迹（WB）检测AIM2在NSCLC细胞中相对于肺正常细胞是高表达的;Kaplan-Meier分析显示AIM2的表达与肺癌病人存活呈负相关。2.体外通过细胞计数、克隆形成和软琼脂实验,将AIM2敲减或过表达,抑制或促进了 NSCLC细胞增殖;体内通过小鼠肿瘤体积、肿瘤重量的测量以及免疫组化（IHC）中Ki-67阳性率,表明AIM2敲减抑制小鼠肿瘤生长增殖。3.NSCLC细胞中敲减AIM2后,通过q-PCR、上清蛋白提取和小鼠肿瘤组织WB、caspase-1的抑制剂的细胞计数和WB,表明IL-1β和caspase-1没有参与NSCLC细胞生长;敲减AIM2,NF-κB信号通路相关蛋白也没有发生变化。二、AIM2通过MFN2调控线粒体动态平衡进而促进NSCLC细胞生长增殖1.通过k-NN软件预测、细胞组分分离和免疫荧光技术方法,表明AIM2定位于线粒体外膜。2.在pDsRed2-Mito稳转NSCLC细胞中敲减或过表达AIM2,于激光共聚焦显微镜下观察统计,线粒体更多为线网状或粒状存在。敲减AIM2后,WB检测显示线粒体融合相关蛋白MFN2显着表达上调;而外源过表达AIM2后,MFN2的表达则显着下调。在AIM2敲减的小鼠异源肿瘤组织中,WB和IHC检测也显示MFN2表达显着上调。3.在NSCLC细胞中敲减或过表达MFN2、DRP1,通过激光共聚焦显微镜观察分析线粒体形态、细胞计数和克隆形成实验,证明线粒体动态平衡调控NSCLC细胞增殖。三、AIM2通过MFN2调控线粒体动态平衡,调节ROS产生,进而激活MAPK/ERK信号通路,导致NSCLC细胞生长增殖。1.蛋白质激酶芯片结果表明:AIM2敲减后,MAPK信号通路中ERK1/2等磷酸化下调;细胞和小鼠肿瘤组织WB结果也证实ERK1/2活性受抑制。2.在NSCLC细胞中敲减或过表达MFN2、DRP1,WB检测p-ERK1/2变化,结果表明线粒体动态平衡可以调控MAPK/ERK活性。3.将MFN2敲减或过表达,ROS水平上调或下调。NAC或H2O2处理AIM2敲减的NSCLC细胞,p-ERK1/2活性下调增强或部分恢复,而MFN2表达不受影响,表明线粒体动态变化,调节ROS产生,进而调控MAPK/ERK信号通路活性。结论及意义:本课题从分子、细胞、小鼠模型及肿瘤患者组织样本水平上,深入探索AIM2调控线粒体动态平衡进而促进NSCLC发生发展的作用及分子机制:AIM2通过MFN2调控线粒体动态平衡,调节细胞ROS产生,进而激活MAPK/ERK信号通路,导致NSCLC细胞生长增殖。本课题的完成,有助于揭示AIM2在肿瘤发生发展中的新功能和新作用,阐明NSCLC细胞中线粒体动态失衡的分子机制,为NSCLC发生发展的机制研究及肺癌治疗提供新思路。
刘苏苏,吴曦,周舒雅,王辰飞,左琴,李保文,范昌发[5]（2018）在《基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因小鼠的建立》文中进行了进一步梳理目的构建基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因（c-Ha-ras）的小鼠,以获得hRas基因在特定组织器官条件性表达的小鼠模型,用于药物的临床前致癌性安全评价及相关机制研究。方法首先构建hRas打靶载体,电击法转染入小鼠胚胎干细胞（ES细胞）,用正负法筛选阳性ES细胞,通过PCR、Southern鉴定后,将正确重组hRas基因的ES细胞导入C57BL/6 J小鼠囊胚,移入同步发育的受体鼠子宫,妊娠足月出生的嵌合体小鼠与C57BL/6 J小鼠交配获得杂合子hRasfl/+小鼠。再将杂合子hRasfl/+小鼠间交配获得纯合子小鼠hRasfl/fi,然后与全身组织细胞表达Cre重组酶的Tg（EIIa-cre）小鼠进行交配,获得全身细胞表达hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,并通过荧光定量PCR方法检测不同日龄胚胎期仔鼠的hRas基因表达水平。结果成功构建了基于Cre-LoxP系统的人源hRas基因条件性定点敲入小鼠模型的载体,筛选得到的一个正确克隆,电转ES细胞后进行Southern blot鉴定,经过初筛和复筛,共获得12个阳性克隆,挑选A11号克隆ES细胞进行囊胚注射,移植了48枚胚胎,出生9只小鼠,其中6只为嵌合鼠,将嵌合率>50%的雄鼠与野生型C57BL/6 J雌鼠进行交配,出生21只后代,其中鉴定有4只hRasfl/+小鼠;hRasfl/+小鼠间交配出生29只小鼠,其中有14只纯合子hRasfl/fi小鼠;hRasfl/fl小鼠与Tg（EIIa-cre）工具鼠交配6次,未有仔鼠出生;跟踪不同发育时期胚胎中hRas基因的表达发现,E10.515.5 d胚胎中检测到hRas基因表达。结论成功建立运用Cre-LoxP系统建立了带有hRas基因敲入的纯合子小鼠hRasfl/fl,未能得到全身细胞高效表达人源hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,但为进一步利用hRasfl/fl小鼠模型建立其他组织特异性的条件性基因敲入小鼠模型做好技术储备。
冯韵[6]（2017）在《条件性敲除β-catenin在肝癌发生中的作用及机制研究》文中研究指明研究背景肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,在肿瘤相关死亡数中高居第二位。而肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）占原发性肝脏肿瘤的80%。目前认为HCC的发病涉及肝细胞本身和肝脏微环境因素,但确切机制还不清楚。对于早期HCC病人,肿瘤切除或肝脏移植是根治性治疗方法。然而许多病人就诊时已处于中晚期,无法从手术中获益。对于中晚期的HCC患者,现阶段唯一有效的治疗药物是索拉非尼。但是索拉非尼只能延长患者平均两到三个月的生存期。因此,为了找到更加有效的HCC治疗策略,阐明HCC发生发展的分子机制显得尤为重要。β-catenin（由CTNNB1编码）是Wnt信号通路的关键组成部分。HCC病人标本大规模全基因组筛查发现β-catenin、c-Met和端粒酶是最常见的突变。20%-40%的病人存在CTNNB1基因突变。在HCC鼠模型中,大约25%存在CTNNB1突变及表达升高。与此一致的是,多项研究显示β-catenin能够协同其他信号通路促进肝癌发生。然而,亦有研究报道肝细胞特异性β-catenin敲除鼠对DEN诱导的肿瘤形成更加敏感,机制包括过度的氧化应激、肝损伤和炎症。另有研究提示活化的Wnt/β-catenin信号通路能够通过抑制Hippo信号通路中YAP/TAZ和Notch信号通路之间的正反馈,进而抑制HCC形成。因此,β-catenin在HCC中的确切作用仍需进一步探索。最近有研究报道一种新的构建HCC鼠模型的方法,称作水动力转染（hydrodynamic transfection,HT）技术。在人HCC标本中,c-Met和β-catenin基因同时激活十分常见。而使用HT技术结合睡美人转座子（Sleeping Beauty transposon,SB）系统,共转染c-Met（MET）和持续激活型β-catenin（ΔN90-β-catenin,CAT）进入鼠肝脏时,能够快速有效的引起原发性肝癌。因此,这一方法使得我们能够结合传统转基因鼠模型,研究不同基因在肝癌发生中的相互作用。研究目的为了确定β-catenin肝细胞特异性缺失造成的微环境对HCC发生的影响,本课题拟结合水动力转染技术和肝细胞敲除β-catenin转基因鼠模型,采用共转染MET和CAT质粒的方式建立小鼠肝癌模型,通过分子生物学和生物信息学等方法,探讨肝脏条件性敲除β-catenin在MET/CAT诱导的鼠HCC中的作用及可能机制,探索肝癌发生的促进因素,以期为HCC的发病机制与临床防治提供实验依据及治疗靶点。研究方法1、动物模型的建立。（1）建立肝细胞条件性敲除β-catenin转基因小鼠模型。取C57BL/6品系的β-cateninflox/flox小鼠与Albumin-Cre+小鼠杂交,后代经基因检测挑选出β-cateninflox/+;Alb-Cre+鼠,再将该基因型鼠与β-cateninflox/flox鼠杂交,后代经基因检测挑选出β-cateninflox/flox;Alb-Cre+即肝细胞特异性敲除β-catenin(β-cateninΔhep)小鼠。（2）建立癌基因MET/CAT诱导的HCC小鼠模型。选取雄性C57BL/6的野生型（WT）小鼠和上一步建立的β-cateninΔhep鼠,分为两组:第一组含WT鼠、β-cateninΔhep鼠各8-12只,8周龄时处死,留取肝脏、脾脏、血液和鼠尾等组织标本。第二组含WT鼠、β-cateninΔhep鼠各16-18只,在8周龄时采用HT技术经鼠尾静脉注射含有MET、CAT和SB转座酶质粒的生理盐水,三者比例为10:10:0.8,溶液浓度为10.4μg/ml生理盐水,每只鼠的注射剂量（ml）为体重（g）的10%,注射全过程在7秒内完成。在注射质粒后第3天、第7周分别处死WT鼠、β-cateninΔhep鼠各8-9只,留取肝脏、脾脏、血液和鼠尾等组织标本。利用鼠尾、肝脏组织分别行基因检测和Western blot,验证基因表型。2、观察肝细胞条件性敲除β-catenin对小鼠肝脏及HCC发生的影响。（1）观察条件性敲除β-catenin对肝脏的影响。分别测量8周龄WT鼠、β-cateninΔhep鼠肝脏重量、体重,计算肝脏/体重比。H&E染色观察两组肝脏形态学差异。免疫荧光法染色Ki67检测肝细胞增殖情况。TUNEL法检测肝细胞凋亡情况。（2）观察条件性敲除β-catenin对HCC发生的影响。注射质粒后7周处死组小鼠,留取肝脏组织,统计肿瘤数目、肝脏/体重比、肿瘤最大直径;H&E染色分析肿瘤病理类型。注射质粒后3天、7周处死组小鼠的肝组织冰冻切片行Ki67免疫荧光染色,检测肝细胞增殖情况。TUNEL法检测肝细胞凋亡情况。Western blot观察条件性敲除β-catenin对细胞粘附作用的影响。3、检测肝细胞条件性敲除β-catenin对HCC基因表达谱的改变。对于不同时间点的肝脏标本行RNA sequencing（RNA-seq）检测,比较WT鼠与β-cateninΔhep鼠基因表达谱的差异,使用生物信息学方法,筛选差异基因并进行初步验证。4、检测肝细胞条件性敲除β-catenin对HCC信号通路的改变。注射质粒后3天处死组小鼠的肝脏冰冻切片,行免疫荧光染色,检测表达c-Met及β-catenin的细胞数量,比较WT鼠与KO鼠质粒转染效率。3个不同时间点的肝组织行Western blot,检测c-Met及β-catenin表达水平;检测Wnt/β-catenin、MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路蛋白表达水平。Real-time PCR法、Western blot、免疫组化法检测转录因子Sox9表达水平。5、检测肝细胞条件性敲除β-catenin对HCC局部炎症的影响。对于不同时间点的模型,免疫组化法检测F4/80、Ly6G和B220,免疫荧光法检测CD3,观察局部炎症细胞的分布。Real-time PCR法检测IL-12、TGF-β1、TNF-α、IL-1β和IL-6,观察局部细胞和炎症因子的表达。H&E染色观察肝脏形态学差异。研究结果1、肝细胞条件性敲除β-catenin减缓了小鼠肝脏发育,肝脏重量、肝脏/体重比降低。但肝脏H&E染色、Ki67、TUNEL染色无显着性差异。2、肝细胞条件性敲除β-catenin明显加剧了小鼠肝癌发生。注射质粒7周后KO鼠与WT鼠相比,肿瘤数目、肝脏/体重比、肿瘤最大直径明显增加。H&E染色提示为HCC。Ki67免疫荧光染色提示肝细胞增殖明显加快。TUNEL检测提示细胞凋亡在肿瘤区域显着增加。Western blot结果显示条件性敲除β-catenin引起γ-catenin表达升高,E-cadherin降低,N-cadherin无明显变化,提示没有影响细胞粘附作用。3、RNA-seq结果显示肝细胞条件性敲除β-catenin引起基因表达谱改变,肿瘤相关正性调节基因及信号通路表达增加。8周龄KO鼠与WT鼠相比,细胞外基质和免疫反应相关通路表达升高。注射质粒3天后KO鼠E2F1下游基因和细胞周期下游基因表达减少。注射质粒7周后KO鼠炎症相关基因、缺氧相关信号通路、HIF1α转录网络、c-Jun下游基因、DNA损伤正性调控基因和淋巴细胞凋亡负性调控基因表达明显增加。KO鼠中Sox9、IL-6、IL-6通过Stat3调节的相关基因表达始终高于WT鼠。4、肝细胞条件性敲除β-catenin激活了多种HCC信号通路。Western blot结果显示KO鼠与WT鼠相比,Wnt/β-catenin、MAPK/ERK和PI3K/Akt通路多种信号分子表达升高,下游转录因子Cyclin D1和Sox9增加。5、肝细胞条件性敲除β-catenin明显加重了肝脏局部炎症。免疫组化和免疫荧光检测提示,注射质粒3天后KO鼠与WT鼠相比,F4/80和CD3表达增加。注射质粒7周后KO鼠Ly6G和B220表达增加。Real-time PCR结果显示,8周龄KO鼠TGF-β1和IL-6升高;注射质粒3天后KO鼠IL-12、TGF-β1、TNF-α、IL-1β和IL-6表达均显着增加;注射质粒7周后KO鼠IL-12、IL-1β和IL-6显着升高。结论肝细胞条件性敲除β-catenin促进了水动力转染MET/CAT质粒引起的鼠HCC。可能机制包括:局部炎症加剧,Wnt/β-catenin、MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路过度激活,转录因子Cyclin D1和Sox9表达增加,肿瘤相关正性调节基因及信号通路表达增加等。这些机制提示肝细胞β-catenin缺失改变了肝脏微环境,促进了HCC发生。
谢少林[7]（2017）在《Tg（cyp1a:mCherry）转基因斑马鱼的构建及其对环境中POPs监测的研究》文中研究指明持久性有机污染物（Persistent organic pollutants,POPs）是指具有持久性、生物蓄积性、半挥发性、远距离迁移性、高毒性等特性污染的统称,包括二恶英和多环芳烃类（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs）等强致癌物质。POPs对环境的污染日益加重,不仅影响农产品尤其是水产品的质量安全以及社会可持续发展,而且直接影响人畜饮水,并严重威胁着人类健康,乃至生存。为此,如何快速、灵敏地监测环境中POPs的污染状况显得十分重要。本论文利用二恶英和PAHs可以激活芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor,AHR）信号通路启动下游基因细胞色素P450 1A（Cytochrome P450 1A,cyp1a）表达的特点,构建了一种通过cyp1a启动子驱动红色荧光基因（mCherry）表达的Tg（cyp1a:mCherry）转基因斑马鱼（Barchydanio rerio var）,利用该转基因荧光斑马鱼暴露于不同环境样品中,根据其荧光蛋白表达量的变化监测环境中二恶英、PAHs等POPs的含量和变化。同时应用截短的cyp1a启动子、Gal4/UAS系统、TALE-TF系统以及CRISPR/Cas9基因编辑系统,进行提高转基因荧光斑马鱼对POPs检测灵敏度的相关研究。主要研究结果如下:1、通过巢式PCR扩增得到cyp1a启动子,其长度为2685bp,包括8个外源性化学物质调控元件（XRE）以及CAAT框和TATA框,双荧光素酶分析结果显示实验所得的启动子具有明显的2,3,7,8-四氯二苯并二恶英（2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD）浓度依赖效应。2、利用巨核酸酶转基因系统,通过斑马鱼胚胎显微注射,最终筛选得到5个品系的转基因荧光斑马鱼,其中品系CM2和CM3对TCDD具有明显的浓度依赖效应。通过染色体步移技术和绝对荧光定量分析,品系CM2具有两个拷贝,其中一个插入位点在4号染色体tspan11和sema3aa之间;品系CM3具有一个拷贝,插入位点在22号染色体elfn2a和mfng之间。3、通过TCDD和萘（naphthalene,Nap）、菲（phenanthrene,Phe）、苯并[a]芘（benzo[a]pyrene,BaP）、苯并[a]蒽（benzo[a]anthracene,BaA）、苯并[g,h,j]苝（benzo[g,h,j]perylene,BghiP）5种PAHs暴露分析,转荧光斑马鱼荧光表达和其自身cyp1a基因表达在时空上具有一致性,诱导的cyp1a基因和荧光蛋白主要表达在肝脏和肠道处,头部、皮肤和眼睛也有少量表达。不同化合物诱导荧光基因和cyp1a基因的表达量和位置不尽相同,我们发现≥4个环的PAHs能高效诱导荧光和cyp1a基因的表达,≤3个环的PAHs诱导效果不明显。试验结果中品系CM2暴露NaP（2个环）和Phe（3个环）荧光强度和cyp1a基因的表达量要显着小于其他三种PAHs:Ba A（4个环）、BaP（5个环）和BghiP（6个环）。原位杂交结果显示BaA、BaP和BghiP都可以诱导cyp1a基因在肝脏中表达,同时BaA和BghiP还可以诱导cyp1a基因在血管表达,BaP诱导cyp1a基因在表皮中呈点状大量表达。同时利用三峡流域江津、巴南、木洞镇、长寿、涪陵、丰都、忠县、万州、云阳、奉节、巫山共11个不同区段水样和巴基斯坦卡拉奇市Lyari、Surjani Town和Jacob lines 3个地区共15个电子垃圾回收站点附近土样浸提液暴露转基因荧光斑马鱼品系CM2,结合样品中通过GC-MS测得的PAHs含量,发现转基因红色荧光斑马鱼的荧光强度和对应区域样品中PAHs含量有很强的相关性,样品中≥4个环的PAHs的含量越大,其荧光强度也越强。因此试验所构建的转基因荧光斑马鱼可以应用于环境中TCDD和PAHs等POPs的监测研究。4、试验中截短的8XRE启动子与原始cyp1a启动子相比,其转录活性明显增强,诱导效果最为显着。在0.01 nM的TCDD暴露下,其荧光素酶活性是完整启动子的近6倍,在1nMTCDD的暴露下,其荧光素酶活性是完整启动子的5.14倍。Gal4/UAS系统可以显着提高cyp1a启动子的转录活性,其中8XRE-Gal4/UAS-Luc和cyp1a-Gal4/UAS-Luc中荧光素酶活性被Gal4/UAS系统显着提高,且具有浓度依赖效应。但在没有诱导的情况下,二者Luc/RLuc的比值也显着提高,分别为59.97和84.93。另外,成功构建可以识别cyp1a启动子TALE识别模块,通过与VP64融合表达,可以显着增加cyp1a启动子的转录活性。但即使在不暴露的情况下,cyp1a+GFP/Luc+TALE-VP64中Luc/RLuc比值也可以达到cyp1a+GFP/Luc的26.44倍。且TALE蛋白自身具有一定的毒性,过量表达的TALE蛋白会使斑马鱼胚胎发育畸形。因此,在三种提高转荧光斑马鱼监测敏感性的方法中,利用截短的8XRE启动子提高红色荧光基因表达水平是目前最为有效的手段。5、首创了一种利用卵子注射提高CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法。通过将Cas9mRNA和gRNA注射到卵子中,接着利用90%L-15培养基（pH 9.0,0.5 mg/mL BSA）在体外保存30 min,然后通过人工授精使其卵子正常受精发育。通过这种方法,mc4r、mpv17、mstna、mc3r和mrap2b五个基因的打靶效率分别达到94.4%、88.9%、91.1%、90%和93.3%,mc4r和mpv17打靶位点传代效率为96.3%和90.7%,在位点mc4r敲入效率为49.6%。通过该方法可以显着提高Cas9的基因敲除效率、传代效率和敲入效率。
张虎[8]（2016）在《qPCR检测转基因水稻拷贝数以及拷贝数与农艺性状关系的研究》文中进行了进一步梳理qPCR是核酸定量检测的重要方法之一,同时也是转基因水稻外源基因拷贝数测定的主要方法。其中标准品的正确选择以及构建合格的标准曲线是qPCR定量精确性的保证之一。本研究旨在通过qPCR技术测定Bar基因拷贝数以探讨转基因水稻中Bar基因拷贝数与适合度性状的关系。本研究通过选取含有内参基因基因Sps和目的基因Bar的转基因水稻基因组DNA、未线性化pBS质粒DNA和线性化质粒DNA为标准品,将标准品稀释为106、105、104、103、102 5个浓度,三种标准物质和两个基因构建6条标准曲线进行比较分析。6 条标准曲线方程分别为 y =-3.6937x +42.727、y =-3.6752x +39.912、y =-3.1857x +37.493、y =-3.2397x +34.952、y =-3.3639x +36.296、y =-3.3143x +33.331;线性化pBS质粒DNA构建的两条标准曲线扩增效率分别为98.28%和100.32%,接近100%;三者在5个浓度点的目的基因Bar与内参基因Sps的Ct值差,即△Ct=（CtBa如基因-CtSps基因）均值分别为2.74、2.76和2.77,基本一致。本研究表明质粒标准品DNA标准品和基因组DNA标准品在构建标准曲线时,得到的标准曲线方程斜率和纵截距均有显着差异。因此在标准品选取时,虽然两者均可以用于相对定量,但是线性化质粒DNA标准品相比未线性化质粒DNA标准品和基因组DNA标准品更适合构建标准曲线。以含有不同Bar基因拷贝数的转基因水稻MH63（cry1C*/Bar）为材料,利用qPCR鉴定16株亲代单株及其16个子一代群体152个单株的Bar基因拷贝数,16个子一代种群成熟期分别测定株高、分蘖数、穗数、穗长、单株总粒数、单株饱粒数、千粒重、结实率和单株总粒重9个性状。研究发现,16个亲代单株Bar基因拷贝数在0.51到7.54之间,子一代Bar基因拷贝数在0到4之间,16个子一代群体内Bar基因拷贝数均发生不同程度变化。子一代中株高、分蘖数、穗数、穗长、单株总粒数、单株饱粒数、千粒重、结实率和单株总粒重9个性状与非转基因受体水稻MH63比较,随Bar基因拷贝数的升高有不同程度的降低,最高分别降低-8.16%、-6.57%、-9.90%、-19.85%、-14.22%、-11.27%、-6.90%、-28.41%和-30.95%。转基因水稻 MH63(cry1C*/Bar 在常规种植条件下,其田间的株高、穗长、千粒重、结实率、单株饱粒数和单株总粒重等性状与Bar基因拷贝数呈显着的负相关关系,P值分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.019 和 0.024。
刘苏苏,吴曦,周舒雅,王辰飞,彭泽旭,左琴,李保文,贺争鸣,范昌发[9]（2015）在《C57-ras转基因小鼠模型杂交1代CB6F1的生长发育特性》文中研究指明目的测定自主建立的转基因致癌性模型C57-ras小鼠与BALB/c小鼠杂交1代的生长发育特性参数,为该模型的商业化供应提供基础数据。方法将雄性转基因阳性C57-ras小鼠与野生型雌性BALB/c小鼠交配,获得杂交1代（CB6F1 c-Ha-ras+/-）并测定平均产仔数、离乳率、阳性鼠生长发育情况、转基因阳性率等参数。结果在生长发育方面,雌鼠平均每窝产子数为8只,离乳率为90%,雄雌性别比符合预期。CB6F1的平均出生重为（1.73±0.05）g,10周龄时阳性鼠平均体重雌性（24.38±1.74）g,雄性（29.42±1.72）g。雄性鼠体重明显高于雌性,差异存在极显着性（P<0.01）;基因型检测阳性率为46.9%,符合遗传规律。结论转基因致癌性模型C57-ras小鼠与BALB/c小鼠杂交1代的生长发育特性正常,可实现规模化商业供应。
汪未知[10]（2015）在《TFF1基因多态性与胃癌遗传易感性及预后的相关研究》文中提出胃癌是一种十分复杂的疾病,是多种因素包括幽门螺旋杆菌感染、饮食习惯以及遗传因素共同作用的结果。如今,胃癌是世界第五大常见肿瘤以及第三大肿瘤致死疾病。每年有约951,000新发病例以及723,000死亡患者。超过70%的胃癌发生在发展中国家,超过半数发生在东亚地区（主要在中国）。在中国,根据流行病学资料,胃癌是第三大肿瘤发病率高达29.24人/10万,并且其肿瘤致死率也排在第三位。相对局限的诊断技术以及治疗方案造成全球的5年生存率近在30%左右。造成这一结果的主要原因是我们对胃癌发生发展的潜在机制仍了解不足。众所周知,胃癌的病理过程同慢性萎缩性胃炎这样的癌前病变密切相关。三叶草因子1（Trefoil Factor 1,TFF1,也叫pS2）属于三叶草多肽家族,其通过二硫键形成一个三叶草样的结构域,拥有抵抗蛋白水解以及酸性环境的作用。TFF1的主要功能是保护胃黏膜的完整性。TFF1最早在人类乳腺癌细胞株MCF7中被发现,随后被发现其主要位于胃黏膜中,主要由胃体至幽门的隐窝细胞的上部所分泌。当黏膜受损时,TFF1的表达显着增加,同时约有60%的肿瘤显示出了TFF1的丢失。同癌旁正常组织相比,TFF1在肿瘤组织的表达显着下降。由于TFF1对幽门胃窦黏膜的分化十分重要,当其缺失时可能造成未分化胃上皮细胞的聚集,而这些细胞有可能进展为肿瘤细胞。根据前期研究报道,TFF1可以通过诱导细胞由G1期向S期转化的延迟来达到抑制细胞增殖的目的。当TFF1丢失时,可以通过激活IKK/NF-κB通路以及依赖PP2A的β-catenin通路来促进胃癌肿瘤的形成。因此,TFF1常被认为是一种胃癌特异性的肿瘤抑制基因,这一结论更是被tff1基因敲除小鼠充分的证明了。目前有关抑制TFF1表达的相关机制已有报道。杂合子丢失（LOH）以及启动子高甲基化可以解释胃癌中TFF1基因的沉默。在亚硝基脲诱导的胃癌小鼠模型中tff1启动子H3K9的甲基化以及H3的去乙酰化会诱导tff1的低表达。此外,在转录层面,CCAAT/增强子绑定蛋白β以及共转录因此BRCA1也具有抑制TFF1表达的作用。然而,调控TFF1表达的相关机制仍需要我们进一步研究。遗传学改变也是导致胃癌发生的重要因素。TFF1基因的体细胞突变仅在少数胃癌肿瘤中被发现。因此,单核苷酸基因多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）,作为人类最常见的一种遗传学变异,应该被纳入我们的研究中。然而目前为止,仅有一篇目前,仅有一篇小样本伊朗人群的文献报道了TFF1基因相关的单个SNP位点与胃癌发病风险的关系,仍缺乏大样本的系统性研究。我们打算采用tagSNPs选点策略,因为同单位点分析相比,其具有更强的效能,可以更好地帮助我们确立影响复杂疾病发生的重要遗传变异。本研究我们将采用大样本的两阶段病例-对照研究设计,探讨TFF1的基因多态性与胃癌发生风险以及术后预后生存的相关性。并利用相关分子生物学实验,初步阐明这些位点影响胃癌发生发展的相关机制。为胃癌的早期诊断和个体化治疗提供新的理论依据。第一部分TFF1基因多态性与胃癌发生风险的相关性研究研究背景:目前我们对TFF1表达的调控机制有了一定的了解,但仍不充分,而基因的遗传变异也可能参与了TFF1的调控。由于TFF1基因的体细胞突变仅在大约5%的胃癌中被发现,而SNPs又被认为是最常见的一种遗传变异,因此研究TFF1基因相关的SNPs具有一定的科研价值。在本研究中,我们首次提出了利用tagSNPs来探索TFF1基因相关SNPs与胃癌风险的相关性。方法及结果:我们通过HapMap数据库筛选了位于TFF1基因上以及其启动子区域的tagSNP,并最终确立5个tagSNP位点。随后通过病例对照研究方法,在大样本的两阶段人群中,检测和分析这些多态性位点的基因型对胃癌遗传易感性的影响。结果发现rs3761376 AA基因型同胃癌的发生风险密切相关。同时为了进一步了解该位点的作用,我们利用荧光素酶报告基因实验、电泳迁移变动实验（EMSA）和实时定量PCR等分子生物学实验,初步阐明了其可能起到的作用及相关机制。发现rs3761376等位基因A具有影响刺激素受体结合TFF1启动子的能力。结论:rs3761376等位基因A通过影响雌激素受体与TFF1启动子的结合,降低了TFF1的表达水平,最终导致胃癌发生风险的增加。第二部分TFF1基因多态性与胃癌患者预后的相关性研究研究背景:多项研究提示了基因多态性与癌症预后的关系。这些结果都提示了将SNPs作为肿瘤预后标志物的可行性。目前尚没有研究报道了TFF1多态性位点与胃癌预后的关系。方法与结果:本研究选取了在一阶段样本中与胃癌易感性存在相关性的两个tagSNPs（rs3761376,rs2839488）,通过大样本队列研究,分析了它们同胃癌预后的相关性,发现rs3761376隐性模型是术后化疗患者以及淋巴结转移患者预后不良的标志,而rs2839488的显性模型是术后化疗患者的预后良好标志。此外,通过逐步Cox回归分析,我们还发现rs3761376隐性模型以及淋巴结转移是胃癌术后化疗患者的独立预后因素。结论:rs3761376隐性模型是术后化疗患者以及淋巴结转移患者预后不良的标志,而rs2839488的显性模型是术后化疗患者的预后良好标志。rs3761376隐性模型以及淋巴结转移是胃癌术后化疗患者的独立预后因素。第三部分TFF1与5-FU化疗敏感性的相关研究研究背景:根据我们的前期研究成果,我们发现TFF1 rs3761376 AA基因型可以影响启动子与转录因子的结合能力,进而导致TFF1表达下降;同时该基因型又被发现是影响胃癌术后化疗患者生存的独立危险因素。因此我们推测TFF1可能会影响化疗药物的敏感性。研究方法和结果:通过过表达以及抑制TFF1的表达水平,我们进行了增殖以及凋亡实验,发现TFF1具有影响5-FU诱导的细胞增殖以及凋亡的作用。随后通过m RNA测序,我们筛选出了可能受TFF1表达影响的增殖凋亡相关蛋白BAD、RBL1以及Pyk2。通过实时荧光定量PCR我们确认了这三个蛋白与TFF1的相关性。结论:TFF1可能通过调控BAD、RBL1以及Pyk2的表达来影响5-FU诱导的细胞增殖以及凋亡的作用。
二、c-Ha-ras转基因小鼠的构建与鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、c-Ha-ras转基因小鼠的构建与鉴定（论文提纲范文）
（1）自建Tg.C57-ras V1.0小鼠模型与日本Tg.ras H2小鼠遗传学及其杂交1代生物学特性比较（论文提纲范文）
| 1 两种模型遗传学特性比较 |
| 1.1 模型的构建方式 |
| 1.2 拷贝数分析 |
| 1.3 mRNA表达水平及蛋白表达水平 |
| 1.3.1 两种模型不同组织转入基因，mRNA水平结果: |
| 1.3.2 两种模型肺组织转入基因，蛋白表达水平结果 |
| 2 两种模型的生物学特性比较 |
| 2.1 模型生长曲线 |
| 2.2 血液生理数据 |
| 3 讨论与展望 |
（2）大小鼠模型命名方法与规则简介（论文提纲范文）
| 1 命名体系 |
| 1.1 近交系和远交系 |
| 1.2 自发突变或诱导突变 |
| 1.3 转基因模型 |
| 1.4 基因敲除/敲入模型 |
| 1.5 其他类型模型 |
| 2 基因编辑鼠的一般简写方式 |
| 2.1 基因敲除 |
| 2.2 基因敲入 |
| 2.3 转基因 |
| 2.4 条件性敲除 |
| 3 不同类型的模型命名举例 |
| 4 总结 |
（3）干扰素调节因子-1下调P-糖蛋白的表达逆转胃癌化疗耐药的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 一. 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 裸鼠订购 |
| 1.3 组织标本 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 实验仪器 |
| 二. 实验方法及步骤 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 胃癌化疗耐药细胞株培养 |
| 2.3 转录组测序 |
| 2.4 MTT实验 |
| 2.5 siRNA转染和效果检测 |
| 2.6 P-糖蛋白质粒合成及转染 |
| 2.7 慢病毒制备和转染 |
| 2.8 总蛋白提取和BCA法测蛋白浓度 |
| 2.9 Western Blotting检测 |
| 2.10 总RNA提取和cDNA合成 |
| 2.11 实时荧光定量PCR |
| 2.12 细胞凋亡检测 |
| 2.13 细胞免疫荧光检测 |
| 2.14 染色质免疫共沉淀 |
| 2.15 荧光素酶报告基因 |
| 2.16 裸鼠成瘤实验 |
| 2.17 免疫组织化学染色 |
| 2.18 数据统计与分析 |
| 三. 实验结果 |
| 3.1 胃癌化疗耐药细胞培养 |
| 3.2 IRF-1低表达与胃癌化疗耐药具有相关性 |
| 3.3 IRF-1调节胃癌细胞的化疗耐药性 |
| 3.4 IRF-1调节胃癌细胞中P-糖蛋白的表达 |
| 3.5 IRF-1介导IFN-γ对P-糖蛋白表达的抑制 |
| 3.6 IRF-1抑制P-糖蛋白基因启动子活性 |
| 3.7 IRF-1在裸鼠体内抑制P-糖蛋白表达并逆转化疗耐药 |
| 3.8 临床病理资料显示IRF-1的低表达与胃癌患者P-糖蛋白升高和不良预后相关 |
| 3.9 基于TCGA数据进一步证明了IRF-1与胃癌化疗耐药的相关性 |
| 四. 讨论 |
| 五. 结论 |
| 六. 参考文献 |
| IRF-1的生物学效应及其在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间参与发表的论文 |
| 缩略词表 |
（4）AIM2通过抑制线粒体融合促进非小细胞肺癌生长增殖的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 肺癌概述 |
| 1.1.1 肺癌的发生及分类 |
| 1.1.2 肺癌的分子机理及治疗 |
| 1.2 线粒体与肿瘤 |
| 1.2.1 线粒体的形态结构与功能 |
| 1.2.2 线粒体动态平衡与肺癌的发生发展 |
| 1.2.3 ROS与肿瘤 |
| 1.2.4 线粒体与信号转导 |
| 1.3 AIM2概述 |
| 1.3.1 AIM2的结构与免疫功能 |
| 1.3.2 AIM2与肿瘤的发生发展 |
| 第2章 课题立论依据、技术路线、研究意义 |
| 2.1 立论依据 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 研究意义 |
| 第3章 AIM2在NSCLC组织细胞中高表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞来源与细胞培养 |
| 3.2.2 试剂与配置方法 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Oncomine数据库使用方法 |
| 3.3.2 GEPIA数据库使用方法 |
| 3.3.3 实时定量PCR实验方法 |
| 3.3.4 免疫印迹检测蛋白表达水平 |
| 3.3.5 Kaplan-Meier-plotter数据库使用 |
| 3.3.6 石蜡切片免疫组化 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 AIM2在肺癌及正常肺组织中的表达比较 |
| 3.4.2 AIM2的免疫组化结果 |
| 3.4.3 AIM2高表达与NSCLC的不良预后密切相关 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 第4章 AIM2促进NSCLC细胞体内外生长增殖 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞来源与裸鼠来源 |
| 4.2.2 试剂与配置方法 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 pGreen-AIM2载体构建 |
| 4.3.2 pCDH-AIM2载体构建 |
| 4.3.3 慢病毒包装 |
| 4.3.4 ctrl-sh、AIM2-sh、ctrl、AIM2-oe细胞株的构建 |
| 4.3.5 台盼蓝染色计数法 |
| 4.3.6 克隆形成实验 |
| 4.3.7 软琼脂实验 |
| 4.3.8 免疫印迹检测蛋白表达水平(同3.3.4) |
| 4.3.9 裸鼠体内成瘤实验 |
| 4.3.10 石蜡切片免疫组化(同3.3.6) |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 敲减或过表达AIM2抑制或促进NSCLC细胞生长 |
| 4.4.2 敲减或过表达AIM2抑制或促进NSCLC细胞发生发展 |
| 4.4.3 敲减AIM2抑制小鼠肿瘤发生发展 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 第5章 AIM2发挥炎症小体非依赖作用促进NSCLC生长增殖 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 细胞来源 |
| 5.2.2 试剂与配置方法 |
| 5.2.3 主要仪器设备(同3.2.3) |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 实时定量PCR实验方法 |
| 5.3.2 免疫印迹检测蛋白表达水平(同3.3.4) |
| 5.3.3 裸鼠肿瘤组织免疫印迹 |
| 5.3.4 THP-1细胞诱导分化及刺激 |
| 5.3.5 细胞上清蛋白提取 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 检测炎症因子在正常肺细胞及NSCLC细胞中的表达 |
| 5.4.2 AIM2敲减后炎症因子在NSCLC细胞中的表达 |
| 5.4.3 AIM2与NF-κB |
| 5.5 小结与讨论 |
| 第6章 AIM2定位于NSCLC细胞线粒体 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 细胞来源 |
| 6.2.2 试剂与配置方法 |
| 6.2.3 主要仪器设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 k-NN在线软件 |
| 6.3.2 线粒体提取 |
| 6.3.3 细胞免疫荧光 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.5 小结与讨论 |
| 第7章 AIM2作用于MFN2调控NSCLC细胞线粒体动态平衡 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料 |
| 7.2.1 细胞来源 |
| 7.2.2 试剂与配置方法 |
| 7.2.3 主要仪器设备 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 pDsRed2-Mito细胞株的构建 |
| 7.3.2 透射电镜制样 |
| 7.3.3 免疫印迹检测蛋白表达水平(同3.3.4) |
| 7.3.4 石蜡切片免疫组化(同3.3.6) |
| 7.4 实验结果 |
| 7.4.1 AIM2调控NSCLC细胞线粒体动态平衡 |
| 7.4.2 AIM2作用于MFN2调控线粒体的融合 |
| 7.5 小结与讨论 |
| 第8章 线粒体动态平衡调控NSCLC细胞生长增殖 |
| 8.1 引言 |
| 8.2 实验材料 |
| 8.2.1 细胞来源 |
| 8.2.2 试剂与配置方法(同3.2.2) |
| 8.2.3 主要仪器设备(同3.2.3与6.2.3) |
| 8.3 实验方法 |
| 8.3.1 pGreen-MFN2、pGreen-DRP1载体构建 |
| 8.3.2 pCDH-MFN2、pCDH-DRP1载体构建 |
| 8.3.3 免疫印迹检测蛋白表达水平(同3.3.4) |
| 8.3.4 台盼蓝染色计数法(同4.3.5) |
| 8.3.5 克隆形成实验(同4.3.6) |
| 8.4 实验结果 |
| 8.4.1 MFN2敲减促进NSCLC细胞生长增殖 |
| 8.4.2 MFN2过表达抑制NSCLC细胞生长增殖 |
| 8.4.3 DRP1敲减抑制NSCLC细胞生长增殖 |
| 8.4.4 DRP1过表达促进NSCLC细胞生长增殖 |
| 8.4.5 MFN2敲减恢复AIM2敲减引起的NSCLC细胞生长抑制 |
| 8.5 小结与讨论 |
| 第9章 AIM2调控线粒体动态平衡调节MAPK/ERK信号通路 |
| 9.1 引言 |
| 9.2 实验材料 |
| 9.2.1 细胞来源 |
| 9.2.2 试剂与配置方法 |
| 9.2.3 主要仪器设备(同3.2.3) |
| 9.3 实验方法 |
| 9.3.1 磷酸化蛋白质激酶芯片 |
| 9.3.2 免疫印迹检测蛋白表达水平(同3.3.4) |
| 9.4 实验结果 |
| 9.4.1 AIM2调控MAPK/ERK信号通路 |
| 9.4.2 MAPK/ERK信号通路调控线粒体动态平衡 |
| 9.5 小结与讨论 |
| 第10章 线粒体动态平衡调控ROS进而调节MAPK/ERK信号通路 |
| 10.1 引言 |
| 10.2 实验材料 |
| 10.2.1 细胞来源 |
| 10.2.2 试剂与配置方法 |
| 10.2.3 主要仪器设备(同3.2.3与6.2.3) |
| 10.3 实验方法 |
| 10.3.1 免疫印迹检测蛋白表达水平(同3.3.4) |
| 10.3.2 ROS测定 |
| 10.3.3 siRNA设计及转染 |
| 10.4 实验结果 |
| 10.4.1 MFN2调控ROS产生 |
| 10.4.2 ROS调控MAPK/ERK信号通路 |
| 10.5 小结与讨论 |
| 第11章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
（5）基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因小鼠的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物: |
| 1.1.2 主要仪器及试剂: |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 基于Cre-Lox P系统的人源hRas基因条件性定点敲入小鼠模型的载体构建: |
| 1.2.2 电击转染ES细胞: |
| 1.2.3 ES细胞阳性克隆的筛选和Southern blot鉴定: |
| 1.2.4 囊胚注射制备嵌合体小鼠: |
| 1.2.5 杂合hRasfl/+小鼠的繁育: |
| 1.2.6 全身细胞表达人源hRas基因的基因敲入小鼠的建立: |
| 1.2.7 hRas-EIIa-cre全身表达敲入小鼠基因表达量测定: |
| 1.2.8 总RNA的提取以及逆转录反应: |
| 1.2.9 荧光定量RT-PCR (qRT-PCR) 检测基因表达水平: |
| 2 结果 |
| 2.1 打靶载体的构建及其中人源hRas基因的鉴定 |
| 2.2 同源重组ES细胞克隆的Southern blot鉴定 |
| 2.3 阳性ES克隆囊胚注射、嵌合体雄鼠繁育得到hRasfl/+基因敲入小鼠 |
| 2.4 hRasfl/fl EIIa-cre基因敲入小鼠的繁殖及基因表达水平结果 |
| 2.5 不同日龄hRas-EIIa-cre基因敲入小鼠胚胎期hRas基因表达水平检测 |
| 3 讨论 |
（6）条件性敲除β-catenin在肝癌发生中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 一、肝细胞癌 |
| 二、水动力转染技术诱导鼠肝癌模型 |
| 三、β-catenin在HCC中的作用 |
| 第一部分 肝细胞条件性敲除β-catenin对小鼠肝脏发育的影响 |
| 一、实验材料与仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分 肝细胞条件性敲除β-catenin对小鼠HCC发生的影响 |
| 一、实验材料与仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 肝细胞条件性敲除β-catenin对肝脏基因表达谱的影响 |
| 一、实验材料与仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第四部分 肝细胞条件性敲除β-catenin对HCC相关信号通路的影响 |
| 一、实验材料与仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第五部分 肝细胞条件性敲除β-catenin对小鼠肝脏炎症的影响 |
| 一、实验材料与仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 在读期间发表论文及参与科研工作说明 |
| 致谢 |
（7）Tg（cyp1a:mCherry）转基因斑马鱼的构建及其对环境中POPs监测的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 环境中持续性有机污染物污染现状 |
| 1.1.2 生物监测国内外研究现状 |
| 1.1.3 鱼类cyp1a作为生物标志物研究进展 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 第二章 cyp1a启动子的克隆及其功能验证 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 菌种、细胞系和试验动物 |
| 2.2.2 主要试剂与试剂盒 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 试剂配制 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 cyp1a基因启动子克隆 |
| 2.3.2 I-SceI-cyp1a promoter-mCherry和I-SceI- cyp1a promoter-Luciferase质粒构建 |
| 2.3.3 细胞验证 |
| 2.3.4 胚胎瞬时验证 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 cyp1a启动子序列 |
| 2.4.2 质粒构建结果 |
| 2.4.3 细胞验证结果 |
| 2.4.4 斑马鱼胚胎瞬时验证结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 成功获得斑马鱼cyp1a启动子 |
| 2.5.2 成功构建携带I-SceI识别位点的I-SceI-cyp1a promoter-mCherry质粒 |
| 2.5.3 试验所得的cyp1a启动子具有TCDD浓度依赖效应 |
| 第三章 转荧光斑马鱼制作及荧光蛋白基因插入位点和拷贝数分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 转荧光斑马鱼F0代的制作 |
| 3.3.2 转荧光鱼F0代筛选 |
| 3.3.3 利用F1代转荧光斑马鱼进行雌核发育快速获得纯合子 |
| 3.3.4 转荧光斑马鱼荧光基因插入位点分析 |
| 3.3.5 利用绝对定量分析转红色荧光蛋白斑马鱼外源基因插入拷贝数 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 转荧光斑马鱼筛选 |
| 3.4.2 雌核发育快速获得转荧光斑马鱼纯合子 |
| 3.4.3 转红色荧光蛋白斑马鱼插入位点 |
| 3.4.4 转红色荧光蛋白斑马鱼拷贝数 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 成功获得5个可稳定遗传的转基因斑马鱼品系 |
| 3.5.2 利用雌核发育的方法快速获得转基因斑马鱼纯合子 |
| 3.5.3 获得转基因斑马鱼品系CM2和CM3的插入位点和拷贝数 |
| 第四章 转荧光斑马鱼的功能验证及对环境中持续性有机污染物的监测研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 化学试剂 |
| 4.2.2 试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 利用TCDD暴露转红色荧光蛋白斑马鱼荧光诱导效果验证 |
| 4.3.2 转红色荧光蛋白斑马鱼荧光表达与自身cyp1a基因表达的关系 |
| 4.3.3 转红色荧光蛋白斑马鱼胚胎发育不同时期对TCDD响应效果分析 |
| 4.3.4 不同PAHs对转红色荧光斑马鱼荧光诱导效果验证 |
| 4.3.5 三峡流域不同区段水样暴露效果验证 |
| 4.3.6 巴基斯坦卡拉奇电子垃圾回收站点土样浸提液暴露 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 红色荧光蛋白斑马鱼对TCDD的响应效果 |
| 4.4.2 红色荧光蛋白的表达与cyp1a基因表达的关系 |
| 4.4.3 转红色荧光蛋白斑马鱼胚胎发育不同时期红色荧光诱导效果 |
| 4.4.4 5种PAHs对转红色荧光斑马鱼荧光诱导效果验证 |
| 4.4.5 三峡流域水样和电子垃圾回收站附近土样提取液暴露结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 不同品系转荧光斑马鱼荧光诱导效果不同 |
| 4.5.2 红色荧光蛋白表达与其内源基因cyp1a表达具有时间和空间上的一致性 |
| 4.5.3 不同PAHs诱导转红色荧光蛋白斑马鱼荧光表达效果不同 |
| 4.5.4 转红色荧光蛋白斑马鱼能实现对环境中PAHs的有效监测 |
| 第五章利用截短的cyp1a基因启动子、Gal4/UAS系统及TALE-TF转录激活系统提高监测敏感性研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 cyp1a基因启动子截短分析 |
| 5.3.2 Gal4/UAS系统构建 |
| 5.3.3 TALE-TF转录激活系统构建 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 cyp1a启动子截短信号增强效果分析 |
| 5.4.2 利用Gal4/UAS系统增强cyp1a启动子转录活性分析 |
| 5.4.3 利用TALE-TF转录激活效应提高cyp1a启动子转录活性 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 截短的 8XRE启动子可以显着增强其转录活性 |
| 5.5.2 Gal4/UAS系统可以显着提高cyp1a启动子的转录活性 |
| 5.5.3 TALE-TF转录激活系统能显着提高cyp1a启动子的转录活性 |
| 第六章利用卵子注射技术提高基因编辑效率 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 斑马鱼培育 |
| 6.3.2 gRNA、Cas9 mRNA和mCherry mRNA合成 |
| 6.3.3 卵子体外保存液的配制 |
| 6.3.4 卵子显微注射与体外授精 |
| 6.3.5 T7EI检测和测序分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 卵子保存液体外保存效果 |
| 6.4.2 体外保存时间与孵化率的关系 |
| 6.4.3 卵子具有翻译功能 |
| 6.4.4 显微注射和Cas9/gRNA对卵子受精率和孵化率的影响 |
| 6.4.5 利用卵子注射技术提高Cas9/gRNA的基因敲除效率和传代效率 |
| 6.4.6 利用卵子注射技术可以显着提高Cas9/gRNA的基因敲入效率 |
| 6.5 讨论 |
| 6.5.1 试验所用卵子保存液可以有效体外暂存卵子并维持其受精能力 |
| 6.5.2 利用卵子注射技术可以显着提高CRSPIR/Cas9的基因编辑效率 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：在读期间发表的学术论文及研究成果 |
（8）qPCR检测转基因水稻拷贝数以及拷贝数与农艺性状关系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 转基因水稻的研发 |
| 1.1. 转基因技术 |
| 1.2. 水稻遗传转化 |
| 1.3. 转基因水稻育种进展 |
| 2. 基因拷贝数检测方法 |
| 2.1. Sohern Blotting |
| 2.2. 荧光原位杂交(FISH) |
| 2.3. qPCR |
| 2.4. 数字定量PCR |
| 2.5. 高通量测序 |
| 3. 转基因作物外源基因与农艺性状研究 |
| 3.1. 外源基因表达与目标性状遗传稳定性 |
| 3.2. 转基因作物的农艺性状变异 |
| 3.3. 适合度相关农艺性状与转基因作物生态安全风险 |
| 3.4. 外源基因拷贝数与农艺性状变异 |
| 第二章 SYBR Green染料法qPCR中质粒标准品与基因组DNA在构建标准曲线一致性研究 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1. 实验材料 |
| 1.2. 实验方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1. pBS质粒构建与验证 |
| 2.2. 三种标准物质质控 |
| 2.3. 基因组DNA浓度 |
| 2.4. 标准曲线构建结果分析 |
| 2.5. 三种标准物质△Ct值比较 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 转基因水稻Bar基因拷贝数与适合度性状的研究 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1. 实验材料 |
| 1.2. 实验方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1. 亲代与子代插入位点检测 |
| 2.2. 亲代与子代Bar基因拷贝数检测 |
| 2.3. 子代群体间农艺性状差异 |
| 2.4. 不同Bar基因拷贝间农艺性状差异 |
| 2.5. Bar基因拷贝数与农艺性状相关性分析 |
| 3. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）C57-ras转基因小鼠模型杂交1代CB6F1的生长发育特性（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1. 1 实验动物及实验环境 |
| 1. 2 仪器及试剂 |
| 1. 3 动物交配方式 |
| 1. 4 生长发育测定指标 |
| 1. 5 PCR 反应扩增检测杂合 CB6F1 小鼠基因型 |
| 1. 6 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2. 1 野生型 BALB / c J 雌鼠见栓率、受孕率及检栓成功率 |
| 2. 2 BALB / c J 雌鼠窝产子数,仔鼠的性别比及离乳数 |
| 2. 3 CB6F1 仔鼠的哺乳期窝重及单只仔鼠重 |
| 2. 4 生长鼠的生长发育情况测定 |
| 2. 5 基因型检测阳性率 |
| 3 讨论 |
（10）TFF1基因多态性与胃癌遗传易感性及预后的相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 序言 |
| 第一部分 TFF1 基因多态性与胃癌发生风险的相关性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 TFF1 基因多态性与胃癌患者预后的相关性研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 TFF1与5-FU化疗敏感性的相关研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录一 论文缩略词中英文对照 |
| 发表论文情况 |
| 致谢 |
四、c-Ha-ras转基因小鼠的构建与鉴定（论文参考文献）
- [1]自建Tg.C57-ras V1.0小鼠模型与日本Tg.ras H2小鼠遗传学及其杂交1代生物学特性比较[J]. 刘苏苏,曹愿,杨艳伟,王辰飞,王三龙,范昌发. 实验动物科学, 2021(04)
- [2]大小鼠模型命名方法与规则简介[J]. 曹愿,岳秉飞,柳全明,范昌发. 中国比较医学杂志, 2020(04)
- [3]干扰素调节因子-1下调P-糖蛋白的表达逆转胃癌化疗耐药的研究[D]. 袁京生. 华中科技大学, 2019(03)
- [4]AIM2通过抑制线粒体融合促进非小细胞肺癌生长增殖的作用及机制研究[D]. 祁苗. 陕西师范大学, 2019(06)
- [5]基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因小鼠的建立[J]. 刘苏苏,吴曦,周舒雅,王辰飞,左琴,李保文,范昌发. 实验动物科学, 2018(04)
- [6]条件性敲除β-catenin在肝癌发生中的作用及机制研究[D]. 冯韵. 第二军医大学, 2017(05)
- [7]Tg（cyp1a:mCherry）转基因斑马鱼的构建及其对环境中POPs监测的研究[D]. 谢少林. 华南农业大学, 2017(08)
- [8]qPCR检测转基因水稻拷贝数以及拷贝数与农艺性状关系的研究[D]. 张虎. 南京农业大学, 2016(02)
- [9]C57-ras转基因小鼠模型杂交1代CB6F1的生长发育特性[J]. 刘苏苏,吴曦,周舒雅,王辰飞,彭泽旭,左琴,李保文,贺争鸣,范昌发. 中国比较医学杂志, 2015(04)
- [10]TFF1基因多态性与胃癌遗传易感性及预后的相关研究[D]. 汪未知. 南京医科大学, 2015(05)