一、HVT国内株的分离鉴定（论文文献综述）
罗晓平[1]（2021）在《绵羊捻转血矛线虫耐药性调查及耐IVM候选基因的筛选与分析》文中研究指明捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）作为全球分布且严重危害反刍动物的寄生虫之一,近年来在世界范围内对防控药物的耐药性不断加剧,给全球畜牧业造成重大经济损失。内蒙古作为我国肉羊主产区,生产模式正在向多元化转变,不同饲养模式下绵羊捻转血矛线虫感染状况及其对常用驱虫药物耐药现状是否一致还尚不清楚,尤其是捻转血矛线虫对伊维菌素耐药机理至今没有统一定论,已发现的耐药基因是否适用于国内现场虫株的耐药性检测知之甚少。为此,本论文从生产实际出发,首先开展内蒙古不同养殖模式下,绵羊捻转血矛线虫感染状况及其对常用驱虫药物的耐药性调查;在此基础上,对捻转血矛线虫耐伊维菌素虫株及敏感虫株进行了分离鉴定,并就分离株耐阿苯达唑情况及已报道的与伊维菌素耐药相关基因表达进行了分析;最后,通过现代分子生物学技术,筛选出了与捻转血矛线虫耐伊维菌素相关的新基因。上述研究内容为制定不同生产模式下捻转血矛线虫的防控策略提供了基础数据,同时也为研究国内捻转血矛线虫对常用驱虫药物的耐药机制提供了虫种资源,更为发现用于评估和检测捻转血矛线虫耐药新基因提供了理论依据。所取得的具体研究结果如下:（1）首先对绵羊胃肠道线虫感染情况进行了调查。结果表明:羊只所感染的优势线虫为捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）,其在纯舍饲条件下的牧场感染率为0;在纯放牧模式下,羊群捻转血矛线虫感染则最为严重,平均感染率达到了94.1%,且EPG≥1000的羊只平均占比达到了24.1%;而半舍饲模式下羊群感染状况则介于两者之间,感染率为27.0%～100%,EPG≥1000的羊只平均占比为12.9%。其次,通过粪便虫卵减少试验,了解了纯放牧及半舍饲模式下捻转血矛线虫对常用驱虫药的耐药现状,结果显示,85.7%的群体对伊维菌素耐药;75.0%的群体对阿苯达唑耐药;但60.0%的群体对氯氰碘柳胺钠敏感;且部分种群对伊维菌素和阿苯达唑呈现双重耐药现象。上述结果为筛选适用于本地捻转血矛线虫防控的敏感高效驱虫药物和制订不同防控方案及兽医临床用药指导提供了依据。（2）针对本地区捻转血矛线虫耐药性严重的问题,为进一步弄清已报道基因是否适用于现场虫株的耐药性检测,采用国际通用方法,开展了国内捻转血矛线虫耐伊维菌素虫株的分离,并对其耐药程度进行了分析,结果成功分离到了3个对伊维菌素和阿苯达唑双重耐药的虫株及1个敏感虫株。其中编号为WSHc-001、WSHc-003及CYHHc-136虫株对伊维菌素的耐药比率分别为5.82、26.00和11.26;对阿苯达唑的EC50值均大于0.1μg/m L,鉴定为双重耐药株。编号为YCHc-022虫株对伊维菌素的耐药比率仅有0.89,阿苯达唑的EC50值则小于0.1μg/m L,为双重敏感虫株。其次,通过直接测序技术,对上述分离虫株的Ⅰ型β微管蛋白基因多态性进行分析,结果显示:所有耐药分离株种群内有超过10%的个体携带198位点纯合耐药基因型;有超过10%的个体在198位点和200位点同时存在杂合子基因型。而在敏感分离株中,这2个指标均低于10%。最后,采用RT-q PCR方法,对捻转血矛线虫各分离株P-gps基因的表达情况进行了检测,结果表明:对不同虫株间比较而言:在未用药刺激情况下,国际耐伊维菌素虫株中的P-gp1、P-gp2、P-gp3、P-gp11及P-gp12基因表达均较国际敏感虫株显着升高;但对于现场分离的耐药虫株而言,只有P-gp1和P-gp11的表达量较国际敏感虫株显着升高;而P-gp2、P-gp3、P-gp9及P-gp12较国际敏感虫株表达量显着下调。使用药物刺激后,与国际敏感虫株相比,各耐药虫株只有P-gp12在药物刺激后显着升高,其余几种P-糖蛋白则没有统一的变化规律。对同一虫株用药前后比较,发现在国际虫株和分离虫株之间存在明显的表达差异。该研究成果证实了利用现有耐药性标记分子在进行不同地理环境下的捻转血矛线虫耐药性检测时,其结果会有所差异。（3）为筛选适用于捻转血矛线虫耐伊维菌素检测的新基因,采用基于2b-Rad测序技术的全基因组单核苷酸多态性（SNP）分析方法,以捻转血矛线虫国际耐药虫株和敏感虫株作为研究对象,在基因组中筛选潜在的与捻转血矛线虫耐伊维菌素相关的基因。最终,获得了9个可能具有伊维菌素定向选择特征的基因,其中7个可能编码一些耐药相关功能蛋白。进一步采用PCR直接测序技术对筛选出的3个耐伊维菌素候选相关基因的单核苷酸多态性进行了验证。结果分析并确定了1个捻转血矛线虫耐伊维菌素相关候选功能基因HCOI00506600及1个可作为伊维菌素耐药性诊断的候选标记分子HCOI01200700;也证实了基于2b-Rad测序技术的全基因组单核苷酸多态性分析方法在开展捻转血矛线虫耐药性候选基因筛选中的有效性。
陈娟[2]（2020）在《副猪嗜血杆菌贵州株的分离鉴定及生物学特性研究》文中研究指明副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是一种定殖于猪上呼吸道的条件性致病菌,其感染引起的副猪嗜血杆菌病（也称革拉瑟氏病,Gl?sser’s disease）主要以多发性纤维素性浆膜炎和关节炎为特征,呈世界性分布。近年来,在PCV2、PRRSV、霉菌毒素等导致免疫抑制作用的“底色病”的影响下,副猪嗜血杆菌病的发病率和死亡率持续性上升,其流行呈上升趋势,危害日渐严重。随着抗生素的逐步禁用,疫苗接种和强化饲养管理将是今后预防和控制HPS感染的主要措施。由于HPS具有明显的地方性流行特征,且血清型复杂,不同血清型菌株间的交叉保护性较低,因此分离鉴定不同地区感染流行的HPS菌株,不仅有利于全面了解该病的流行病学特征,还可以为该病的疫苗研究提供合适的候选菌株。因此,本研究对2018～2019年来自贵州省部分区县送检的14份HPS阳性样品进行了HPS的分离与鉴定,并对分离鉴定纯化的菌株进行了部分生物学特性研究,旨在丰富贵州省HPS感染流行菌株的流行病学资料,为进一步开展HPS的病原学及疫苗研究奠定基础。相关研究内容如下:1.HPS的分离与鉴定实验首先对贵州省部分区县2018～2019年期间送检的124份样品（血液,鼻腔拭子,脾脏、肺脏等）,经含5μg/m L NAD的TSA培养基增菌后,提取混合菌液核酸,应用HPS 16S r RNA特异性引物进行PCR扩增测序。结果显示,其中14份样品为HPS阳性（均为肺脏增菌菌液）,其核苷酸相似性为98.1%～100%,且分属于5个不同的进化分支。阳性样品中与病毒混合感染的检测结果表明,HPS分别与PCV2、CSFV及PRRSV混合感染率均为42.9%;HPS与PCV2、CSFV、PRRSV三种病毒形成四重混合感染率为7.1%（1/14）,HPS单一感染率仅为14.2%（2/14）。通过对阳性菌液挑取单菌落,多代分离纯化后,最终分离获得了3株HPS分离菌株。3株HPS菌株在TSA固体培养基和血液琼脂培养基上均呈表面光滑整齐的半透明针尖样菌落,革兰氏染色为革兰氏阴性杆菌,其中HPS/CN/Guizhou/426株和HPS/CN/Guizhou/478株均呈短杆状,HPS/CN/Guizhou/449株呈短杆状和长丝状,符合HPS的多形性特点。生化鉴定结果表明3株HPS菌株对甘露糖、甘露醇、木糖、尿素、覃糖等呈阴性反应,对蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、硝酸盐还原、新生霉素、乳糖等呈阳性反应,亦均符合HPS的生化反应特征。卫星试验结果表明,3株HPS分离菌株均可与金黄色葡萄球菌在血液琼脂培养基的卫星现象不明显。纯化后的3株HPS经16S r RNA特异性引物,再次PCR扩增测序,所得序列与之前相应序列的比对结果表明,其核苷酸相似性均为100%。2.HPS分离菌株的生物学特性研究为了解3株HPS分离纯化菌的生物学特性,实验分别对其进行了培养特性、NAD依耐性、血清型PCR鉴定及药物敏感性试验等主要生物学特性研究。研究结果显示,3株HPS菌株均具有严格的NAD依赖性,在胎牛血清含量均为5%时,NAD浓度小于16μg/m L时,TSB液体培基中菌液OD600nm值与NAD浓度呈正比。因此,实验确定的最佳NAD添加量为16μg/m L。3株HPS分离纯化菌株在SS培养基、LB固体培养基、TSA固体培养基（不含胎牛血清和NAD）、改良Y培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基及蔡氏琼脂培养基上均不生长,在分别含有16μg/m L NAD和5%胎牛血清的LB固体培养基以及TSA培养基上均生长,在无NAD的血平板上培养24 h后出现米白色针尖样小菌落。应用Howell和Jia的报道等报导的HPS血清型PCR鉴定引物,分别对3株HPS分离菌株进行血清型PCR鉴定,仅血清5型特异性引物扩增出了与预期大小相符的目的条带,表明3株HPS分离纯化菌株均为血清5型。3株HPS分离纯化菌株相关毒力基因检测结果显示,HPS/CN/Guizhou/XYPA/2018426菌株和HPS/CN/Guizhou/BJXXW/2018478菌株含毒力基因MPB,扩增出了与预期扩增条带大小相符的片段,HPS/CN/Guizhou/QNDS/2018449菌株含毒力基因E30。药敏试验结果显示3株HPS分离纯化菌株,均对恩诺沙星和氟苯尼考敏感,对环丙沙星、新霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、磺胺异恶唑、甲氧苄氨嘧啶、复方新诺明、克林霉素、奥格门汀、头孢他啶等抗生素均已耐药。
赵硕,王若木,党佳佳,许力士,秦树英,薛辉,韦祖樟,陈樱,欧阳康,黄伟坚[3]（2020）在《2013—2018年广西地区猪伪狂犬病病毒gB、gE与TK基因遗传变异分析》文中认为为了解广西近年猪伪狂犬病（PR）流行情况及猪伪狂犬病病毒（PRV）流行株gB、gE、TK基因的遗传变异特点,于2013—2018年采集广西各地区疑似PR发病猪靶组织714份,进行PRV的PCR检测及病毒分离鉴定,并运用DNAStar、MEGA 6.0等生物学软件对分离毒株gB、gE、TK基因进行遗传变异分析。结果显示:样品检测阳性率为24.5%（175/714）,共分离获得PRV流行株38株。受检猪群普遍存在PRV感染,经典毒株及变异毒株并存,而且以变异毒株为主。广西流行株不同亚群PRV在gB、gE、TK基因上均存在相同的氨基酸变异特点,与国内变异株亲缘关系较近。推测广西流行株存在两种不同重组变异形式产生的PRV重组毒株,分别为疫苗株gB基因和变异株gE基因重组产生的重组毒株,以及经典株的TK基因被疫苗株（HB98）的TK基因替换而产生的重组毒株。近年广西受检猪场较普遍存在PRV感染,而且PRV流行株以变异毒株为主,可能存在两种不同重组变异形式产生的重组毒株,猪场需重视及实施针对性PR免疫防控计划。
周孟云,陈利苹,宋家升,杨倩[4]（2020）在《杭州地区猫杯状病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析》文中进行了进一步梳理猫杯状病毒（feline calicivims, FCV）是引起猫呼吸道疾病的一种常见病原,呈世界性分布,常在猫群中爆发流行。为了解我国FCV的流行情况及分子生态学特征,本研究对杭州地区收集的48份疑似FCV感染病料,进行了PCR鉴定、病毒分离培养,以及基于VP1基因序列的系统发育树分析。RT-PCR鉴定的结果显示,有32份病料可判为阳性;这32份病料接种的F81细胞,均出现明显的细胞病变。VP1基因序列分析显示,32株分离毒间的核苷酸同源性为69.2%～99%,氨基酸同源性为82.1%～99.9%。与国外分离株相比,32株分离株同国内分离株的同源性更高。系统发育树分析显示,32株分离株有12株与国内分离株遗传关系较近,15株与英国株遗传关系较近,别外4株与多国分离株形成独立分支。对VP1 D-E区的B细胞线性表位分析发现,D区和conE区的2个表位比较保守,而5′HRV区的表位存在较大变异。尽管32个毒株分离于同一地区和相近的时间段,主要抗原VP1基因差异仍然较大,多数达20%～30%不等。以上结果表明,FCV在杭州地区广泛流行,且呈现明显的遗传多样性,给病毒的分子流行病学监测和疫苗防控带来巨大挑战。
刘盼盼[5]（2020）在《鸭源鸡杆菌tolC基因缺失株的构建及生物学特性分析》文中认为鸭源鸡杆菌（Galllibacterium anatis,G.anatis）属于革兰氏阴性菌鸡杆菌属代表种,常定居于家禽的呼吸道和生殖道。它是卵巢炎、输卵管炎和腹膜炎以及母鸡的产蛋量下降、死亡的重要原因,由于多重耐药性的普遍存在且本身抗原多样性的存在,使得传统的抗菌治疗及疫苗防预效果不理想,严重影响了世界家禽产业的动物福利和总体生产力,对养禽业造成很大的经济损失。目前,对鸭源鸡杆菌的毒力因子及其致病机理的研究已成国内外研究的热点。TolC蛋白是一种广泛存在于革兰氏阴性菌中的外膜通道蛋白,已在多种病原菌中被鉴定为重要的毒力因子,解析鸭源鸡杆菌TolC同源蛋白在该菌中的生物学功能对其致病机制研究具有重要意义。本研究首先分析了tolC基因在鸭源鸡杆菌各分离菌株中分布情况,然后以临床分离株Yu-PDS-RZ-1-SLG（RZ）为研究材料,预测分析TolC同源蛋白在鸭源鸡杆菌的定位、各级结构及线性B细胞抗原表位,并分析其免疫原性;最后构建鸭源鸡杆菌tolC基因缺失株（RZΔtolC）,并探究其生物学特性。具体工作如下:1.鸭源鸡杆菌tolC基因扩增及生物信息学分析参考GenBank中鸭源鸡杆菌UMN179基因组信息,查找tolC基因及其上下游序列,设计特异性通用扩增引物,PCR扩增28株鸭源鸡杆菌tolC基因并测序,对其存在状态分析。并以临床分离株Yu-PDS-RZ-1-SLG为研究对象,对鸭源鸡杆菌TolC同源蛋白进行氨基酸序列、理化性质、信号肽及结构域分析以及线性B细胞抗原表位的预测。结果表明,tolC基因在各鸭源鸡杆菌中普遍存在,且具有较高的保守性;鸭源鸡杆菌TolC同源蛋白在N端1～21aa处存在一个α螺旋结构的信号肽序列,定位于细胞膜;TolC同源蛋白为三个单体形成的长桶状结构,其氨基酸序列只存在个别氨基酸突变;各分离株具有相同的B细胞抗原表位,它们可能具有交叉免疫原性:该研究为鸭源鸡杆菌检测方法建立、新型疫苗研制及TolC同源蛋白生物学功能的研究奠定基础。2.鸭源鸡杆菌tolC基因原核表达及抗原性鉴定应用PCR技术扩增tolC基因片段（无信号肽）,连入原核表达质粒pET-28a构建原核表达载体,转化BL21后,使用IPTG成功诱导得到高效表达的TolC同源蛋白包涵体,经纯化后免疫家兔获得抗TolC同源蛋白的多克隆抗血清,并通过Western blotting对其免疫原性进行初步鉴定。结果显示,重组TolC同源蛋白具有良好的免疫原性,且获得的抗TolC同源蛋白多抗能够与不同分离株发生免疫反应,说明鸭源鸡杆菌TolC同源蛋白具有交叉保护能力的潜能,有利于鸭源鸡杆菌血清学检测方法的建立,也为后续鸭源鸡杆菌tolC基因缺失株的验证提供支持。3.鸭源鸡杆菌tolC基因敲除株的构建及生物学特性分析参考GenBank中鸭源鸡杆菌UMN179（NC015460.1）基因组信息,扩增RZ株tolC及其上下基因并进行测序,根据测序结果设计上、下游同源臂引物。将上、下游同源臂与卡那霉素抗性盒子分别连入pMD18-T载体,构建重组质粒pMD1 8-S-K-X,并设计特异性引物扩增S-K-X DNA片段。将S-K-X DNA片段通过自然转化法成功转入制备的鸭源鸡杆菌感受态,卡那抗性筛选获得tolC基因缺失株RZΔtolC,并对RZ、RZΔtolC生长特性、生物被膜形成能力、MIC及鸡输卵管原代细胞黏附能力进行测定。结果显示,RZΔtolC对数生长期延迟,且整体生长速度较RZ株慢;RZΔtolC株生物被膜形成能力较RZ株弱,且差异显着;RZΔtolC株对磷霉素的MIC值下降32倍,卡那霉素上升16倍,新霉素上升2倍,多西环素下降4倍。鸭源鸡杆菌RZΔtolC株的构建及其生物学特性分析为探索鸭源鸡杆菌TolC功能及鸭源鸡杆菌致病机理和耐药相关机制的阐明奠定了基础。
易可可[6]（2019）在《猪伪狂犬病病毒的分离鉴定和比较基因组学分析》文中研究说明伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）引起的一种传染病,又称奥耶斯基氏病（Aujeszky’s Disease,AD）,引起猪出现高热、腹泻、沉郁厌食、精神、神经紊乱等临床症状,传染性强,给畜牧业带来巨大的经济损失。借鉴部分欧美国家成功净化伪狂犬病的经验,我国引入了Bartha-K61疫苗并广泛运用于临床,有效地控制了猪伪狂犬病。但自2011年底始,许多免疫过疫苗的规模化猪场爆发伪狂犬病,gE抗体由阴转阳,出现由伪狂犬病毒引起所谓的“流产风暴”,对我国养猪业造成严重影响。多数学者认为该次伪狂犬病的全国性暴发可能与病毒毒力变强、基因变异等因素有关,究其原因尚没有确定。本实验从四川和福建疑似PRV感染的病料中成功分离4株伪狂犬病毒,分别命名为FJ01、FJ03、MS2018和YK株,滴度分别为10-6.63、10-7.08、10-8.1和10-7.18TCID50s/0.1mL。Balb/c小鼠毒力实验结果显示,LD50分别为102.17、102.72、103.51和103.44TCID50s,FJ01毒力最强;除YK株外,其他三株病毒均使小鼠产生严重瘙痒症状。疫苗血清中和实验结果显示,YK毒株中和效价为1:512,显着高于FJ01、FJ03和MS2018毒株,中和效价分别为1:64,1:16,1:32。对4个PRV毒株的主要免疫原性基因和毒力相关基因gB、gC、gE和TK进行扩增和测序,分析其核苷酸与氨基酸同源性并建立进化树,结果显示,无论在核苷酸还是氨基酸水平,FJ01、FJ03和MS2018三个毒株的gB、gC、gE和TK基因与2011年后分离的变异株（TJ、HNX株等）同源性更高,与Fa株比对核苷酸同源性达到96.9%-100%,氨基酸同源性达到98.9%-100%,在进化关系上虽然同属于中国毒株在内的大分支,但与Fa属于不同的进化亚枝,这也在基因水平上说明变异毒株的抗原可能发生了变化;YK毒株gB、gC、gE和TK基因与Bartha株比对核苷酸同源性在98.6%-99.7%,氨基酸同源性在97.8%-99.7%,YK在进化关系上与国外毒株在同一大分支上,与Kaplan亲缘性最近。根据分离毒株的抗原基因进化关系和毒力强弱,我们挑选毒力最强的FJ01株和主要毒力基因进化关系与国外毒株更接近的YK毒株进行PacBio三代测序,测得全长分别为145465bp和142576bp,GC含量为73.53%和73.64%,均编码70个基因,与以前测得PRV基因组结构相同,由独特长区（UL）、独特短区（US）、内部重复序列（IRs）和末端重复序列（TRs）组成。将FJ01和YK株分别与参考序列进行全基因组比对和编码基因同源性分析发现:FJ01全基因组的核苷酸序列与2011年后分离的变异株同源性为96.36%-98.06%,与2011年前分离的毒株同源性为96.36%-96.86%;YK株与Kaplan株同源性最高,可达97.72%,而与其他毒株均低于95%,两个毒株的差异均主要在非编码基因区域。YK株与Kaplan大部分基因同源性为100%,但在UL36、UL47和US1中有数十个氨基酸的连续缺失和插入。全基因组进化分析显示:FJ01株进化关系更靠近HNX和HNB的亚分支;YK株与Kaplan位于同一个分支,可见YK毒株在全基因组进化水平上更接近国外毒株,间接证明毒株抗原不同于国内毒株,这也与前面疫苗血清中和抗体实验结果相一致。利用RDP4软件对FJ01和YK毒株全基因组进行重组分析,均发现重组信号:FJ01在121004bp到135532bp之间发生了重组,该区域亲本株为HLJ8和TJ株,6种重组分析算法支持该结果;YK在66201bp到66735bp之间与Kaplan株具有相同的亲本株-Becker,与新变异株HNX株发生了重组,有5种算法支持该结果。此外,分析免疫原性基因、毒力相关基因和同源性差异较大的基因重组情况,发现YK在UL36与UL47区分别和Becker与Ea发生重组。基因重组的现象对研究PRV进化变异有重要意义。综上所述,本实验分离了4株PRV毒株,测定了其对小鼠毒力;测定了其中2株的全基因组序列,并分析了基因组特性,发现了分离株具有基因重组情况的发生,为猪伪狂犬病毒的进一步研究提供了参考。
张中华[7]（2019）在《猪伪狂犬病毒HNJY的分离鉴定及其生物学特性分析》文中研究说明伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）引起多种家畜和野生动物的一种急性、热性传染病,主要临床症状为发热、奇痒、急性脑脊髓炎和繁殖障碍。从2011年底开始,我国规模化猪伪狂犬病免疫猪场突然暴发猪伪狂犬病疫情。2018年1月,河南省济源市某规模化PRV免疫猪场发生疑似猪伪狂犬病症状的疫情,本试验通过采集病料经PCR鉴定,对疑似PR的病料接种至PK-15进行病原分离、空斑纯化、病毒滴度测定、病毒生长曲线测定和病毒致病力测定试验;对PRV分离株gE、gB、gC、gD和TK基因进行PCR扩增并测序,并对其序列进行分析比对,以及构建遗传进化树进行分析。通过对来自河南省济源市某猪场的疑似PR感染的病料进行PRV gE鉴定,初步确定PRV野毒感染;病料经研磨、除菌处理后接种至PK-15细胞,接种24-48h内PK-15细胞在显微镜下可观察到细胞变圆、脱落,培养基变浑浊等明显病变;再经空斑纯化,获得一株PRV野毒株,并命名为HNJY株。PRV分离株HNJY株TCID50为10-8.7/0.1 mL,小鼠致病性试验结果显示:将HNJY株病毒接种至小鼠后,小鼠出现奇痒症状并死亡,LD50的结果为10531 TCID50.HNJY株gE、gB、gC、gD和TK基因与国内外参考毒株进行序列比对,结果显示:HNJY株gE、gB、gC、gD基因与国内毒株的核苷酸和氨基酸同源性分别高达 99.2%-99.9%和98.6%-100%、99.7%-100.0%和 99.2%-100.0%、96.9%-100%和94.6%1 00%、99.4%-99.9%和99.3%-99.8%,且高于欧美毒株;gB、gC基因与201 1年之后分离的国内变异株的核苷酸和氨酸同源性分别高达99.9%-1 00%和99.8%-100%、99.8%-100.0%和99.4%-1 00.0%,且高于2011年之前国内分离株和欧美毒株;TK基因与所有国内外毒株的核甘酸合氨基酸同源性高达99.4%-100%,表明TK基因高度保守。氨基酸进化树结果显示:gE、gB基因氨基酸进化树分为欧美毒株和国内毒株两大分支,HNJY株与国内毒株在同一分支:gC基因氨基酸进化树与毒株分离年代有明显关联,HNJY株与2011年之后分离的国内变异株在同一小分支上;gD、TK难因与所有国内变异株在同一分支上。HNJY株gD基因与国内外参考毒株进行氨基酸序列比对,在256位由丙氨酸突变为苏氨酸,进一步说明本试验分离株HNJY株属于一株独立的国内变异株。
咸文[8]（2019）在《PRV变异株GZYY2015的分离鉴定与gE基因缺失转移载体的构建》文中研究表明伪狂犬病毒（Pseudo rabies virus,PRV）引起的猪伪狂犬病（PR）是我国严格控制和扑灭的二类动物疫病,目前尚无特效药,预防该病仍需疫苗接种。由自然缺失gE基因的Bartha-K61株制造的疫苗,广泛推广应用于猪场,效果稳定且良好,为PR的防控做出了巨大贡献。直至2011年末,经过经典疫苗株Bartha-K61免疫的猪场再次暴发PR疫情,表明经典疫苗株Bartha-K61已不能再为猪只提供完全的免疫保护。母猪繁殖障碍和新生仔猪死亡率不断增加,PRV gE抗体阳性检出率也在不断上升,给养猪行业带来了巨大经济损失。贵州省养猪生产实践中,我们也时常遇到已免疫Bartha-K61株的猪群发生PR疫病的情况。为了解此类疫病PRV毒株情况,为更好地解决养猪生产中的PR问题,本研究采用经典的病毒分离方法,从临床送检样品中分离获得了一株PRV变异毒株（GZYY2015）,并基于该毒株基因序列构建了gE基因缺失转移载体,为PRV变异株gE基因缺失疫苗的研究奠定了基础。1、PRV变异株GZYY 2015的分离鉴定本研究取2015年贵阳云岩区某泔水散养户送检的经实验室诊断为PRV阳性的组织病料样品,经匀浆、冻融和无菌滤器过滤后,取滤液接种至单层致密的Vero细胞,进行传代分离PRV毒株,并对其部分生物学特性进行了鉴定。实验结果表明,当盲传至6代后,PRV分离毒即可在Vero细胞上形成稳定CPE现象。电镜下可见病毒粒子在核内包涵体中呈现典型的晶格状排列,负染的病毒粒子呈圆形,正二十面体核衣壳结构明显,具有典型的PRV病毒粒子形态特征。测定其TCID50为10-9.13TCID50/0.1mL,一步生长曲线显示该病毒在12 h内处于潜隐期,12 h48 h病毒滴度上升较快,60 h病毒滴度达到最高值。将该毒株接种于家兔,可致其体温升高,注射部位奇痒。本研究对TK、gE、gD和gC基因进行T克隆,将克隆质粒和gB基因PCR产物送上海生工测序,结果显示,各基因大小及ORF依次为1535 bp（963 bp）、1752 bp（1740 bp）、1273 bp（1209 bp）、1651 bp（1464 bp）和2784 bp（2745bp）,与预期大小一致。序列相似性及遗传进化分析结果显示,TK、gE、gC、gB基因均和PRV变异流行株位于同一进化分支上,且具有较高相似性,而gD基因序列与Ea株完全相同,并与经典株位于同一进化分支上,这五个基因与国外PRV毒株均不在同一进化分支。通过对各基因的氨基酸序列进行比对分析,gE基因在第48、496位均有一个天冬氨酸（D）的插入,这两个位点的变异与国内PRV变异流行株变异位置相同,符合赵鸿远等人报道的PRV变异分子特征。该毒株gC、gB、gD、TK基因推导的氨基酸序列,存在不同程度的变异,变异位点及类型均与参与比较的变异毒株相似。2、PRV GZYY2015变异株gE基因缺失转移载体构建设计引物分别扩增PRV GZYY2015变异株gE上下游同源臂LA、RA,以及pEGFP-C1中绿色荧光蛋白表达相关基因序列。首先将扩增的gE左同源臂LA片段酶切后,克隆至pcDNA3.1真核表达载体中,构建pcDNA3.1-LA质粒。之后,再将扩增的gE右同源臂RA片段酶切后,克隆至pcDNA3.1-LA质粒载体中,构建pcDNA3.1-LA-RA质粒。最后将扩增的EGFP-C1片段通过酶切,克隆连接至pcDNA3.1-LA-RA质粒载体中,构建pcDNA3.1-LA-EGFP-RA质粒。测序结果表明,克隆的LA-EGFP-RA片段大小为3571 bp,两端分别为NheⅠ和XbaⅠ酶切位点,中间835 bp～2609 bp为EGFP序列,其两端均为Bam HⅠ酶切位点,测序结果与预期相符。
席瑞[9]（2019）在《猪伪狂犬病病毒变异毒株的分离鉴定及UL42多克隆抗体的制备》文中认为伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）是引起伪狂犬病（Pseudorabies,PR）的病原体,可感染各年龄段的猪并造成不同程度的临床症状,主要表现为仔猪的中枢神经系统症状、种猪的繁殖障碍以及成年猪的呼吸道症状,对我国养殖业造成了巨大的经济损失。长久以来,我国主要使用基因缺失苗控制该病,并取得了较好的效果。但2011年后,PRV新毒株从华北地区蔓延至全国,表明现有疫苗对新出现的PRV变异株不能提供完全保护,这加重了 PR在我国的流行和暴发,增加了防控难度。因此,分析PRV变异毒株和经典毒株之间的差异有助于预测病毒发生变异的途径,对研发新型疫苗奠定基础。本研究从疑似伪狂犬病猪病料分离并鉴定了两株变异毒株,同时制备了病毒蛋白抗体UL42,这些为后期研究病毒致病分子机制奠定了重要基础。1.伪狂犬病病毒变异毒株的分离及鉴定对江苏某疑似伪狂犬病发病猪场进行病料采集,研磨处理后提取基因组DNA为模板,利用gE和gB引物进行PCR扩增,结果gE和gB均呈阳性。gE缺失株Bartha-K61仅扩增出gB片段,所以判定该猪场感染了 PRV野毒株。将该病料接种Vero细胞盲传6代后,出现明显的细胞病变,空斑实验发现空斑呈现大小不同的形态。分别挑取一定数量大小不同的空斑并感染Vero细胞,发现他们感染的Vero细胞中存在两种不同病变形态。对gE和gC测序比对后发现,gE序列同源性为100%,gC序列同源性为94.33%。对gE的遗传差异和系统发育分析显示,相较于国外分离株,实验室分离到的两株PRV野毒株与2011年以后在中国分离得到的PRV变异株亲缘关系较近,符合近年来我国分离得到的PRV变异株的普遍特点。同时,从跨膜区、二级结构、亲水性、抗原指数、表面可及性以及柔韧性六个方面对gE进行抗原性分析可知,实验室分离野毒株的gE蛋白两端有成为优势抗原表位的可能。将分离到的这两株PRV命名为JSB1-7和JSB1-13。一步生长曲线结果表明其复制能力都低于疫苗株Bartha-K61。2.伪狂犬病病毒蛋白UL42多克隆抗体的制备UL42是PRV编码的DNA聚合酶的辅助亚基,是病毒复制所必须的早期蛋白之一,在整个PRV生命周期中起着重要的作用,因此,本研究制备了 UL42多克隆抗体,为研究其具体作用机制提供材料基础。首先构建pET-28a-UL42重组质粒并转化Rosetta感受态细胞,IPTG诱导不同时间取样进行SDS-PAGE检测,发现在第5 h重组蛋白的表达量最高,大小约为42 kDa,破碎后分别收集上清和沉淀,经SDS-PAGE检测,发现UL42蛋白主要以可溶性的形式表达。利用AKTA Purifier将原核表达的UL42蛋白进行纯化,并根据小鼠的免疫程序来免疫小鼠。ELISA试验结果表明小鼠的多抗血清效价达到1:64000,并且该多克隆抗体适用于WB和IFA。
逄锦颖[10]（2018）在《山东省水貂胴体内ADV、MEV和CDV检测与分离株的变异及ADV对小鼠安全性分析》文中研究指明水貂是高档毛皮用经济动物,目前以人工饲养为主。伴随皮张生产而产生的大量水貂胴体引起广泛关注,由于目前国内外尚缺乏对水貂胴体成分的科学认识和加工技术,造成水貂胴体处理十分混乱,很多养殖户利用水貂胴体加工成生鲜料用于水貂和其它毛皮动物的饲料,这给毛皮动物养殖业带来非常大的生物安全隐患。为明确水貂胴体中病毒携带情况以及其对小鼠安全性,本研究对危害水貂较为严重的阿留申病病毒（ADV）、肠炎细小病毒（MEV）与犬瘟热病毒（CDV）建立了三重PCR快速检测方法,用该方法对来自山东主产区的水貂胴体开展检测,对分离的阿留申病毒株和犬瘟热病毒株进行变异分析,用人工感染试验分析了阿留申病毒株对小鼠的安全性。结果如下:分别设计合成了MEV、CDV和ADV三种病毒基因特异性引物,优化反应条件,建立了快速检测三种病毒的三重PCR方法,该方法可同时扩增出MEV 694bp、CDV402bp和ADV 1025bp的特异性基因目的条带,灵敏性试验结果最低核酸检出量为MEV3.13×105 copies/μL、CDV 1.94×105copies/μL和ADV 2.56×105copies/μL。试验结果证明成功构建了三种病毒的三重PCR检测方法,临床样品检测结果证明三重和单一PCR检测结果相符。在临床上可快速的检测单一或混合感染病例。利用构建的三重PCR检测方法,对山东省共6个水貂的主要养殖地区的379份送检和采集的样品进行检测,结果显示ADV单一感染率为2.9%-8.6%;MEV的单一感染率为4.9%-8.5%;CDV单一感染率为5.1%-6.3%;ADV和MEV混合感染率为1.4%-3.5%;ADV和CDV混合感染率为1.4%-3.4%;MEV和CDV混合感染率为0.9%-4%;三种病毒混合感染率为0.9%-2.1%。将检测出ADV阳性的病料进行毒株的分离鉴定,并作基因同源性分析。结果显示,成功分离出一株ADV毒株,命名为ADV-SD,该毒株在猫肾传代细胞（CRFK）上盲传至第5代第6天出现明显的细胞病变（CPE）。扩增ADV的VP2蛋白全基因序列与国内外发表的毒株VP2基因同源性比较分析,结果显示ADV-SD分离株VP2蛋白基因与其它发表毒株的同源性在94.1%96.1%之间;对ADV-SD-VP2基因绘制进化树,发现分离株与国内分离株不处在同一进化支,而是处在国内株（登录号:GU183265-LN2）和俄罗斯株（登录号:KJ174161）之间的进化中间态。将检测出CDV阳性的病料内的毒株进行分离鉴定,并作基因同源性分析。结果显示,成功分离一株CDV,命名为CDV-SD;该毒株在Vero细胞上在盲传至第6代时未出现明显的CPE（细胞融合呈露珠状）,但可见大量的细胞死亡;对分离株的H蛋白基因同源性分析结果显示该毒株与发表的山东参考毒株的一致性高达99%。对CDV-SD-H基因绘制进化树,发现分离株与国内三株山东地区分离株处在同一进化支,（山东地区分离株登录号为KF880682、KF880683、KF880684）。ADV分离株感染小鼠结果显示,试验组的8只小鼠均感染ADV,但感染小鼠体重以及内脏器官发育指数无显着性差异,剖检无明显病变,血液常规检测结果显示感染小鼠的淋巴细胞总数及其比率显着增加（P<0.05）,血小板总数、粒细胞总数及其比率以及中间细胞比率显着下降（P<0.05）,其它指标差异不显着（P>0.05）;感染小鼠H9流感株的抗体效价较对照组小鼠显着下降（23 vs 24,p<0.05）;对小鼠体内的ADV分离鉴定,并比较VP2基因同源性,结果显示小鼠体内携带的ADV毒株与原毒株的同源性为99.2%,表明ADV能够感染小鼠并出现微弱的变异。通过以上研究,建立的快速检测ADV、MEV、CDV的三重PCR方法为了解水貂及其胴体携带三种病毒情况、临床流行病调查、鉴别诊断提供重要方法依据;明确山东省水貂主产区内水貂胴体中3种病毒的感染情况和ADV、CDV分离株与其它参考毒株间的变异进化关系;评估了ADV分离株对小鼠的安全性。这些为认识水貂胴体生物安全、探讨水貂胴体分类分级利用标准提供科学依据。
二、HVT国内株的分离鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HVT国内株的分离鉴定（论文提纲范文）
（1）绵羊捻转血矛线虫耐药性调查及耐IVM候选基因的筛选与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 内蒙古地区羊产业发展概况 |
| 1.2 捻转血矛线虫及捻转血矛线虫病概述 |
| 1.2.1 捻转血矛线虫分类地位 |
| 1.2.2 捻转血矛线虫生活史 |
| 1.2.3 捻转血矛线虫病及其危害 |
| 1.2.4 捻转血矛线虫病防控技术 |
| 1.3 常用驱捻转血矛线虫药物概述 |
| 1.3.1 伊维菌素(Ivermectin,IVM) |
| 1.3.2 阿苯达唑(Albendazole,ABZ) |
| 1.3.3 氯氰碘柳胺钠(Closantel Sodium) |
| 1.4 捻转血矛线虫对常用驱虫药物的耐药性研究 |
| 1.4.1 耐药性检测技术 |
| 1.4.2 捻转血矛线虫对伊维菌素的耐药性 |
| 1.4.3 捻转血矛线虫对阿苯达唑的耐药性 |
| 1.4.4 捻转血矛线虫耐驱虫药候选基因研究概述 |
| 1.5 2b-Rad技术及其应用 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 2 试验一绵羊捻转血矛线虫感染状况调查及对常用驱虫药的耐药性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 不同饲养模式下的绵羊捻转血矛线虫感染情况比较 |
| 2.2.2 剖解羊只后胃肠道线虫成虫检测结果 |
| 2.2.3 所选驱虫药有效成分检测结果 |
| 2.2.4 用药后不同采样时间点对常用驱虫药物耐药性检测结果的影响 |
| 2.2.5 纯放牧模式下的羊捻转血矛线虫对常用驱虫药耐药性情况 |
| 2.2.6 半舍饲模式下的羊捻转血矛线虫对常用驱虫药耐药性情况 |
| 2.3 讨论与小结 |
| 3 试验二捻转血矛线虫国内株的分离鉴定及耐药相关基因分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 对伊维菌素耐药捻转血矛线虫虫株分离结果 |
| 3.2.2 对伊维菌素敏感捻转血矛线虫虫株分离结果 |
| 3.2.3 不同分离虫株耐伊维菌素特性检测结果及比较 |
| 3.2.4 不同分离虫株耐阿苯达唑特性检测结果及比较 |
| 3.2.5 不同分离虫株特异性引物鉴定结果 |
| 3.2.6 不同分离虫株Ⅰ型β微管蛋白基因特异性位点SNP分析结果 |
| 3.2.7 不同分离虫株Ⅰ型β微管蛋白基因型及其频率分析结果 |
| 3.2.8 伊维菌素刺激前后不同分离虫株P-gps基因表达分析结果 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 4 试验三基于2b-Rad的捻转血矛线虫耐IVM候选新基因的筛选与分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 SNPs发掘及其分布特征结果分析 |
| 4.2.2 耐药与敏感虫株遗传多样性和种群分化结果分析 |
| 4.2.3 捻转血矛线虫耐伊维菌素相关候选基因筛选结果 |
| 4.2.4 HCOI00378500 基因测序及分析结果 |
| 4.2.5 HCOI00506600 基因测序及分析结果 |
| 4.2.6 HCOI01200700 基因测序及分析结果 |
| 4.3 讨论与小结 |
| 5 结论 |
| 6 本课题创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（2）副猪嗜血杆菌贵州株的分离鉴定及生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 HPS病原学 |
| 2 HPS诊断方法研究 |
| 3 HPS生物学特性研究 |
| 3.1 菌体形态学 |
| 3.2 分离鉴定与培养特性 |
| 4 HPS血清型研究 |
| 4.1 血清学分型 |
| 4.2 分子生物学分型 |
| 5 HPS毒力基因研究进展 |
| 5.1 HPS的致病性 |
| 5.2 毒力因子的鉴定 |
| 6 HPS耐药性研究 |
| 7 HPS疫苗研究 |
| 7.1 HPS灭活疫苗 |
| 7.2 HPS亚单位疫苗 |
| 7.3 DNA疫苗 |
| 8 研究目的及意义 |
| 第二章 副猪嗜血杆菌的分离鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 主要试剂及培养基 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 送检样品的HPS检测 |
| 2.1.1 HPS16s rRNA检测引物合成 |
| 2.1.2 送检样品的增菌培养 |
| 2.1.3 细菌核酸提取 |
| 2.1.4 HPS16S rRNA PCR扩增 |
| 2.1.5 HPS16S rRNA PCR产物测序 |
| 2.2 HPS阳性样品混合感染病原检测 |
| 2.2.1 引物合成 |
| 2.2.2 HPS阳性组织样品的预处理 |
| 2.2.3 HPS阳性样品的核酸提取 |
| 2.2.4 HPS阳性样品中PCV2、PRRSV、CSFV的检测 |
| 2.3 HPS分离纯化 |
| 2.4 革兰氏染色 |
| 2.5 卫星试验 |
| 2.6 生化试验 |
| 2.7 HPS16S rRNA PCR扩增序列鉴定序列鉴定 |
| 2.8 HPS16S rRNA PCR扩增序列对比分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 送检样品的HPS检测PCR检测结果 |
| 3.2 HPS16S rRNA PCR产物测序结果与分析 |
| 3.2.1 HPS16S rRNA PCR产物测序结果 |
| 3.2.2 14份HPS16S rRNA核苷酸序列相似性分析 |
| 3.2.3 14株HPS菌株与其他HPS菌株16S rRNA核苷酸序列相似性分析 |
| 3.2.4 14株HPS菌株基因组与其他HPS菌株遗传进化分析 |
| 3.2.5 14株HPS菌株与其他HPS菌株核苷酸和氨基酸序列分析 |
| 3.3 HPS阳性样品中PCV2、PRRSV、CSFV的检测 |
| 3.3.1 PCV2检测结果 |
| 3.3.2 PRRSV检测结果 |
| 3.3.3 CSFV检测结果 |
| 3.4 3株HPS分离纯化菌株的菌落特征 |
| 3.5 3株HPS分离纯化菌株的革兰氏染色结果 |
| 3.6 卫星试验 |
| 3.7 生化试验 |
| 3.8 HPS16S rRNA PCR扩增序列鉴定序列鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 3株HPS贵州分离菌株的部分生物学特性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要试剂及培养基 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 HPS分离菌株NAD依赖性测定 |
| 2.1.1 不同NAD浓度对HPS分离株的影响 |
| 2.1.2 同一NAD浓度中不同时间段HPS分离菌株生长观察 |
| 2.2 HPS分离菌株的血清型鉴定 |
| 2.2.1 HPS血清型PCR鉴定引物的合成 |
| 2.2.2 HPS分离菌株血清型PCR鉴定 |
| 2.3 HPS分离菌株毒力基因检测 |
| 2.4 HPS分离菌株培养特性研究 |
| 2.5 HPS分离菌株耐药性试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 HPS分离菌株NAD依赖性测定 |
| 3.1.1 不同NAD浓度对HPS分离株的影响测定结果 |
| 3.1.2 同一NAD浓度中不同时间段HPS分离菌株生长测定结果 |
| 3.2 HPS分离菌株的血清型鉴定结果 |
| 3.3 HPS分离菌株毒力基因PCR测定 |
| 3.4 HPS分离菌株培养特性研究 |
| 3.5 HPS分离菌株耐药性试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（3）2013—2018年广西地区猪伪狂犬病病毒gB、gE与TK基因遗传变异分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病料 |
| 1.2 主要试剂及仪器设备 |
| 1.3 参考毒株 |
| 1.4 样品检测及病毒分离 |
| 1.5 阳性样本DNA提取及gB、gE、TK基因扩增克隆及测序 |
| 1.6 gB、gE、TK基因遗传进化分析 |
| 2 结 果 |
| 2.1 样品检测 |
| 2.2 PRV的分离鉴定 |
| 2.3 PRV分离株gB、gE、TK全基因克隆与基因比对分析 |
| 2.3.1 gB、gE、TK基因的同源性分析 |
| 2.3.2 gB、gE、TK基因的遗传进化分析 |
| 2.3.2.1 gB基因的遗传进化分析: |
| 2.3.2.2 gE基因的遗传进化分析: |
| 2.3.2.3 TK基因的遗传进化分析: |
| 3 讨 论 |
| 4 结 论 |
（4）杭州地区猫杯状病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病料样品及细胞来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 VP1引物的设计与合成 |
| 1.4 病料的RT-PCR鉴定 |
| 1.5 病毒的分离培养与鉴定 |
| 1.6 FCV衣壳蛋白VP1的扩增与测序分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 病料的RT-PCR鉴定 |
| 2.2 病毒的分离培养 |
| 2.3 FCV衣壳蛋白VP1基因的扩增及序列测定 |
| 2.4 FCVVP1基因的同源性分析 |
| 2.5 VP1基因序列进化树分析 |
| 2.6 B细胞线性表位变异性分析 |
| 3 讨论 |
（5）鸭源鸡杆菌tolC基因缺失株的构建及生物学特性分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 英文缩写词表 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 鸡杆菌概述 |
| 1.1 鸭源鸡杆菌的分类地位 |
| 1.2 鸭源鸡杆菌的培养和生化特性 |
| 1.3 鸭源鸡杆菌的毒力因子 |
| 1.3.1 RTX样毒素GtxA |
| 1.3.2 外膜囊泡 |
| 1.3.3 菌毛 |
| 1.3.4 荚膜 |
| 1.3.5 金属蛋白酶 |
| 1.3.6 生物膜的形成 |
| 1.3.7 血凝素 |
| 1.3.8 耐药因子 |
| 1.3.9 与毒力有关的其他假定因素 |
| 1.4 鸭源鸡杆菌的流行病学及宿主范围 |
| 1.5 传播方式 |
| 1.6 鸭源鸡杆菌感染的临床特征及病理表现 |
| 1.6.1 自然感染的临床特征及病理表现 |
| 1.6.2 试验感染的临床特征及病理表现 |
| 1.7 诊断 |
| 2 外膜蛋白概述 |
| 2.1 外膜蛋白 |
| 2.2 外膜通道蛋白TolC |
| 2.2.1 参与耐药及毒力形成 |
| 2.2.2 增强细菌适应能力 |
| 2.2.3 促进生物被膜形成 |
| 2.2.4 作为噬菌体的表面受体 |
| 2.2.5 未来抗菌药物的潜在靶点 |
| 3 基因功能研究方法 |
| 3.1 基因生物信息学分析 |
| 3.2 基因的表达分析 |
| 3.3 基因敲除技术 |
| 3.3.1 Red重组系统 |
| 3.3.2 自然转化法 |
| 4 小结 |
| 试验研究 |
| 试验一 鸭源鸡杆菌tolC基因的克隆及生物信息学分析 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 细菌培养 |
| 1.6 tolC基因的扩增及序列测定 |
| 1.6.1 tolC基因的扩增与电泳鉴定 |
| 1.6.2 PCR产物的回收与纯化 |
| 1.6.3 胶回收产物与T载体的连接 |
| 1.6.4 CaCl_2法制备DH5α感受态细胞与重组质粒转化 |
| 1.6.5 重组菌鉴定与tolC基因序列测定 |
| 1.7 tolC核苷酸及编码氨基酸序列分析 |
| 1.8 TolC理化性质分析 |
| 1.9 TolC信号肽及结构分析 |
| 1.10 TolC B细胞抗原表位预测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 tolC基因的扩增 |
| 2.2 tolC基因核苷酸及氨基酸序列分析 |
| 2.3 TolC同源蛋白氨基酸差异位点比较 |
| 2.4 TolC的理化性质 |
| 2.5 TolC同源蛋白保守结构域预测 |
| 2.6 TolC同源蛋白信号肽、亚细胞定位及结构分析 |
| 2.7 TolC同源蛋白线性B细胞抗原表位预测 |
| 3 讨论 |
| 试验二 鸭源鸡杆菌tolC基因的表达及抗原性鉴定 |
| 引言 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 菌株、质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 引物设计、合成 |
| 1.5 细菌基因组制备 |
| 1.6 tolC基因的扩增与回收 |
| 1.7 重组质粒pET-28a-tolC的构建鉴定 |
| 1.8 重组菌的诱导表达 |
| 1.9 重组蛋白TolC的纯化、鉴定 |
| 1.10 多克隆抗体制备 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 tolC基因的扩增 |
| 2.2 重组质粒pET-28a-tolC的鉴定 |
| 2.3 重组表达蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.4 重组表达TolC的Western Blot鉴定 |
| 2.5 TolC的免疫原性分析 |
| 3 讨论 |
| 试验三 鸭源鸡杆菌tolC基因的缺失株构建及其生物学特性分析 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 主要酶和试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 培养基配制 |
| 1.5 方法 |
| 1.5.1 引物设计 |
| 1.5.2 重组质粒pMD18-S-K-X的构建 |
| 1.5.3 鸭源鸡杆菌tolC基因缺失株的构建 |
| 1.5.4 鸭源鸡杆菌tolC基因缺失株的筛选与鉴定 |
| 1.5.5 缺失株RZΔtolC的生物学特性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 缺失株RZΔtolC的构建 |
| 2.1.1 tolC基因上、下游同源臂及KAN抗性基因的扩增 |
| 2.1.2 成功构建出重组质粒pMD18-S-K-X |
| 2.1.3 tolC基因缺失株鉴定 |
| 2.1.4 Western Blot证实缺失株RZΔtolC构建成功 |
| 2.2 缺失株的生物学特性 |
| 2.2.1 缺失株遗传稳定性分析 |
| 2.2.2 缺失株RZΔtolC生长特性分析 |
| 2.2.3 缺失株RZΔtolC生物被膜形成能力 |
| 2.2.4 缺失株RZΔtolC黏附能力测定 |
| 2.2.5 MIC测定 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 附: 作者读研期间发表文章 |
（6）猪伪狂犬病病毒的分离鉴定和比较基因组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写对照表(Abbreviation) |
| 第一章 文献综述 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 伪狂犬病毒的发现 |
| 1.2 伪狂犬病毒的分子生物学 |
| 1.2.1 伪狂犬病毒的形态结构和基因组特征 |
| 1.2.2 伪狂犬病毒的蛋白及功能 |
| 1.3 伪狂犬病的危害和流行情况 |
| 1.3.1 临床特点和危害 |
| 1.3.2 国外流行情况 |
| 1.3.3 国内流行情况 |
| 1.4 伪狂犬病的防控 |
| 1.4.1 疫苗研究 |
| 1.4.2 防控措施 |
| 1.5 PRV全基因组测序的研究进展 |
| 2 研究目的与意义 |
| 第二章 PRV的分离鉴定及分子特征分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料 |
| 1.2 主要试剂与病毒株 |
| 1.3 主要仪器与设备 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 病料组织样品的收集处理 |
| 2.2 病毒分离与纯化 |
| 2.3 病毒DNA的提取 |
| 2.4 PRV分子特征测定方法 |
| 2.4.1 引物与反应条件 |
| 2.4.2 扩增片段的回收 |
| 2.4.3 回收片段连接载体 |
| 2.4.4 转化 |
| 2.4.5 质粒提取 |
| 2.4.6 阳性质粒鉴定 |
| 2.5 病毒的增殖效价 |
| 2.5.1 病毒噬斑实验 |
| 2.5.2 TCID_(50)测定 |
| 2.5.3 病毒血清中和实验 |
| 2.6 小鼠感染实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的分离纯化 |
| 3.2 组织样品的PCR检测 |
| 3.3 四株PRV重要基因同源性与进化树 |
| 3.4 病毒的增殖效价 |
| 3.4.1 病毒噬斑 |
| 3.4.2 TCID_(50)测定 |
| 3.4.3 血清中和效价 |
| 3.5 PRV对小鼠的致病性 |
| 3.5.1 PRV对小鼠LD50测定 |
| 3.5.2 小鼠临床症状 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PRV分离鉴定 |
| 4.2 PRV毒力基因序列分析 |
| 5 小结 |
| 第三章 PRV全基因组测序和比较基因组学分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与病毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 试剂配制 |
| 2.2 病毒粒子纯化 |
| 2.3 PRV DNA的提取 |
| 2.4 PRV FJ01株和YK株全基因组测序和拼接 |
| 2.5 基因同源性和进化树分析 |
| 2.6 基因重组分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV FJ01株和YK株的基因组序列特征 |
| 3.1.1 样本基因组拼接 |
| 3.1.2 与参考序列比对分析 |
| 3.2 PRV基因组同源性分析 |
| 3.2.1 基因组序列同源性比对 |
| 3.2.2 PRV各基因组核苷酸同源性比对 |
| 3.2.3 PRV各基因组氨基酸同源性比对 |
| 3.2.4 基因同源性差异较大区域比对 |
| 3.3 PRV进化树分析 |
| 3.3.1 全基因组进化树 |
| 3.3.2 各基因序列的进化树分析 |
| 3.4 重组分析 |
| 3.4.1 全基因组重组分析 |
| 3.4.2 基因编码序列的重组分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 测序方法 |
| 4.2 全基因组和各基因遗传进化分析 |
| 4.3 基因重组现象 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）猪伪狂犬病毒HNJY的分离鉴定及其生物学特性分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 英文缩略表 |
| 摘要 |
| 第一章 文章综述 |
| 1.1 猪伪狂犬病的流行现状 |
| 1.1.1 猪伪狂犬病简述 |
| 1.1.2 PR国外流行史 |
| 1.1.3 PR国内流行史 |
| 1.2 PRV结构与主要基因介绍 |
| 1.2.1 PRV粒子结构 |
| 1.2.2 PRV基因组 |
| 1.2.3 PRV主要基因的功能 |
| 1.2.3.1 gE基因 |
| 1.2.3.2 gB基因 |
| 1.2.3.3 gC基因 |
| 1.2.3.4 gD基因 |
| 1.2.3.5 TK基因 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 猪伪狂犬病毒河南省HNJY株的分离鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料、阳性毒株及细胞来源 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂及溶液配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病料样品的采集与处理 |
| 2.2.2 病原的PCR鉴定 |
| 2.2.2.1 引物信息 |
| 2.2.2.2 病毒总核酸的提取 |
| 2.2.2.3 RNA的反转录 |
| 2.2.2.4 反应体系及PCR扩增程序 |
| 2.2.3 病毒的分离 |
| 2.2.3.1 细胞复苏 |
| 2.2.3.2 细胞传代 |
| 2.2.3.3 细胞冻存 |
| 2.2.3.4 细胞接毒 |
| 2.2.4 空斑纯化 |
| 2.2.5 PRV分离株组织细胞半数感染量(TCID_(50))的测定 |
| 2.2.6 PRV分离株一步生长曲线的测定 |
| 2.2.7 PRV分离株对BALB/c小鼠致病性试验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 病料的PCR鉴定 |
| 2.3.2 病毒的分离 |
| 2.3.3 分离病毒的空斑纯化 |
| 2.3.4 分离毒株滴度的测定 |
| 2.3.5 分离毒株一步生长曲线的测定 |
| 2.3.6 分离毒株对小鼠致病性试验 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 HNJY株主要基因的克隆及序列分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株、菌株、载体 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂及培养基的配制 |
| 3.1.4 制备感受态细胞 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 引物设计及合成 |
| 3.2.2 基因组DNA的提取 |
| 3.2.3 目的基因片段的扩增 |
| 3.2.4 目的产物的纯化回收 |
| 3.2.5 目的产物与载体的连接 |
| 3.2.6 连接产物的转化 |
| 3.2.7 质粒的提取 |
| 3.2.8 重组质粒的双酶切鉴定 |
| 3.2.9 阳性质粒的测序及序列分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 gE、gB、gC、gD及TK基因全长扩增 |
| 3.3.1.1 gE基因全长扩增 |
| 3.3.1.2 gB基因全长扩增 |
| 3.3.1.3 gC基因全长扩增 |
| 3.3.1.4 gD基因全长扩增 |
| 3.3.1.5 TK基因全长扩增 |
| 3.3.2 gE、gB、gC、gD、TK基因重组质粒的双酶切鉴定 |
| 3.3.3 gE基因同源性比对及遗传进化分析 |
| 3.3.3.1 gE基因核苷酸及氨基酸序列同源性比对 |
| 3.3.3.2 gE基因氨基酸序列分析 |
| 3.3.3.3 gE基因氨基酸进化树分析 |
| 3.3.4 gB基因同源性比对及遗传进化分析 |
| 3.3.4.1 gB基因核苷酸及氨基酸序列同源性比对 |
| 3.3.4.2 gB基因氨基酸序列分析 |
| 3.3.4.3 gB基因氨基酸进化树分析 |
| 3.3.5 gC基因同源性比对及遗传进化分析 |
| 3.3.5.1 gC基因核苷酸及氨基酸序列同源性比对 |
| 3.3.5.2 gC基因氨基酸序列分析 |
| 3.3.5.3 gC基因氨基酸进化树分析 |
| 3.3.6 gD基因同源性比对及遗传进化分析 |
| 3.3.6.1 gD基因核苷酸及氨基酸序列同源性比对 |
| 3.3.6.2 gD基因氨基酸序列分析 |
| 3.3.6.3 gD基因氨基酸进化树分析 |
| 3.3.7 TK基因同源性比对及遗传进化分析 |
| 3.3.7.1 TK基因核苷酸及氨基酸序列同源性比对 |
| 3.3.7.2 TK基因氨基酸进化树分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 PRV gE基因序列分析 |
| 3.4.2 PRV gB基因序列分析 |
| 3.4.3 PRV gC基因序列分析 |
| 3.4.4 PRV gD基因序列分析 |
| 3.4.5 PRV TK基因序列分析 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
（8）PRV变异株GZYY2015的分离鉴定与gE基因缺失转移载体的构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 伪狂犬病毒概述 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状及致病机制 |
| 1.4 疫苗研究进展 |
| 1.5 防控措施与净化 |
| 2 实验目的及意义 |
| 第二章 PRV变异株GZYY 2015的分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 传代细胞 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 载体、菌种及主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.1.1 样品处理 |
| 2.1.2 细胞复苏 |
| 2.1.3 细胞传代 |
| 2.1.4 病毒增殖 |
| 2.2 病毒生物学特性鉴定 |
| 2.2.1 病毒形态学观察 |
| 2.2.2 病毒TCID50的测定 |
| 2.2.3 一步生长曲线的绘制 |
| 2.2.4 动物实验 |
| 2.3 PRV GZYY2015变异株主要基因的T克隆 |
| 2.3.1 病毒基因组DNA的抽提 |
| 2.3.2 主要基因片段的扩增 |
| 2.3.3 主要基因片段的回收 |
| 2.3.4 感受态细胞的制作 |
| 2.3.5 主要基因片段与T载体的连接及转化 |
| 2.3.6 碱裂解法提取质粒 |
| 2.3.7 阳性克隆的筛选与鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒生物学特性鉴定结果 |
| 3.1.1 细胞病变观察 |
| 3.1.2 病毒形态学观察 |
| 3.1.3 病毒TCID50的测定 |
| 3.1.4 一步生长曲线的绘制 |
| 3.1.5 动物试验 |
| 3.3 PRV GZYY2015变异株主要基因的T克隆 |
| 3.3.1 主要基因的扩增结果 |
| 3.3.2 主要基因T克隆鉴定结果 |
| 3.3.3 主要基因T克隆测序结果 |
| 3.3.4 PRV GZYY2015株gE基因的遗传变异分析 |
| 3.3.5 PRV GZYY2015株gD基因的遗传变异分析 |
| 3.3.6 PRV GZYY2015株gC基因的遗传变异分析 |
| 3.3.7 PRV GZYY2015株gB基因的遗传变异分析 |
| 3.3.8 PRV GZYY2015株TK基因的遗传变异分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 PRV GZYY2015变异株gE基因缺失转移载体构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体、菌种及主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 同源臂的T克隆及EGFP-C1基因片段扩增 |
| 2.2.1 同源臂LA、RA基因片段的扩增 |
| 2.2.2 同源臂LA、RA基因片段的T克隆 |
| 2.2.3 EGFP-C1基因片段的扩增 |
| 2.3 pcDNA-LA质粒的构建 |
| 2.3.1 pcDNA3.1 质粒和LA片段双酶切 |
| 2.3.2 pcDNA3.1 质粒和LA片段连接 |
| 2.3.3 pcDNA3.1-LA质粒的转化及筛选 |
| 2.3.4 pcDNA3.1-LA阳性质粒的鉴定 |
| 2.4 pcDNA3.1-LA-RA质粒的构建 |
| 2.4.1 pcDNA3.1-LA质粒和RA片段双酶切 |
| 2.4.2 pcDNA3.1-LA质粒和RA片段连接 |
| 2.4.3 pcDNA3.1-LA-RA质粒的转化及筛选 |
| 2.4.4 pcDNA3.1-LA-RA阳性质粒的鉴定 |
| 2.5 pcDNA3.1-LA-EGFP-RA质粒的构建 |
| 2.5.1 pcDNA3.1-LA-RA质粒和EGFP-C1片段单酶切 |
| 2.5.2 pcDNA3.1-LA-RA质粒和EGFP-C1片段连接 |
| 2.5.3 pcDNA3.1-LA-EGFP-RA质粒的转化及筛选 |
| 2.5.4 pcDNA3.1-LA-EGFP-RA阳性质粒的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 同源臂T克隆及EGFP-C1基因片段扩增 |
| 3.1.1 同源臂LA和RA基因片段的扩增 |
| 3.1.2 同源臂LA、RA和EGFP-C1基因的质粒PCR扩增 |
| 3.2 pcDNA3.1-LA阳性质粒鉴定 |
| 3.3 pcDNA3.1-LA-RA阳性质粒鉴定 |
| 3.4 pcDNA3.1-LA-EGFP-RA阳性质粒鉴定 |
| 3.5 pcDNA3.1-LA-EGFP-RA阳性质粒的测序鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 主要参考文献 |
| 附录一 病猪内脏组织病理变化特征 |
| 附录二 PRV变异株GZYY2015株gE缺失转移载体pcDNA3.1-LA-EGFP-RA序列 |
| 附录三 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）猪伪狂犬病病毒变异毒株的分离鉴定及UL42多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 分子生物学特征 |
| 1.1 病毒结构 |
| 1.2 基因组特征 |
| 1.3 编码蛋白 |
| 1.4 病毒复制周期 |
| 1.5 流行病学研究 |
| 2 疫苗研究及进展 |
| 3 本研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 伪狂犬病病毒变异毒株的分离及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病料 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 基因组的提取 |
| 1.5 PCR鉴定 |
| 1.6 病毒分离 |
| 1.7 病毒的空斑纯化 |
| 1.8 病毒滴度的测定 |
| 1.9 病毒生长复制情况测定 |
| 1.10 gE遗传差异和系统发育分析 |
| 1.11 gE蛋白的抗原性分析 |
| 2 结果及分析 |
| 2.1 病料鉴定 |
| 2.2 病毒的分离 |
| 2.3 病毒感染细胞形态的观察 |
| 2.4 基因序列比对 |
| 2.5 病毒滴度及生长复制情况测定结果 |
| 2.6 gE的遗传差异和系统发育分析 |
| 2.7 gE蛋白的抗原性分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 伪狂犬病病毒蛋白UL42多克隆抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 UL42引物 |
| 1.3 UL42质粒构建及原核表达 |
| 1.4 蛋白纯化 |
| 1.5 多抗的鉴定 |
| 2 结果及分析 |
| 2.1 PCR扩增结果 |
| 2.2 原核表达及纯化 |
| 2.3 UL42蛋白免疫及效价测定 |
| 2.4 多抗的功能鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（10）山东省水貂胴体内ADV、MEV和CDV检测与分离株的变异及ADV对小鼠安全性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.引言 |
| 1.1 水貂阿留申病毒 |
| 1.1.1 ADV病原学 |
| 1.1.2 ADV的结构形态 |
| 1.1.3 ADV培养特性和毒株分类 |
| 1.1.4 ADV的复制过程 |
| 1.1.5 ADV基因组编码蛋白及功能 |
| 1.1.6 AD临诊症状及病理学变化 |
| 1.2 水貂肠炎细小病毒 |
| 1.2.1 MEV的病原学及理化特性 |
| 1.2.2 MEV的基因组组成及其特性 |
| 1.2.3 MEV的致病机制 |
| 1.2.4 MEV流行病学 |
| 1.2.5 MEV的临床症状 |
| 1.2.6 MEV的诊断方和防治 |
| 1.3 犬瘟热病毒 |
| 1.3.1 CDV病原学 |
| 1.3.2 CDV基因组分析 |
| 1.3.3 CDV的致病机理 |
| 1.3.4 CDV的流行病学 |
| 1.3.5 CDV的临床症状 |
| 1.3.6 CDV的诊断与防治 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒和样品 |
| 2.1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 细胞和实验动物 |
| 2.1.5 主要试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 检测水貂胴体ADV、MEV、和CDV的三重PCR检测方法的建立 |
| 2.2.1.1 引物的设计 |
| 2.2.1.2 ADV和MEV的DNA模板及CDV的cDNA模板的获取 |
| 2.2.1.3 ADV、MEV和CDV的PCR扩增 |
| 2.2.1.4 单一PCR的特异性试验 |
| 2.2.1.5 三重PCR的灵敏度试验 |
| 2.2.1.6 山东省6个水貂主要养殖区胴体样品的检测 |
| 2.2.2 ADV和CDV的分离鉴定 |
| 2.2.2.1 细胞培养与ADV分离鉴定 |
| 2.2.2.2 引物设计 |
| 2.2.2.3 病毒组织半数感染量(TCID50)的测定 |
| 2.2.2.4 PCR检测ADV分离株 |
| 2.2.2.5 ADV-VP2全基因的扩增 |
| 2.2.2.6 目的基因的回收纯化 |
| 2.2.2.7 目的片段克隆载体的连接与转化 |
| 2.2.2.8 基因序列测序及分析 |
| 2.2.2.9 细胞培养与CDV分离鉴定 |
| 2.2.2.10 引物设计 |
| 2.2.2.11 PCR检测分离株 |
| 2.2.2.12 CDV-H蛋白基因的扩增 |
| 2.2.2.13 目的基因的回收纯化 |
| 2.2.2.14 目的片段克隆载体的连接与转化 |
| 2.2.2.15 基因序列测序及分析 |
| 2.2.3 ADV分离株感染小鼠安全性分析 |
| 2.3 数据处理 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 三重PCR检测方法的建立及各地区样品的检测 |
| 3.1.1 单一PCR特异性扩增 |
| 3.1.2 三重PCR扩增 |
| 3.1.3 三重PCR灵敏度试验 |
| 3.1.4 山东省6个水貂主要养殖区胴体样品的检测 |
| 3.2 ADV的分离鉴定及感染小鼠安全性分析 |
| 3.2.1 现地ADV感染水貂的临诊主要表现 |
| 3.2.2 ADV分离培养 |
| 3.2.3 ADV-SD分离株的PCR鉴定 |
| 3.2.4 ADV-SD分离株TCID50测定 |
| 3.2.5 病毒VP2基因组PCR扩增 |
| 3.2.6 基因测序及其拼接 |
| 3.2.7 ADV-SD-VP2基因与已报道毒株之间的同源性分析 |
| 3.2.8 ADV-SD-VP2基因进化分析 |
| 3.2.9 CDV的分离培养 |
| 3.2.10 CDV-SD分离株的PCR鉴定 |
| 3.2.11 CDV-SD株H蛋白基因的扩增 |
| 3.2.12 CDV-SD-H基因测序及其拼接 |
| 3.2.13 CDV-SD-H基因与已报道毒株的同源性分析 |
| 3.2.14 CDV-SD-H基因的进化分析 |
| 3.3 ADV感染小鼠的安全性分析 |
| 3.3.1 ADV感染小鼠体重变化 |
| 3.3.2 ADV感染小鼠后各脏器发育指数 |
| 3.3.3 PCR检测小鼠感染ADV |
| 3.3.4 感染ADV小鼠的血常规分析 |
| 3.3.5 H9流感株的抗体效价的检测 |
| 3.3.6 小鼠体内ADV的分离鉴定 |
| 3.3.7 ADV-mouse与参考株的同源性分析 |
| 3.3.8 ADV-mouseVP2分离株的基因进化分析 |
| 4.讨论 |
| 4.1 三重PCR检测方法的建立 |
| 4.2 ADV和CDV的分离鉴定 |
| 4.3 ADV感染小鼠的安全性分析 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间取得的主要学术成果 |
四、HVT国内株的分离鉴定（论文参考文献）
- [1]绵羊捻转血矛线虫耐药性调查及耐IVM候选基因的筛选与分析[D]. 罗晓平. 内蒙古农业大学, 2021
- [2]副猪嗜血杆菌贵州株的分离鉴定及生物学特性研究[D]. 陈娟. 贵州大学, 2020(02)
- [3]2013—2018年广西地区猪伪狂犬病病毒gB、gE与TK基因遗传变异分析[J]. 赵硕,王若木,党佳佳,许力士,秦树英,薛辉,韦祖樟,陈樱,欧阳康,黄伟坚. 畜牧兽医学报, 2020(04)
- [4]杭州地区猫杯状病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析[J]. 周孟云,陈利苹,宋家升,杨倩. 畜牧与兽医, 2020(04)
- [5]鸭源鸡杆菌tolC基因缺失株的构建及生物学特性分析[D]. 刘盼盼. 河南农业大学, 2020(06)
- [6]猪伪狂犬病病毒的分离鉴定和比较基因组学分析[D]. 易可可. 四川农业大学, 2019(01)
- [7]猪伪狂犬病毒HNJY的分离鉴定及其生物学特性分析[D]. 张中华. 河南农业大学, 2019(04)
- [8]PRV变异株GZYY2015的分离鉴定与gE基因缺失转移载体的构建[D]. 咸文. 贵州大学, 2019(09)
- [9]猪伪狂犬病病毒变异毒株的分离鉴定及UL42多克隆抗体的制备[D]. 席瑞. 南京农业大学, 2019(08)
- [10]山东省水貂胴体内ADV、MEV和CDV检测与分离株的变异及ADV对小鼠安全性分析[D]. 逄锦颖. 山东农业大学, 2018(09)